一种大豆疫霉快速鉴定试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及植物病害生物防治领域，尤其涉及一种大豆疫霉快速鉴定试剂盒及其制备方法。

背景技术：

大豆疫霉病菌引起的大豆疫病是大豆生产中的毁灭性病害之一,是我国对外公布的一类植物检疫危险性病原真菌。该病菌以土壤传播为主。目前世界上的主要大豆输出国,如美国、巴西阿根廷等,均有大豆疫病的发生和分布,且在输出的商品大豆中经常夹带-定量的土壤。为防止该病菌传入我国，在进境植物检疫时,需规范并正确掌握大豆疫霉病茵的检疫鉴定方法，现有检测方法是根据大豆疫霉病菌的土壤传播特性,生物学特性形态学特征等特征,确定了检疫检测和鉴定大豆疫霉病茵的各项技术要求，检测原理为：病原真菌是典型的土壤习居菌，主要以抗逆性很强的卵孢子在土壤中和土壤中的寄主残体内越冬并长期生存。当田间温度和湿度适宜时,卵孢子打破休眠萌发产生孢子囊,雨后有积水时，孢子囊很快释放出大量游动孢子,游动孢子被雨水冲溅到寄土表面.或受寄主分泌物的吸引。朝根系游动并最终侵染寄主。有水时,在寄主根部外表形成大量孢子囊,在内部形成大量卵孢子,病原菌的这一特性,先收集土壤并在适宜条件下培养-定时间.使卵孢子萌发产生孢了囊,然后加水浸泡,使孢子囊释放出游动孢子,再加感病大豆品种的叶碟诱集游动孢了,待游动孢了侵染叶碟并在叶碟边缘(偶尔在叶碟表面)产生新的孢子囊并释放出游动孢子时,即可进行病原菌的分离和鉴定，但是此种检测方法较为复杂，耗时较长，观察困难，难以对大豆疫霉实施快速鉴定。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种大豆疫霉快速鉴定试剂盒及其制备方法，以解决上述大豆疫霉检测速度慢的技术问题。

本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：一种大豆疫霉快速鉴定试剂盒及其制备方法，试剂盒内成分包括没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素，均能够与大豆疫霉产生橘红色物质，且儿茶素、没食子儿茶素和表儿茶素之间的占比为3.8-4.5％、12.0-15.5％和80-84.2％。

所述试剂盒制备包括如下步骤：

(1)在培养基中加入多酚物质，可以与大豆疫霉代谢物形成橘红色物质，而与其他疫霉不能形成该橘红色物质；

(2)从七种茶多酚表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、没食子儿茶素(gc)、表没食子儿茶素(egc)、儿茶素(c)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)、表儿茶素(ec)和没食子酸乙酯(eg)中，选择出没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素进行颜色色度实验。

(3)以数学模型优化组合三者配比，添加到培养基中得到颜色鲜亮的易于识别的橘红色沉淀物，利用design-expert7.0对试验数据进行分析处理得到没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素的最优配比；

(4)按照最优配比将混合试剂加到培养基中配制，灭菌、无菌倒小平板之后放于无菌容器中，即得到快速鉴定试剂盒。

利用design-expert7.0对试验数据进行分析处理所用回归方程为：y＝90.6-0.25a+3.25b-0.75c-0.25ab-2.25ac+3.75bc-3.42a²-3.92b²-5.43c²。

本发明的有益效果是：

通过实验发现几种多酚物质能够与大豆疫霉代谢物发生反应从而能够生成橘红色沉淀，通过对比的方式将七种多酚物质中的只与大豆疫霉的代谢物发生反应的没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素筛选出来，使用design-expert7.0对实验数据分析得到是那种多酚物质的最优配比，将按照比例配制的混合物置于无菌容器内，可得到能够与大豆疫霉代写产物反应产生橘红色沉淀的鉴定试剂，鉴定速度快、鉴定结果可由肉眼直接观测、鉴定效果准确，可在快速鉴定大豆疫霉，从而避免疫霉传播扩散，对于防治大豆疫霉扩散起到极大的作用。

附图说明

图1是本发明添加多酚物质的培养基效果图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

如图1所示，一种大豆疫霉快速鉴定试剂盒及其制备方法，试剂盒内成分包括没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素，均能够与大豆疫霉产生橘红色物质，且儿茶素、没食子儿茶素和表儿茶素之间的占比为4.5％、15.5％和80％，添加浓度为2mmol/l,图1中最右侧为该条件下大豆疫霉培养结果，产生的红色物质颜色最深。

所述试剂盒制备包括如下步骤：

如表1所示，在培养基中加入多酚物质，可以与大豆疫霉代谢物形成橘红色物质，而与其他疫霉及常见大豆病害病原物均不能形成该橘红色物质；

表1

表1中，“+”代表有橘红色物质形成，“-”代表没有颜色；“+”越多代表颜色越深越明显，容易识别。

如表2所示，从七种茶多酚表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素和没食子酸乙酯中，选择出没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素进行颜色色度实验。

表2

以0-50％的辣椒红色素为基准颜色对比打分，得分结果乘以2倍为颜色色度，优化组合三者配比，表2中“+1、-1和0”分别代表多酚物质的三个水平的浓度；其中()内的数字分别代表多酚物质实验中多酚的比例。

结合上述表2中的实验结果，以数学模型优化组合三者配比，添加到培养基中得到颜色鲜亮的易于识别的橘红色沉淀物，利用design-expert7.0对试验数据进行分析处理得到没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素的最优配比，最终得到没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素最优组成比例为3.8-4.5％、12.0-15.5％和80-84.2％；

按照最优配比将混合试剂加到培养基中配制，灭菌、无菌倒小平板之后放于无菌容器中，即得到快速鉴定试剂盒。

利用design-expert7.0对试验数据进行分析处理所用回归方程为：

y＝90.6-0.25a+3.25b-0.75c-0.25ab-2.25ac+3.75bc-3.42a²-3.92b²-5.43c²，其中a、b、c、y分别是儿茶素，没食子儿茶素、表儿茶素和颜色色度。

经过上述步骤可能够与大豆疫霉代谢物反应生成橘红色沉淀物质的检测试剂盒，从而判断豆疫霉是否存在，经过提前的制备可随时用于大豆疫霉的检测，检测速度快，检测结果明显，便于观察。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。