一种番茄红素β-环化酶基因及其编码蛋白和应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种条斑紫菜番茄红素β-环化酶pylcyb蛋白及其编码基因在紫菜类胡萝卜素代谢中的应用。

背景技术：

紫菜是世界上重要的栽培海藻之一，主要产于中国、日本和韩国，据统计，2010-2011年度三个国家紫菜总产值约88亿元(blouinetal.2011)。紫菜产业已成为沿海地区经济创收、出口创汇的重要支柱产业，也是吸引、转移传统捕捞行业从业人员最多的产业，对沿海地区渔民增收、经济发展和社会稳定起着不可或缺的作用。不仅如此，紫菜还是研究植物生理、生化以及早期进化的理想材料(waalandetal.2004；linetal.2009；suetal.2010)。

紫菜生长在潮间带，必须耐受由潮汐带来的日周期性的极端逆境(如高光、高盐、失水等)，长期的进化过程使其产生了在逆境下对光合系统的保护机制。失水、高光和低温等逆境的最终特征都是在植物细胞内产生活性氧质(ros，reactiveoxygenspecies)，对生物造成损伤(jitheshetal.2006)。研究表明，环化类胡萝卜素(cycliccarotenoids)是高等植物防御ros损伤的第一道防线。研究表明，有氧光合生物中合成环化类胡萝卜素受阻可能是致死的，表明了类胡萝卜素在植物应对环境变化中的重要作用(brittonetal.1979)。

类胡萝卜素(carotenoids)在植物体内通常积累在花、果实和根部，鲜艳的颜色可以吸引昆虫或动物作为传粉或者散播种子的媒介。此外，类胡萝卜素作为维生素a的前体，对人类和动物有很大的营养价值(cuninghamandgantt1998；shumskayaandwurtzel2013)。而类胡萝卜素中的叶黄素(lutein)和玉米黄素(zeaxanthin)存在于人类和动物眼中的黄斑区域，对人类视觉感受光线变化有十分重要的作用(handelmanetal.1998)。根据其结构特征，类胡萝卜素可以分为线性类胡萝卜素和环化类胡萝卜素两大类。针对高等植物的研究表明，类胡萝卜素的代谢起始于八氢番茄红素(phytoene)的合成，经过相关代谢酶的一系列脱氢和异构，形成线性的全反式番茄红素(lycopene)。以番茄红素为底物，番茄红素环化酶(lycopenecyclase)负责类胡萝卜素的环化，并且不同的环化酶在线性的番茄红素两端产生不同的环，从而在类胡萝卜素代谢途径中首次出现代谢分支。番茄红素β-环化酶可以在线性的番茄红素两个末端催化形成两个β-环，生成β-胡萝卜素(β-carotene)。经过番茄红素β-环化酶和番茄红素ε-环化酶的依次作用，分别在线性番茄红素的末端形成一个β-环和一个ε-环，生成α-胡萝卜素(α-carotene)。在少数植物种类中(如莴苣、生菜)，其番茄红素ε-环化酶具有可以在线性番茄红素每个末端形成一个ε-环，生成ε-胡萝卜素(ε-carotene)。研究表明，α-和β-类胡萝卜素同时参与植物的逆境适应，并且在应对环境变化中有着截然不同却又相互补充的作用(dall'ostoetal.2007)。因此，精确调控α-/β-类胡萝卜素的比例是植物应对不断变化环境重要适应性反应(krauseetal.2004)。因此，在类胡萝卜素的代谢中，不同番茄红素环化酶的功能活性及其表达的变化可以控制类胡萝卜素代谢流向不同分支的分配，从而使植物适应不同的环境胁迫。

申请者前期的研究表明，紫菜中可以代谢产生并积累两类环化类胡萝卜素：α-类胡萝卜素(α-caroteniods)和β-类胡萝卜素(β-carotenoids)，具体来说，主要包括α-胡萝卜素、叶黄素(lutein)、β-胡萝卜素和玉米黄素(zeaxanthin)及几种微量的代谢中间产物(yangetal.2014)。然而，目前紫菜类胡萝卜素代谢途径的相关研究还比较少，仅有申请者对脐形紫菜中胡萝卜素羟化酶(puchy1)和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(puggps)的报道，尚未有任何关于番茄红素β-环化酶的报道。对以条斑紫菜为代表的紫菜物种中pylcyb的发现和功能鉴定有利于未来利用基因工程技术提高紫菜中类胡萝卜素等营养成分的含量来提高紫菜的营养价值，并且通过提高萜类物质的含量改善紫菜的口感和风味，从而整体上提高紫菜的经济价值。

技术实现要素：

本发明提供了一种番茄红素β-环化酶基因及其编码蛋白和应用，该基因转录组编码番茄红素β-环化酶，从而使紫菜中能够合成并积累玉米黄素、花药黄素等类胡萝卜素。

本发明的一种番茄红素β-环化酶基因，它的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示。

本发明的一种番茄红素β-环化酶基因，它的核苷酸序列为与序列表seqidno:1核苷酸序列具有80％以上同源性且编码相同功能蛋白质的多核苷酸序列。

本发明的一种番茄红素β-环化酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示。

本发明的一种番茄红素β-环化酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列为由序列表seqidno：2所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与序列表seqidno：2所述的氨基酸残基序列相同活性的氨基酸序列。

本发明的番茄红素β-环化酶基因来源于条斑紫菜(pyropiayezoensis)，名称为pylcyb，以下该基因简称为pylcyb。

所述的番茄红素β-环化酶来源条斑紫菜。

一种重组表达载体，它包括权利要求1或2所述的基因。

一种转化子，它包括含有权利要求6所述的重组表达载体的宿主细胞。

所述的一种转化子，它的宿主为微生物、植物或转基因细胞系。

本发明的一种番茄红素β-环化酶基因的应用，它用于紫菜类胡萝卜素代谢基因工程中。

本发明的番茄红素β-环化酶基因(pylcyb)获取方式为：

一、总rna的提取

选取条斑紫菜(pyropiayezoensis)(来自江苏省海洋水产研究所国家级紫菜种质库)，采用rnaiso试剂盒(takara公司)提取得到条斑紫菜总rna，经电泳检测和紫外分光光度计检测确认rna的完整性、纯度以及浓度后，于-80℃保存；

二、条斑紫菜番茄红素β-环化酶基因(pylcyb)的克隆

用1μg步骤一获得的总rna作为反转录的模板，按照smarterracecdnakit(clontech)的说明书操作，使用ssrt-ii反转录酶，经反转录合成cdna第一链后，用touchdownpcr程序进行巢式pcr扩增，以获得pylcyborf全长。其中

5'-race所用引物如下：

pylcy1-er1：cgtagaggcgggtgtcgtcatcggcagtgg

pylcy1-er2：gggcggaagaagaagcggcgggcgacg

3'-race所用引物如下：

pylcy1-hf1：tgggcagagttcctctctttccgtctgct

pylcy1-hf2：tgttgccgctgtacccggtggaggtgccac

将pcr产物连接至pmd19-t(takara公司)载体，测序后经拼接获得具有完整编码区的条斑紫菜番茄红素β-环化酶基因pylcyb的orf序列seqidno：1。

三、大肠杆菌表达载体的构建

用targetp和chlorop等软件推测pylcyb蛋白中信号肽的位点，然后用带有ecori酶切位点的引物扩增pylcyb截除信号肽后部分序列并克隆至pmal-c5x载体。

带有ecori酶切位点的引物序列如下：

pylcy1-pmal-hf：

ccgcgatatcgtcgacggatccagtgcggcggtcgcggcgcagcg

pylcy1-pmal-hf：

tacctgcagggaattcggatcctcactccgtctccgccggcagcg

其中，小写字母代表的同源臂序列，大写字母是作为引物的基因序列，下划线部分为引入的酶切位点。

四、酶活鉴定

将步骤三获得的表达载体pmal-pylcyb与携带有一系列噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因crte(ggps)、crtb(psy)和crti(pds/zds)的载体pac-lyc共转入大肠杆菌。载体pac-lyc上携带的基因在有活性番茄红素β-环化酶的情况下，可以使大肠杆菌的细胞积累β-胡萝卜素，从而使大肠杆菌菌落或菌液呈橙黄色；若没有活性番茄红素β-环化酶，大肠杆菌为橙红色。空载体pmal-c5x与pac-lyc共转作为负对照。hplc分析各个样品的产物。

本发明的pylcyb基因来源于脐形紫菜，其基因工程受体植物适用于水稻等生物。

利用本法发明的pylcyb基因作为目的基因构建植物表达载体，可以利用花椰菜花叶病毒camv35s启动子、乙醇诱导启动子等，必要时可以包括增强子。为了简化转化植株的鉴定，可使用选择性标记(如抗生素酶)。所用的表达载体可使用ti质粒、ri质粒以及植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法或其他方法转化植物。

本发明首次发现紫菜属物种里参与类胡萝卜素合成代谢途径里的一个酶即番茄红素β-环化酶，并证实该酶参与紫菜中类胡萝卜素的代谢。

本发明获得编码该酶的基因序列，为利用基因工程技术改进紫菜里类胡萝卜素代谢途径，以提高紫菜里类胡萝卜素和萜类物质的含量提供了基础。

通过本发明提供的pylcyb基因和蛋白，对紫菜属物种进行基因工程改进，其产业价值着重于两个方面，一是通过提高紫菜中类胡萝卜素的含量从而提高紫菜的营养价值，从而提高紫菜的经济价值。

附图说明

图1为pylcyb的核苷酸和推定氨基酸序列；其中，“*”代表终止密码子；

图2为不同物种番茄红素环化酶蛋白序列的多序列比对，标记区域为保守的罗斯曼折叠(1),两个环化酶结构域(2,3),两个跨膜螺旋结构域(4,6)和带点结构域(5)，方框内区域只存在于红藻番茄红素环化酶序列中；

图3为pylcyb在大肠杆菌中实验的hplc分析图；其中，a：不同类胡萝卜素的吸收光谱；b：pmal-c5x和pac-lyc共转进大肠杆菌作为负对照；c：pmal-pylcyb和pac-lyc共转进大肠杆菌；

图4为不同物种中番茄红素环化酶的系统发生分析图。

具体实施方式

本发明内容不仅限于上述各实施例的内容，含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属本发明的保护范围。

实施例1

本实施例的pylcyb的基因获得过程如下：

1)条斑紫菜pylcyb转录本鉴定和编码区克隆

用拟南芥中编码lcyb基因的开放阅读框(orf)，搜索条斑紫菜基因组中的同源序列，搜索方法为tblastx，截取e-value值为1×10^-10已筛选可能的同源序列，只发现一个转录本contig_10139。根据该转录本基因序列设计race引物扩增pylcyb的orf(图1所示)。

选用rnaiso试剂(takara公司)提取条斑紫菜叶状体总rna，经电泳检测和紫外分光光度计检测确认rna的完整性、纯度以及浓度，于-80℃保存。用1μg总rna作为反转录的模板，经反转录合成cdna第一链后，进行pcr扩增，反应结束后将pcr产物连接至pmal-c5x载体，该基因全长1872bp，共编码含有623个氨基酸残基的蛋白序列和一个终止密码子，经分析，在该蛋白的n端有一段叶绿体定位的信号肽。将所推测的蛋白序列与其他物种中的同源番茄红素环化酶多序列对比(图2所示)，说明所获得的pylcyb与其他物种中的番茄红素环化酶同源。

2)条斑紫菜pylcyb表达载体的构建

用1μg步骤1)获得的总rna作为反转录模板，使用takara公司的“primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit”试剂盒反转合成cdna第一链。

根据race获得的pylcyb的全长编码序列，用chlorop和targetp推测其编码蛋白的信号肽序列，设计两端引物并引入ecori限制性内切酶位点，扩增pylcyb截除信号肽后的部分序列(引物由genscript公司合成)。

用1μg步骤2)获得的总rna作为反转录的模板，经反转录合成cdna第一链后，进行pcr扩增，pcr程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，67℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min。反应结束后将pcr产物连接至pmal-c5x载体，连接产物转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞后筛选阳性克隆，得到携带pylcyb的重组载体，命名为pmal-pylcyb。

3)pylcyb的异源表达和功能鉴定

用步骤2)构建好的含有pylcyb的载体转化入大肠杆菌bl21(de3)细胞中，在含有羧苄霉素(50μg·ml^-1)的lb-agar培养基上培养过夜筛选，挑单菌落转入含有相同浓度羧苄霉素的lb液体培养基上37℃，200rpm振荡培养至od600为0.4～0.6，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg，0.5mmol·l^-1)诱导表达3～4h。表达的蛋白经sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(page，10％)分析。

实施例2

pylcyb的功能验证如下：

为了鉴定pylcyb的功能，我们采用的是大肠杆菌体内酶活鉴定系统，用颜色互补的方法结合hplc分析酶的活性。该系统用到质粒pac-lyc，该质粒携带噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(crte，ggps)、八氢番茄红素合酶(crtb，psy)、八氢番茄红素去饱和酶(crti，pds/zds)，可以在大肠杆菌细胞里积累番茄红素(橙红色)，作为番茄红素环化酶的底物。在有番茄红素β-环化酶的情况下可以在大肠杆菌细胞中合成并积累β-胡萝卜素，使大肠杆菌呈现橙黄色；而没有β-番茄红素环化酶的情况下大肠杆菌仍然是橙红色，可以很容易分辨是否有番茄红素β-环化酶活存在。

4)将可以正常表达的pmal-pylcyb与pac-lyc用热激法共转进大肠杆菌bl21(de3)菌株里。以空载体pmal-c5x与pac-lyc共转作为负对照。共转的菌株在含氯霉素(50μg·ml^-1)和羧苄霉素(50μg·ml^-1)的lb培养基中培养。挑选黄色菌落接种至5ml带有氯霉素和羧苄青霉素的液体lb培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜，取200μl接种至20ml抗性lb培养基中200rpm振荡培养3d，离心收集菌体，发现在含有条斑紫菜pylcyb的样品中，大肠杆菌的颜色都呈橙黄色，而含有空载体pmal-c5x的负对照大肠杆菌呈橙红色，说明pylcyb具有催化番茄红素β-环化的活性，从而使大肠杆菌细胞积累β-胡萝卜素。

5)色素提取及hplc分析

将含有双载体pac-lyc和pmal-c5x/pmal-pylcyb的大肠杆菌菌体经10,000g离心1min收集后超声破碎。向超声破碎的材料中加入400μl80％的丙酮，剧烈振荡30min以彻底提取材料中所含色素，然后依次加入250μl乙酸乙酯和ddh2o，分别剧烈振荡15sec，静置5min后，10,000g、4℃离心5min。吸取上清，用氮气吹干后溶于100μl乙酸乙酯。所提取的色素用反相高效液相色谱(reverse-phasehplc)方法，在spherisorbods2c18色谱柱(waters)上分离，色谱柱为4.6×250mm，流动相为在乙腈:水:三乙胺(9:1:0.01)中线性展开乙酸乙酯(0-100％)。展开时间为45min，流速为1ml·min^-1，柱温50℃。检测器扫描波长为300～800nm。选择296nm和440nm的扫描结果。类胡萝卜素的鉴定根据标准品或已报道的保留时间和吸收谱来确定。所有的化学试剂均为色谱纯。分析结构表明样品中积累了β-胡萝卜素，而负对照中没有β-胡萝卜素的积累(图3)，进一步证明了pylcyb可以催化番茄红素的β-环化生成β-胡萝卜素。

6)系统学分析

为了确定所克隆基因pylcyb所属的类型，我们检索了genbank里pylcyb的同源序列，并根据前人报道取不同植物的番茄红素环化酶序列并对其进行系统发生分析。所有序列用clustalx比对，用mega5.1(tamuraetal.,2011)中的邻接法构建系统树。自举检验重复1,000次用于分析每个节点的可靠性。分析结果显示pylcyb确实属于植物中的番茄红素β-环化酶(图4所示)。

序列表

<110>南京大学

<120>一种番茄红素β-环化酶基因及其编码蛋白和应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1872

<212>dna

<213>条斑紫菜(pyropiayezoensis)

<400>1

atggcggcgtttgtaccggcggcgccggcgacggctggcccgcggccgctcgggcggtcg60

gtcggcgcattgggggtcgcgcccgcggtttggccgctgtctaccagactccgcggtcgc120

agtgcggcggtcgcggcgcagcggctggggcagcggccgccgcgcggcgcgcccgcgacg180

cggatggtgacgacgcccgcagcggccgggtcgactgccgcggcggcagcgtcgtcgtcg240

cccgccgcttcttcttccgccccttcgatggcctctgtggcggccgctgcgacggcgacg300

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tctcgcccgcggctggtcgggccccttcggtctgcccgtggggcggtcgtcgcggacgcc840

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agcgcagccgagcgcaccgagtccaccgccgtcccgaccttcctgtatgccatgcccacg1080

gctcccaaccgcgttttctttgaggagacctccctcatcgcctcccccgcggtgccattt1140

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gtgctcgacgaggaatactgtctcatccctatgggcgggccactgccggcccggcggcag1260

cgggttgttgcgtttggcggcgctgccgcgctcgtccaccccgcgacgggctacatggtt1320

gcccgcgcgctcgagttggccgacgaggccgcggggctgattgcggggcagctggcggcg1380

gccaaggccaccgctgtagaggcggccgcggccgccggttgtgcagtgagtggccctgca1440

tccacgccgacgcctttgtcaggccagcagggtgccccggagttggaagtagatgcggac1500

gcggtagcggcgggcgtgtgggatgcgctgtggagcattggccggcggcgacagcgtgac1560

tttttcaactttggcggcgagtacctgcggcggttggacctgctcacgctccgcgatttc1620

ttctccgcgtttttccgcctgccccgccagcagtgggcagagttcctctctttccgtctg1680

ctgcggccgggtgagcgcctggcgtttggtttgggcgtctttttccggacgagcaaccgg1740

gtgcgggcgacgatcacaccatttggggcgtttcacgggcggggcaagctgctaatgagc1800

ctgttgccgctgtacccggtggaggtgccaccaccggtcaaactgccaccgctgccggcg1860

gagacggagtga1872

<210>2

<211>623

<212>prt

<213>条斑紫菜(pyropiayezoensis)

<400>2

metalaalaphevalproalaalaproalathralaglyproargpro

151015

leuglyargservalglyalaleuglyvalalaproalavaltrppro

202530

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354045

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505560

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245250255

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275280285

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290295300

glnargglypheglnalaalatyrglyileglualagluvalgluser

305310315320

hisprotyralaproglyargmetvalleumetasptyrargaspasp

325330335

hismetglnglyseralaalagluargthrgluserthralavalpro

340345350

thrpheleutyralametprothralaproasnargvalphepheglu

355360365

gluthrserleuilealaserproalavalpropheaspaspleulys

370375380

argargleuhisalaargleualahisaspglyilethrvalthrarg

385390395400

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405410415

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glualaalaglyleuilealaglyglnleualaalaalalysalathr

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alavalglualaalaalaalaalaglycysalavalserglyproala

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485490495

valaspalaaspalavalalaalaglyvaltrpaspalaleutrpser

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leuargargleuaspleuleuthrleuargaspphepheseralaphe

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pheargleuproargglnglntrpalaglupheleuserpheargleu

545550555560

leuargproglygluargleualapheglyleuglyvalphephearg

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thrserasnargvalargalathrilethrpropheglyalaphehis

580585590

glyargglylysleuleumetserleuleuproleutyrprovalglu

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610615620

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgtagaggcgggtgtcgtcatcggcagtgg30

<210>4

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<400>7

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<210>8

<211>45

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tacctgcagggaattcggatcctcactccgtctccgccggcagcg45