一株用于降解黄曲霉毒素B1的暹罗芽孢杆菌WF2019菌株及其应用的制作方法

本发明属于黄曲霉毒素脱毒技术领域。更具体地，涉及一株用于降解黄曲霉毒素b1的暹罗芽孢杆菌wf2019菌株及其应用。

背景技术：

黄曲霉毒素b1(afb1)主要是由寄生曲霉和黄曲霉产生的真菌毒素，是目前毒性、致畸和致癌作用最强的真菌毒素。目前，afb1污染广泛存在于各种农产品中，如粮食作物、食品、饲料等，造成了巨大的经济损失，也严重威胁人类和畜禽的健康。在我国，afb1污染十分严重，2015年1月到2019年4月期间，我国报道发生的食品真菌毒素超标事件达646起，其中afb1超标事件占71％；我国出口欧盟食品和饲料违例事件中真菌毒素占29.04％，其中afb1超标事件占97.53％。由此可见，寻求有效防控真菌毒素污染与脱毒措施刻不容缓。

许多物理、化学和生物方法已被用于afb1脱毒。一般来讲，物理和化学方法如高压烘烤、辐射、吸附剂、碱处理、酸处理、氧化还原剂、臭氧和光解离等虽能降低农产品中afb1的含量，但存在如可能形成潜在的有毒物质、改变农产品本身的营养价值及风味，或需配备精密的仪器、成本高、污染环境等诸多问题，不符合fao标准要求而不被认为是理想的afb1脱毒方式。而利用微生物细胞、其酶系或其代谢产物的生物法，因安全、易获得、环境友好、效率高、特异性强和成本低等优点，被科学家们认为是最有前景的afb1高效脱毒方式。

已报道有60余株细菌和20余株真菌具有afb1脱毒能力，微生物种类不同，脱毒效率明显不同，且除少数已报道的微生物或其酶系能在高温下降解afb1外，大部分微生物或其酶系不耐高温，这严重阻碍了其工业化应用；例如，现有专利cn109161497a公开了一种用于降解黄曲霉毒素的暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)a2025，其上清液对黄曲霉毒素b1的降解率达到90％以上。现有专利cn109161500a公开了一种用于降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的暹罗芽孢杆菌(b.siamensis)zj-2018-1，其发酵液对黄曲霉毒素b1的降解率达88％以上。但是，以上2种暹罗芽孢杆菌菌株a2025和zj-2018-1都只对低浓度(≤4μg/ml)的afb1有较高的降解率，且降解反应温度为37℃。

目前，还未见有任何具有耐高温性能的暹罗芽孢杆菌(b.siamensis)降解黄曲霉毒素的报道，这不利于暹罗芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的生物制剂的全产业链的应用，且降低了其商业化价值。因此，需要继续寻找降解效果显著且耐高温的用于黄曲霉毒素降解的微生物菌株。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有降解黄曲霉毒素的微生物菌株不耐高温且降解效果不显著的缺陷和不足，提供一株用于降解黄曲霉毒素b1的暹罗芽孢杆菌wf2019菌株及其应用。

本发明第一个目的是提供一株用于降解黄曲霉毒素b1的暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)wf2019。

本发明第二个目的是提供所述暹罗芽孢杆菌wf2019在制备黄曲霉毒素b1脱毒制剂方面的应用。

本发明第三个目的是提供所述暹罗芽孢杆菌wf2019在构建黄曲霉毒素b1脱毒工程菌方面的应用。

本发明第四个目的是提供一种黄曲霉毒素b1脱毒制剂。

本发明第五个目的是提供一种黄曲霉毒素b1脱毒工程菌。

本发明第六个目的是提供所述暹罗芽孢杆菌wf2019、所述脱毒制剂或所述脱毒工程菌在降解黄曲霉毒素b1方面的应用。

本发明第七个目的是提供所述暹罗芽孢杆菌wf2019、所述脱毒制剂或所述脱毒工程菌在饲料加工或食品加工领域中黄曲霉毒素b1的脱毒方面的应用。

本发明第八个目的是提供所述暹罗芽孢杆菌wf2019的发酵液或胞内物在降解黄曲霉毒素b1方面的应用。

本发明第九个目的是提供一种降解黄曲霉毒素b1的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明经过长期的筛选和分离，首次成功分离得到了一株用于降解黄曲霉毒素b1的暹罗芽孢杆菌wf2019，该菌株可高效的降解黄曲霉毒素b1，且具有显著的耐高温性能，同时该菌株的发酵液或胞内物也能够降解黄曲霉毒素b1，可应用于黄曲霉毒素b1污染的农产品的脱毒；该菌株已于2019年6月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmccno：60700，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明提供的暹罗芽孢杆菌wf2019是首次分离出的一种新的菌株，其实际应用将对黄曲霉毒素b1污染的农产品的脱毒提供重要的技术与资源支撑。

所述暹罗芽孢杆菌wf2019在30℃培养96h后，对afb1的降解率高达97.7％；对浓度为1μg/ml的afb1的降解率高达98.9％，且对高浓度(≥4μg/ml)的afb1依然有很好的降解效果；当ph为7、培养温度为37℃时，暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1的降解率高达97.7％；且在高温(培养温度≥50℃)下，对afb1依然有很好的降解效果；同时，暹罗芽孢杆菌wf2019的发酵液和胞内物对afb1仍然有很好的降解性能；且暹罗芽孢杆菌wf2019可以高效地降解花生中的afb1，对花生中afb1的降解率高达83.5％；是理想的农产品脱毒微生物，具有十分广泛的应用前景。

因此，以下均应在本发明的保护范围之内：

所述暹罗芽孢杆菌wf2019在制备黄曲霉毒素b1脱毒制剂方面的应用。

所述暹罗芽孢杆菌wf2019在构建黄曲霉毒素b1脱毒工程菌方面的应用。

一种黄曲霉毒素b1脱毒制剂，包含所述暹罗芽孢杆菌wf2019。

一种黄曲霉毒素b1脱毒工程菌，由所述暹罗芽孢杆菌wf2019构建得到。

所述暹罗芽孢杆菌wf2019、所述脱毒制剂或所述脱毒工程菌在降解黄曲霉毒素b1方面的应用。

所述暹罗芽孢杆菌wf2019、所述脱毒制剂或所述脱毒工程菌在饲料加工或食品加工领域中黄曲霉毒素b1的脱毒方面的应用。

所述暹罗芽孢杆菌wf2019的发酵液或胞内物在降解黄曲霉毒素b1方面的应用。

另外，本发明还提供了一种降解黄曲霉毒素b1的方法，用所述暹罗芽孢杆菌wf2019、其发酵液或其胞内物处理黄曲霉毒素b1污染的农产品。

优选地，所述处理的温度为30℃～60℃。

更优选地，所述处理的温度为35℃～50℃。

更进一步优选地，所述处理的温度为37℃。

优选地，所述处理的时间为24～96h。

更优选地，所述处理的时间为72～96h。

更进一步优选地，所述处理的时间为96h。

优选地，所述处理时的ph为4～9。

更优选地，所述处理时的ph为7。

优选地，所述暹罗芽孢杆菌wf2019的浓度为1～8μg/ml。

更优选地，所述暹罗芽孢杆菌wf2019的浓度为1～4μg/ml。

另外，利用所述暹罗芽孢杆菌wf2019及其相关生物制剂对黄曲霉毒素b1污染的农产品脱毒时，暹罗芽孢杆菌wf2019的用量可根据实际情况进行调整。

因此，所述暹罗芽孢杆菌wf2019对降解环境的温度、ph均具有较好的耐受能力，具有良好的环境适应性，适用范围广，是理想的农产品脱毒微生物。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株用于降解黄曲霉毒素b1的暹罗芽孢杆菌wf2019菌株及其应用。本发明成功分离得到了一株可高效降解黄曲霉毒素b1的菌株，经形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定，该菌株为暹罗芽孢杆菌wf2019。

该菌株可高效的降解黄曲霉毒素b1，降解率高达98.9％；具有良好的环境适应性和显著的耐高温性能，在60℃时仍具有显著的降解性能，有利于降解黄曲霉毒素的生物制剂的全产业链的应用；同时该菌株的发酵液或胞内物也能够降解黄曲霉毒素b1，可应用于黄曲霉毒素b1污染的农产品的脱毒；另外，该菌株在使用过程中无污染、无公害。因此，该菌株是理想的农产品脱毒微生物，在饲料加工或食品加工领域中具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1是单克隆菌株经初筛后，用afb1复筛的液相图谱。

图2是单克隆菌株在lb培养基上的菌落形态图。

图3是单克隆菌株的16srdna序列构建得到的系统发育树结果图。

图4是暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1的降解性能结果图。

图5是暹罗芽孢杆菌wf2019对不同浓度的afb1的降解性能结果图。

图6是不同ph对暹罗芽孢杆菌wf2019降解afb1的影响结果图。

图7是不同培养温度对暹罗芽孢杆菌wf2019降解afb1的影响结果图。

图8是暹罗芽孢杆菌wf2019的发酵液和胞内物降解afb1的性能结果图；其中，“culturesupernatant”代表发酵液；“intracellularextracts”代表胞内物。

图9是暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1污染的花生脱毒的性能结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中，afb1浓度的检测方法为：将各个样品10000r/min离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法检测afb1的浓度。检测条件：色谱柱为c18色谱柱(250mm×4.6mm)，流动相为水：甲醇＝1：1，检测波长360nm，进样量10ul，流速0.8ml/min。

afb1降解率的计算公式为：afb1降解率(％)＝(对照组含量-实验组含量)/对照组含量×100％。

培养基为常用的营养肉汤培养基。

实施例1暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)wf2019的分离与鉴定

一、菌株分离与筛选

首先，进行菌株的初筛，用90ml无菌生理盐水稀释1g发酵食品，梯度稀释，将稀释液在以香豆素为唯一碳源的固体培养基中涂布，37℃培养，分离、纯化平板菌落，并将其在以香豆素为唯一碳源的液体培养基中培养，获得能够降解afb1的疑似菌株。

然后，进行菌株的复筛，将该疑似菌株于10ml离心管中，加入2ml营养肉汤，37℃、160r/min培养24h，得到发酵液；取200μl发酵液与afb1(终浓度为2μg/ml)于37℃、160r/min继续培养72h，以不接菌株的营养肉汤加afb1作为空白对照；培养结束后，用hplc检测afb1浓度的变化。发现该疑似菌株能够高效降解afb1，再挑选该疑似菌株的单菌落进行重复划线，直到获得纯化后的单克隆菌株。

单克隆菌株经初筛后，用afb1复筛的液相图谱如图1所示，可以看出，afb1经过72h培养后，afb1浓度极显著下降；因此，该单克隆菌株降解afb1的效果显著。

二、单克隆菌株的形态学和生理生化特征鉴定

1、实验方法

(1)用革兰氏染色试剂盒对上述得到的单克隆菌株进行革兰氏染色，鉴定该菌株为革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌；

(2)观察单克隆菌株在lb培养基上的菌落形态。

2、实验结果

经革兰氏染色试剂盒鉴定，该菌株为革兰氏阳性；单克隆菌株在lb培养基上的菌落形态图如图2所示，可以看出，菌落形态为圆形，呈白色，表面无光泽，质地粘稠，菌株的细胞呈杆状，有芽孢。

三、单克隆菌株的分子生物学鉴定

1、实验方法

应用通用引物16s-27f/16s-1492r扩增上述得到的单克隆菌株的16srdna基因，并应有常规方法进行测序。

2、实验结果

单克隆菌株的16srdna序列如seqidno：1所示，全长约1500bp，将其16srdna序列进行同源性比对，构建得到的菌株的系统发育树结果图如图3所示。然后，综合菌株的形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，判断该菌株属于暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)，命名为暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)wf2019，并于2019年6月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmccno：60700，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1的降解性能实验

1、实验方法

取暹罗芽孢杆菌wf2019于10ml试管中，加入5ml培养基，30℃、200r/min培养20h；取100～300μl菌液于新的5ml培养基中，使得od600＝0.02～0.05，加入afb1，使得afb1终浓度为2μg/ml，于30℃、200r/min继续培养24h、48h、72h、96h，空白对照为无菌的培养基加afb1，终浓度为2μg/ml；培养结束后，用hplc检测afb1浓度的变化。

2、实验结果

暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1的降解性能结果如图4所示，可以看出，培养96h时，暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1的降解性能最好，降解率高达97.7％。

实施例3暹罗芽孢杆菌wf2019对不同浓度的afb1的降解性能实验

1、实验方法

取暹罗芽孢杆菌wf2019于10ml试管中，加入5ml培养基，30℃、200r/min培养20h；取100～300μl菌液于新的5ml培养基中，使得od600＝0.02～0.05；加入不同浓度的afb1，使得终浓度分别为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml，于30℃、200r/min继续培养24h、48h、72h、96h，空白对照为无菌的培养基加afb1，终浓度分别为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml；培养结束后，用hplc检测afb1浓度的变化。

2、实验结果

暹罗芽孢杆菌wf2019对不同浓度的afb1的降解性能结果如图5所示，可以看出，培养96h时，暹罗芽孢杆菌wf2019对不同浓度的afb1的降解性能最好；其中，对浓度为1μg/ml的afb1的降解率高达98.9％；对高浓度(≥4μg/ml)的afb1依然有很好的降解效果，对浓度为4μg/ml的afb1的降解率高达98.2％，对浓度为8μg/ml的afb1的降解率高达87.7％。

实施例4不同ph对暹罗芽孢杆菌wf2019降解afb1的影响实验

1、实验方法

取暹罗芽孢杆菌wf2019于10ml试管中，加入5ml培养基，30℃、200r/min培养20h；取100～300ul菌液于新的ph值分别为4、7、9的5ml培养基中，使得od600＝0.02～0.05；加入afb1，使得afb1终浓度为2μg/ml，于30℃、200r/min继续培养96h，空白对照为无菌的培养基加afb1，终浓度为2μg/ml；培养结束后，用hplc检测afb1浓度的变化。

2、实验结果

不同ph对暹罗芽孢杆菌wf2019降解afb1的影响结果如图6所示，可以看出，当ph为4～9时，暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1均有较好的降解性能；其中，当ph为7时，暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1的降解性能最好，降解率高达97.7％。

实施例5不同培养温度对暹罗芽孢杆菌wf2019降解afb1的影响实验

1、实验方法

取暹罗芽孢杆菌wf2019于10ml试管中，加入5ml培养基，30℃、200r/min培养20h；取100～300ul菌液于新的5ml培养基中，使得od600＝0.02～0.05；加入afb1，使得afb1终浓度为2μg/ml，分别于30℃、37℃、40℃、50℃、60℃，200r/min继续培养96h，空白对照为无菌的培养基加afb1，终浓度为2μg/ml；培养结束后，用hplc检测afb1浓度的变化。

2、实验结果

不同培养温度对暹罗芽孢杆菌wf2019降解afb1的影响结果如图7所示，可以看出，当培养温度为30℃～60℃时，暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1均有较好的降解性能；其中，当培养温度为37℃时，暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1的降解性能最好，降解率高达97.7％；在高温(培养温度≥50℃)下，对afb1依然有很好的降解效果，当培养温度为50℃时，对afb1的降解率高达90.7％；当培养温度为60℃时，对afb1的降解率仍然高达86％。

实施例6暹罗芽孢杆菌wf2019的发酵液和胞内物降解afb1的性能实验

1、实验方法

取暹罗芽孢杆菌wf2019于10ml试管中，加入5ml培养基，30℃、200r/min培养20h；取100～300μl菌液于新的5ml培养基中，使得od600＝0.02～0.05；使用10000r/min离心菌液5min，取上清液为发酵液；沉淀物用pbs清洗两次后使用超声细胞破碎仪破碎，工作3s，间隔3s，共5min，加入pbs，溶出物为胞内物；分别在发酵液和胞内物中加入afb1，使得afb1终浓度为2μg/ml，于60℃、200r/min继续培养96h，空白对照为无菌的培养基加afb1，终浓度为2μg/ml。培养结束后，用hplc检测afb1浓度的变化。

2、实验结果

暹罗芽孢杆菌wf2019的发酵液和胞内物降解afb1的性能结果如图8所示，可以看出，暹罗芽孢杆菌wf2019的发酵液和胞内物均对afb1有一定的降解效果；其中，暹罗芽孢杆菌wf2019的发酵液对afb1仍然有56.1％的降解率；暹罗芽孢杆菌wf2019的胞内物对afb1仍然有50.3％的降解率。

实施例7暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1污染的花生脱毒的性能实验

1、实验方法

取暹罗芽孢杆菌wf2019于10ml试管中，加入5ml培养基，30℃、200r/min培养20h；取100～300μl菌液于新的5ml培养基中，使得od600＝0.02～0.05；afb1污染的花生样品经研磨后，进行121℃灭菌20min，再接入5ml的暹罗芽孢杆菌的发酵液中，空白为加入5ml培养基，于30℃、220r/min培养60h；培养结束后，用氯仿进行1：1的提取，加入氯仿后摇床震荡5min，吸取有机相蒸干，再用甲醇进行重悬，用hplc检测afb1浓度的变化。

2、实验结果

暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1污染的花生脱毒的性能结果如图9所示，可以看出，与对照组相比，暹罗芽孢杆菌wf2019对afb1污染的花生脱毒效果显著，经暹罗芽孢杆菌wf2019脱毒处理花生后，对afb1的降解率高达83.5％；因此，暹罗芽孢杆菌wf2019可以高效地降解花生中的afb1，减轻afb1对花生的污染。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一株用于降解黄曲霉毒素b1的暹罗芽孢杆菌wf2019菌株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1384

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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gact1384