数字PCR检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针的制作方法

本发明属于分子生物学和生物化学
技术领域：
，尤其涉及一种数字pcr检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针。
背景技术：
：白细胞介素17（interleukin17,il17）在机体的防御系统中发挥了重要的作用。il17可以通过诱导下游细胞因子（诸如趋化因子或il8）间接作用于中性粒细胞，促进其增殖和迁移；亦可以与其他细胞因子（il1、il6和tnf等）协同作用，激活组织中浸润的中性粒细胞清除病原；此外，il17还能够促进下游多种参与病原清除的效应分子的表达，例如肠道中的il17可以增强密封蛋白claudin和紧密连接蛋白zonaoccludens-1的合成，从而使上皮细胞间的连接更加紧密，促进机体与肠道内容物及病原微生物的隔离。近期研究发现，长牡蛎基因组中共存在10个il17家族成员，命名为cgil17-2~cgil17-10，其中cgil17-5在机体炎症反应和环境胁迫适应中发挥至关重要的作用。例如当长牡蛎受到灿烂弧菌的二次刺激后，血淋巴细胞中cgil17-5的表达量较第一次菌刺激后明显降低；在干露条件下，cgil17-5基因被干扰后，抗菌肽cgdefensin和促调亡因子cgdffa基因表达量较对照组有一定程度的降低，抑制凋亡因子cgiap表达量升高，表明干露条件下高表达量的cgil17-5可促进细胞的调亡，对长牡蛎防御系统起到了重要的调节作用。cgil17-5亦可结合于长牡蛎血淋巴细胞表面进而激活免疫相关转录因子，并诱导下游效应分子的表达。上述研究表明，cgil17-5是一类重要的长牡蛎促炎细胞因子，可参与长牡蛎的免疫防御和环境胁迫响应过程，对机体内稳态的维持起到了重要的作用，可作为养殖长牡蛎健康状态的重要指示分子，对养殖贝类病害预警预报系统的构建具有重要意义。荧光实时定量pcr（quantitativereal-timepcr，简称qpcr）是用于检测基因mrna表达水平的经典方法。但此方法只能用于检测基因的相对表达水平，需要设置对照组并选取合适的管家基因作为内参，因此qpcr技术的应用具有很大局限性。相对地，数字pcr是一种核酸分子绝对定量技术，能够直接检出dna分子的个数，是对起始样品的绝对定量，符合野外调查的需要。但是，迄今为止，没有关于数字pcr检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针的相关报道，以至于并没有基于数字pcr检测长牡蛎长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的时序变化并以此作为评价养殖长牡蛎健康状况的指标。技术实现要素：本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种数字pcr检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针。本发明的技术解决方案是：一种数字pcr检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针，其特征在于所述引物及探针核苷酸序列如下：正向引物：5’-tccctggtccaccatcatg-3’；反向引物：5’-ggaacaccactgaggacttgg-3’；探针：5’-cgcgtcagctacc-3’；所述探针添加的荧光基团为6-羧基荧光素。本发明设计的数字pcr检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针的准确性和特异性高，故可利用数字pcr技术检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的时序变化，以此作为评价养殖长牡蛎健康状况的指标，所建立的评价体系在养殖贝类病害预警预报中具有潜在应用价值。不需要设置对照组，也无需内参基因（internalcontrol），突破了传统荧光实时定量pcr检测方法的应用局限。附图说明图1为本发明实施例中长牡蛎cgil17-5的qpcr扩增曲线和反应程序图。图2为本发明实施例中长牡蛎cgil17-5的数字pcr反应的质量控制图。图3本发明实施例不同时期养殖长牡蛎血淋巴细胞中cgil17-5基因的绝对表达量图。具体实施方式1.cgil17-5序列筛查及引物设计从长牡蛎基因组中鉴定得到白细胞介素17-5（cgil17-5,cgi_10004922）的全长序列，查找其orf。2.cgil17-5的数字pcr引物和探针设计利用thermofisher公司的primerexpressv3.0软件根据cgil17-5的orf序列设计数字pcr引物和探针。引物和探针序列信息如下：正向引物：5’-tccctggtccaccatcatg-3’；反向引物：5’-ggaacaccactgaggacttgg-3’；探针：5’-cgcgtcagctacc-3’；数字pcr的正向引物长19bp，tm值59.0°c；反向引物长21bp，tm值57.0°c；探针长13bp，tm值68.0°c，制备方式为采用hplc制备，探针添加的荧光基团为6-羧基荧光素（6-fam）。实验例1：长牡蛎血淋巴细胞中cgil17-5基因绝对表达量的检测1.样品收集用牡蛎刀撬开长牡蛎外壳之后，以10ml注射器刺破血窦并抽取血淋巴；500目筛绢过滤后加入1.5mlep管中，800g离心10min，收集血淋巴细胞。2.总rna提取及cdna文库构建向每个盛有血淋巴细胞的ep管中加入1mltrizolreagent。向每1ml样品加入200μl预冷的氯仿（-20℃保存），剧烈震荡3min，4℃，12,000g离心15min。小心吸取上层透明液体400μl，加入相同体积的预冷异丙醇（-20℃保存），充分混匀后置于-80℃超低温冰箱中自然沉降。10min后，取出样品，4℃，12,000g离心15min。弃去管中液体，加入1ml75%无菌乙醇；用手指轻弹起管底沉淀，4℃，12,000g离心5min。弃去管中液体，4℃，12,000g离心30s，用1ml注射器小心吸干管底残留液体。开盖静置2~3min，使乙醇充分挥发干净。每管加入20μldepc水溶解rna。取微量样品进行核酸电泳以检测rna质量。用dna酶消化混于rna中的dna，采用两步法合成cdna文库第一条链。3.qpcr法验证数字pcr引物和探针的有效性利用本发明实施例的数字pcr引物，按照如下反应体系（14.5μl）进行实验：试剂体积quantstudio™3ddigitalpcrmastermixv27.3μl探针（终浓度200nm）0.7μl正向引物（终浓度900nm）0.7μl反向引物（终浓度900nm）0.7μlcdna模板1.4μldepc水3.7μlqpcr反应程序：50℃2min；95℃10min，95℃15，50个循环；60℃1min。采用7500分析软件，得到ct值。利用2-δδct算法得到基因的相对表达水平值。用excel和spss等软件进行统计学分析。实验结果如图1所示。图1中a为长牡蛎cgil17-5的qpcr扩增曲线，b为反应程序图。结果表明：反应进行到约第27轮时检测到fam基团的荧光信号，且反应进行至约第45轮时达到平台期。该结果说明所设计的用于检测cgil17-5绝对表达量的数字pcr引物和探针有效，符合后续实验要求。实验例2：数字pcr法检测cgil17-5基因的绝对表达水平利用本发明实施例的数字pcr引物及探针，按照如下反应体系（14.5μl）进行实验：试剂体积quantstudio™3ddigitalpcrmastermixv27.3μl探针（终浓度200nm）0.7μl正向引物（终浓度900nm）0.7μl反向引物（终浓度900nm）0.7μlcdna模板1.4μldepc水3.7μl借助proflex™2xflatpcrsystem(ordualflatblockgeneamp™pcrsystem9700)系统，按照如下反应条件：96℃10min（变性），60℃2min（退火并延伸），98℃30s，39个循环；60℃2min，10℃∞，检测长牡蛎血淋巴细胞中cgil17-5基因的绝对拷贝数。使用quantstudio™3ddigitalpcrinstrument系统读取数据，采用quantstudio™3danalysissuite™software进行数据分析。利用excel和spss等软件对数据进行统计学分析。通过对原始数据进行质控分析，结果如图2所示。发现只能检测到特异性的fam信号的单峰，且fam阳性信号和rox阴性对照信号能明显分为两群。结果表明本发明用于检测cgil17-5绝对表达量的数字pcr引物和探针具有高度特异性。实验例3：不同时期养殖长牡蛎血淋巴细胞中cgil17-5基因的绝对表达量应用本发明的数字pcr引物和探针对2019年5月至8月间的长牡蛎血淋巴细胞中cgil17-5的mrna表达水平进行检测，结果如图3所示。其中，5月份长牡蛎血淋巴细胞中cgil17-5的绝对量为265.79个拷贝/微升，7月份时长牡蛎血淋巴细胞中cgil17-5的绝对量为261.60个拷贝/微升，与5月份的水平相近。而8月份时长牡蛎血淋巴细胞中cgil17-5的绝对量为133.95个拷贝/微升，显著低于5月和7月的水平(p<0.05)。8月份是长牡蛎繁殖的关键季节，且此时大连附近长牡蛎养殖海区的表层水温达到年均最高值，生理和环境的双重影响导致长牡蛎在8月时的免疫能力显著下降，具体体现为il17-5等炎症因子的表达量明显降低。上述结果说明利用数字pcr能有效检测养殖长牡蛎体内cgil17-5基因的绝对表达量，从而间接反映养殖长牡蛎的免疫防御能力，相关研究结果在养殖长牡蛎病害预警预报中具有潜在应用价值。序列表<110>大连海洋大学<120>数字pcr检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达水平的引物及探针<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificial)<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<400>1tccctggtccaccatcatg19<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<400>2ggaacaccactgaggacttgg21<210>3<211>13<212>dna<213>人工序列(artificial)<220><221>misc_feature<222>(1)..(13)<400>3cgcgtcagctacc13当前第1页12