一种查耳酮类化合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及化学医药领域，具体涉及一种查耳酮类化合物及其制备方法和用途。
背景技术：
：鸡血藤药材为豆科(leguminosae)植物密花豆spatholobussuberectusdunn的干燥藤茎，为传统的活血化瘀中药，具有活血补血，调经止痛，舒筋活络的作用，临床上用于月经不调，痛经，经闭，风湿痹痛，麻木瘫痪，血虚萎黄。现代研究表明，鸡血藤的提取物和次级代谢产物能够抑制肿瘤细胞生长。其中，黄酮类成分是鸡血藤的明确活性成分，已报道的黄酮类型有黄酮类、二氢黄酮类、异黄酮类、异黄烷类、二氢黄酮醇类、查耳酮类等。尽管众多研究表明鸡血藤总黄酮表现出的多种药理活性，包括防治心脑血管疾病、改善血液系统疾病、抗肿瘤作用及抗菌等作用。但是，对于从鸡血藤药材中分离的具体化合物，特别是具体化合物相关活性研究尚少。因此，从鸡血藤药材中分离提取出新的查耳酮类化合物并且研究其相关活性具有重要的现实意义。技术实现要素：本发明的目的是提供了一种查耳酮类化合物及其制备方法和用途。本发明提供了式i所示的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药、或其代谢产物：其中，r1～r13各自独立地选自氢、c1～c6烷基、卤素、羟基、氨基、c1～c6烷氧基。进一步地，r1～r13各自独立地选自氢、c1～c3烷基、卤素、羟基、氨基、c1～c3烷氧基。进一步地，所述化合物如式ii所示：其中，r5～r13各自独立地选自氢、c1～c3烷基、卤素、羟基、氨基、c1～c3烷氧基。进一步地，所述化合物的结构式如下：本发明还提供了一种前述的化合物a的制备方法，步骤如下：a.取鸡血藤干燥饮片，95％乙醇加热回流提取，减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用水混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位；所述水的温度为不小于50℃；b.取步骤a所得的鸡血藤乙酸乙酯部位经硅胶柱层析，依次以二氯甲烷：甲醇＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、3:1、0:100(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取二氯甲烷：甲醇＝25:1(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，rf为0.20～0.80的相似流份，得f5；c.取步骤b所得的f5，上聚酰胺色谱，依次以甲醇:水＝0:100、25:75、40:60、50:50、75:25、95:5(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取甲醇：水＝25:75、40:60、50:50(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，rf为0.40～0.80的相似的流份，得f5-2；d.取步骤c所得的f5-2，经正相sephadexlh-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，rf为0.35～0.80的相似的流份，得f5-2-2；e.取步骤d所得的f5-2-2，经正相sephadexlh-20柱色谱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇＝2:2:1(v/v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30:1(v/v)，rf为0.30～0.50的相似的流份，得f5-2-2-4；f.取步骤e所得的f5-2-2-4，经反相sephadexlh-20柱色谱，以70％甲醇水溶液为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30:1(v/v)，rf为0.30～0.45的相似的流份，得f5-2-2-4-3；g.取步骤f所得的f5-2-2-4-3，正相sephadexlh-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10:1(v/v)，rf为0.35～0.70的相似的流份，得f5-2-2-4-3-2；h.取步骤g所得的f5-2-2-4-3-2，先经薄层色谱制备，以二氯甲烷：甲醇＝5:1(v/v)为展开剂，再采用半制备高效液相色谱纯化，以58％甲醇水溶液为洗脱剂，tr＝70.3min，分离得到化合物a。进一步地，步骤a中，所述95％乙醇用量为鸡血藤干燥饮片的6倍(v/w)；所述提取为提取3次，每次提取时间为3h；和/或，步骤b中，所述梯度洗脱条件如下：和/或，步骤c中，所述梯度洗脱的条件如下：和/或，步骤d中，组分f5-2为5.4g时，收集所述洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)的体积为0.18l；和/或，步骤e中，组分f5-2-2为1.2g时，收集所述洗脱剂石油醚：二氯甲烷：甲醇＝2:2:1(v/v/v)的体积为0.10l；和/或，步骤f中，组分f5-2-2-4为0.3g时，收集所述70％甲醇水溶液的体积为0.15l；和/或，步骤g中，组分f5-2-2-4-3为0.1g时，收集所述二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)的体积为0.10l。本发明还提供了前述的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤为肺癌。本发明还提供了一种药物，它是以前述的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。本发明查耳酮类化合物具有良好的抗肿瘤效果，特别是对于肺癌细胞的增殖具有显著抑制作用，能够有效用于治疗和/或预防肺癌。本发明查耳酮类化合物为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物，特别是抗肺癌的药物提供了一种新的选择，具有良好的市场前景。本发明中，碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀ca～cb烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基，因此，例如，c1～c6烷基是指包含1～6个碳原子的烷基。又例如，前缀ca～cb烷氧基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷氧基，因此，例如c1～c6烷氧基是指包含1～6个碳原子的烷氧基。本发明中v/v和v/v/v均是指体积比，单位为ml/ml和ml/ml/ml；v/w是指体积质量比，单位为ml/g。本发明中95％乙醇是指浓度为95％的乙醇水溶液。本发明化合物a不仅可以从鸡血藤中分离得到，也按照化学领域中常规的方法取代而制得，例如克莱森-施密特反应途径等。本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试剂结合使用。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为本发明式a化合物的hresims图。图2为本发明式a化合物的1h-nmr图。图3为本发明式a化合物的13c-nmr图。图4为本发明式a化合物的ir图。具体实施方式本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。1)药材鸡血藤药材于2013年6月购于四川新荷花中药饮片股份有限公司，经成都中医药大学中药鉴定教研室龙飞博士鉴定为豆科崖豆藤属植物密花豆(spatholobussuberectusdunn)的干燥藤茎。2)试剂柱层析硅胶，200～300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；薄层层析硅胶g、gf254和h(化学纯)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；中压液相色谱仪：búchigradientformerb-687，rpc18，43-60μm；welchultimatexb-c18(10×250mm，5μm)半制备型柱；sephadexlh-20葡聚糖凝胶，购于瑞典amersham公司；gf254硅胶制备薄层，购于烟台江友硅胶开发有限公司；石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等分析纯试剂，购于成都科龙化工试剂厂。3)主要仪器agilent1220高效液相色谱仪(美国安捷伦)；waterssynaptg2hdms高分辨飞行时间质谱(美国waters)；bruker-aviiihd-600、bruker-aviiihd-600核磁共振仪(瑞士bruker)；agilentcary600ftir红外光谱仪(美国安捷伦)；shimadzuuv-260紫外-可见分光光度仪(日本shimadzu)；安东帕mcp200旋光测定仪(奥地利安东帕)；bp211d十万分之一电子天平(瑞士sartorius)；r-210旋转蒸发器(瑞士buchi)；dzg-6050型真空干燥箱(上海森信)。实施例1、本发明化合物a(2',5-dihydroxy-7-methoxychalcone；2',5-二羟基-7-甲氧基二氢查耳酮)的制备1)成分的分离纯化①药材的提取：取鸡血藤干燥饮片15kg，鸡血藤干燥饮片6倍量(v/w)的95％乙醇加热回流提取3次，每次提取3小时，提取后减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用热水(热水温度不小于50℃)混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位。②采用硅胶柱色谱(200～300目，2.5kg，14×150cm)对所得的鸡血藤乙酸乙酯部位进行色谱分离，以不同体积比的二氯甲烷-甲醇(100:0～0:100)为流动相(洗脱剂)进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表1，洗脱液经薄层色谱检测，合并组成相似的流份：取二氯甲烷-甲醇体积比为25:1时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，rf为0.20～0.80的相似流份，得f5。表1硅胶柱层析色谱的洗脱条件表1的洗脱条件是按照不同体积比的洗脱剂从上到下的顺序依次收集相应体积的洗脱液，例如鸡血藤乙酸乙酯部位为100g，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:0时，收集5l；洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:1时，收集10l；依次类推。故步骤②中“取二氯甲烷：甲醇＝25:1时的洗脱液”是经过表1中在其上方的三种洗脱剂洗脱且收集相应洗脱体积后，收集洗脱液为取二氯甲烷：甲醇＝25:1时的洗脱液30l。③f5(48g)通过聚酰胺色谱，依次以甲醇:水＝0:100、25:75、40:60、50:50、75:25、95:5(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表2，取甲醇：水＝25:75、40:60、50:50(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱法，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10：1(v/v)，rf为0.40～0.80的相似的流份，得f5-2。表2聚酰胺色谱的洗脱条件表2的洗脱条件是按照不同体积比的洗脱剂从上到下的顺序依次收集相应体积的洗脱液，例如组分f5为48g，洗脱剂为甲醇：水＝0:100时，收集8l；洗脱剂为甲醇：水＝25:75时，收集4.5l；依次类推。④f5-2经正相sephadexlh-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇(1:1，v/v)为洗脱剂，其中，组分f5-2为5.4g时，收集0.18l洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10：1(v/v)，rf为0.35～0.80的相似的流份，得f5-2-2。f5-2-2经正相sephadexlh-20柱色谱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇＝2:2:1(v/v/v)为洗脱剂，其中，组分f5-2-2为1.2g时，收集0.10l洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30：1(v/v)，rf为0.30～0.50的相似的流份，得f5-2-2-4。f5-2-2-4经反相sephadexlh-20柱色谱，以70％甲醇水为洗脱剂，其中，组分f5-2-2-4为0.3g时，收集0.15l洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30：1(v/v)，rf为0.30～0.45的相似的流份，得f5-2-2-4-3。f5-2-2-4-3经正相sephadexlh-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，其中，组分f5-2-2-4-3为0.10g时，收集0.10l洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1(v/v)，rf为0.35～0.70的相似的流份，得f5-2-2-4-3-2。f5-2-2-4-3-2先经薄层色谱(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝5:1(v/v))制备，再采用半制备高效液相色谱(洗脱剂为58％甲醇水溶液，tr＝70.3min)纯化，分离得到化合物a。2)目标化合物的鉴定化合物a为淡白色粉末。ir光谱(图4)显示有3228、2923、2851、1734、1594、1582、1454、1244、1203、1027、753cm-1。hr-esi-ms给出准分子离子峰m/z295.0945[m+na]+，提示分子式为c16h16o4(calcdforc16h16o4na,295.0946)，不饱和度为9，见图1。根据图2中化合物a的1hnmr谱显示的信号，可归属于一个1,2,4-三取代苯环[δh6.41(m),6.42(m)和7.87(d8.0hz)]、一个1',2'-邻二取代苯环[δh6.90(d,6.5hz)、7.09(dt,7.8,1.8hz)、6.83(dt,7.8,1.8hz)、7.10(d,7.8hz)]、一个甲氧基[δh3.89(s)]、两个亚甲基[δh2.97(t,5.0hz)和3.40(t,5.0hz)](见表3)。结合图3中13cnmr谱显示16个碳信号(表4)，在δc23～56ppm有3个碳信号，在δc99～163之间共有12个碳信号，其中包含5个季碳，7个次甲基，在δc201.5ppm有1个羰基碳信号，以上信号说明化合物a为1个二氢查耳酮类化合物。为确定取代基的位置，进一步通过2dnmr数据分析。在hmbc谱中，h-2与c-3,c-1',c-2',c-6',c-4相关，h-6'与c-1,c-2',c-4'相关，说明b环上羟基连在2'位上；h-3'与c-1',c-2',c-5'相关，所以b环取代模式为邻位二取代苯环；通过h-3与c-1',c-2,c-4有相关，h-9与c-4,c-7有相关，c-5a与h-6,h-8有相关，说明a环为一个1,2,4-三取代苯环。最终，确定化合物a的结构，命名为2',5-二羟基-7-甲氧基二氢查耳酮。因此，本发明新化合物的化学结构得到了确定，如式a所示：进行核磁共振氢谱(1h-nmr)：bruker-aviiihd-500spectrometer测定，数据见表3。表3化合物a的1hnmr(500mhz)核磁数据(测定溶剂：acdcl3；δ：ppm；j：hz)no.aa1-22.97t(5.0)33.40t(5.0)4-5-5a-66.41m7-86.42m97.87d(8.0)1'-2'-3'6.90d(6.5)4'7.09dt(6.5,1.5)5'6.83dt(6.5,1.5)6'7.10d(6.5)7-ome3.89s5-ome-2'-ome-进行核磁共振碳谱(13c-nmr)：bruker-aviiihd-600spectrometer测定，数据见表4。表4化合物a的13cnmr(150mhz)核磁数据(测定溶剂：acdcl3；δ：ppm；j：hz)以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：实验例1、本发明异黄烷类化合物的抗肺癌a549活性试验①、细胞接种用0.25％胰酶消化对数生长期的细胞。用含10％fbs的rpmi-1640培养基培养配成单细胞悬液。采用细胞计数板计数，将状态良好的a549肿瘤细胞接种于96孔板，使细胞密度为4×103个/ml，每孔加入细胞悬液100μl，置于37℃，5％co2培养箱内培养24h。②、药物处理样品(化合物a)从100μm开始，用培养基梯度稀释样品，2倍稀释，设置5个药物浓度，每个浓度做复孔测试。以浓度为100、50、25、12.5、6.25μm每孔加药100μl，每个浓度设3个复孔，重复3次。阴性对照组为含有适量dmso的培养基溶液，空白对照组为不含细胞的培养基和溶媒。将96孔板放回培养箱，37℃作用72h。③、显色及抑制率的计算72h作用完毕后，避光条件下每孔加入mtt溶液(5g/l)20μl，继续温育培养4h后，弃掉上清液，每孔加入150μldmso，置于摇床上慢速振摇10min，使甲瓒充分溶解后，用酶标仪测量570nm波长处的od值，按下列公式计算增殖抑制率。采用抑制率的计算公式进行计算，抑制率＝(1-待测od值/空白组od值)×100％。通过重复三次试验，计算得到3次抑制率的平均值，得到本发明实施例1所得化合物a在100μm时对肺癌细胞a549的抑制率为24.41％。上述结果表明，本发明的查耳酮类黄酮化合物a，对肺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，能够用于治疗和/或预防肺癌，具有良好的临床应用前景。实验例2本发明异黄烷类化合物的抗乳腺癌mda-mb-231活性试验①、细胞接种用0.25％胰酶消化对数生长期的细胞。用含10％fbs的dmem细胞培养基培养配成单细胞悬液。采用细胞计数板计数，将状态良好的mda-mb-231肿瘤细胞接种于96孔板，使细胞密度为4×103个/ml，每孔加入细胞悬液100μl，置于37℃，5％co2培养箱内培养24h。②、药物处理样品(化合物a)从100μm开始，用培养基梯度稀释样品，2倍稀释，设置5个药物浓度，每个浓度做复孔测试。以浓度为100、50、25、12.5、6.25μm每孔加药100μl，每个浓度设3个复孔，重复3次。阴性对照组为含有适量dmso的培养基溶液，空白对照组为不含细胞的培养基和溶媒。将96孔板放回培养箱，37℃作用72h。③、显色及抑制率的计算72h作用完毕后，避光条件下每孔加入mtt溶液(5g/l)20μl，继续温育培养4h后，弃掉上清液，每孔加入150μldmso，置于摇床上慢速振摇10min，使甲瓒充分溶解后，用酶标仪测量570nm波长处的od值，按下列公式计算增殖抑制率。采用抑制率的计算公式进行计算，抑制率＝(1-待测od值/空白组od值)×100％。通过重复三次试验，计算得到3次抑制率的平均值，得到本发明实施例1所得化合物a在100μm时对乳腺癌细胞无明显抑制作用。上述结果表明，本发明的查耳酮类黄酮化合物a，对mda-mb-231乳腺癌细胞的增殖无具有显著的抑制活性，不能够用于治疗和/或预防乳腺癌。综上，本发明查耳酮类化合物具有良好的抗肿瘤效果，特别是对于肺癌细胞的增殖具有显著抑制作用，能够有效用于治疗和/或预防肺癌。本发明查耳酮类化合物为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物，特别是抗肺癌的药物提供了一种新的选择，具有良好的市场前景。当前第1页12