本发明涉及小分子肽的制备
技术领域：
，特别涉及一种富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法。
背景技术：
：燕窝，又称为燕菜、燕蔬菜，具有极高的营养价值和药用价值，《本草纲目》中记录：“燕窝入肺主气，入肾滋水，入胃补脾，补而不燥”，现代医学研究表明，燕窝中富含各种蛋白质、18种氨基酸、糖类及各种矿物元素，其中，蛋白质主要以糖蛋白为主，且所含的糖蛋白主要以黏蛋白为主，具有抗氧化性、预防肿瘤疾病、降低高血压高血脂、提高人体免疫力以及保护关节、治疗风湿性关节炎的作用，18种氨基酸中有6种是人体必需的，矿物质以钠、钾、钙、镁四种为主。燕窝中丰富的营养价值倍受追捧，成为现代人的养生极品，被制备成各种滋补营养品。但是，有研究表明，随着人年纪的增长，人体内分泌蛋白酶的能力逐渐下降，其消化吸收能力也下降，因此按照传统方法食用燕窝，其营养物质并不能得到充分利用。小分子肽是由两个及以上的氨基酸以肽键相连的一种蛋白质片段，具有易吸收的特点，小分子肽早已成为保健品和药物开发的热点。现有技术中，早有人利用生物酶将燕窝酶解成小分子肽来提高燕窝所含营养物质的利用率，如：通过木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶酶解燕窝的方法制备小分子肽，而燕窝经过蛋白酶酶解成小分子肽后，不但有利于各种营养物质的吸收，而且其酶解出来的小分子能表现出多种有利于人体健康的生物活性。但是，现有的酶解方法小分子肽的得率不高，且提取的燕窝小分子肽中抗氧化肽的含量不高，其抗氧化活性有待提高。可见，现有技术还有待改进和提高。技术实现要素：鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法，旨在解决现有技术中酶解燕窝制备小分子肽的肽得率不高，且抗氧化活性不高的缺陷。为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：一种富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法，其中，所述方法包括步骤：燕窝的预处理、燕窝的溶胀、ph的调节、酶解、一次灭活、分离浓缩干燥、类蛋白反应、二次灭活、分离干燥，所述燕窝的预处理包括燕窝的冻融破碎处理，所述酶解步骤采用的蛋白酶为复合蛋白酶，包括燕窝蛋白酶和中性蛋白酶，所述类蛋白反应采用木瓜蛋白酶作为反应酶。所述富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法中，所述燕窝的冻融破碎处理步骤具体包括：将燕窝置于-10℃～0℃条件下放置30～40min，然后迅速升温至30℃进行破碎，然后重复冷冻-破碎步骤2～4次，过筛，得60～100目燕窝粉。所述富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法中，所述燕窝的溶胀步骤具体包括：按1∶10～15配比取燕窝粉及去离子水，混合后超声振荡至完全溶胀，得燕窝溶胀液。所述富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法中，所述ph值的调节步骤具体为：先测定燕窝溶胀液的ph值，然后调节燕窝溶胀液的ph值为6～8。所述富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法中，所述酶解步骤具体包括：加入4000u/g～6000u/g木瓜蛋白酶及5000u/g～7000u/g的中性蛋白酶于燕窝溶胀液中，于50℃～60℃恒温且缓慢搅拌条件下酶解4～6h。所述富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法中，所述灭活步骤具体为：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活10～20min。所述富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法中，所述分离浓缩干燥步骤包括：一次灭活后的酶解液通过无机陶瓷超滤膜进行分离，得清液，将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥得燕窝小分子肽。所述富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法中，所述类蛋白反应步骤具体包括：按1∶1～2比例取燕窝小分子肽和去离子水，将燕窝小分子肽溶于去离子水，加入1000u/g～2000u/g木瓜蛋白酶，于30℃～50℃的恒温条件下，缓慢搅拌反应4～6h。所述富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法中，所述二次灭活具体步骤为：将类蛋白反应后的溶液于沸水浴中6～10min。所述富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法中，所述浓缩干燥步骤包括：将二次灭活后的溶液通过离心分离，得清液，将清液通过喷雾干燥，喷雾干燥的入风温度为120℃～180℃，出风温度为80℃～100℃，进风量为5m3/min，得富含抗氧化肽的燕窝小分子肽。有益效果：本发明提供了一种富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法，所述方法通过冻融破碎处理、复合酶酶解及类蛋白反应，不但大大提高燕窝小分子肽的得率，同时提高小分子肽的抗氧化活性，使得燕窝的营养物质更易于消化吸收，燕窝的利用率更高，燕窝的经济价值更好。与现有技术相比，具有以下特点：(1)采用冻融破碎处理的方式，使燕窝的细胞壁破裂更为均匀，提高燕窝的比表面积，增大蛋白质与酶的接触面积，从而提高了酶解的速度和效率，进一步提高酶解的肽得率。(2)采用复合蛋白酶进行酶解，燕窝中含有多种蛋白质，复合蛋白酶能够酶解更多类别的蛋白质，从而加深酶解程度，提高燕窝酶解的肽得率。(3)通过类蛋白反应，对小分子肽进行修饰，以提高小分子肽的抗氧化活性，使燕窝小分子具有更优的抗氧化效果。具体实施方式本发明提供一种富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明提供一种富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法，所述方法包括步骤：燕窝的预处理、燕窝的溶胀、ph的调节、酶解、一次灭活、分离浓缩干燥、类蛋白反应、二次灭活、分离干燥，所述燕窝的预处理包括燕窝的冻融破碎处理，所述酶解步骤采用的蛋白酶为复合蛋白酶，包括燕窝蛋白酶和中性蛋白酶，所述类蛋白反应采用木瓜蛋白酶作为反应酶。上述方法通过优化燕窝的预处理过程、酶解反应及引入类蛋白反应，在提高燕窝小分子肽得率的同时，提高小分子肽的抗氧化活性。所述燕窝的预处理采用冻融破碎的方式，可获得较好的破壁效果，利于后续的酶解反应。所述燕窝的酶解反应，采用复合蛋白酶，包括木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，所述木瓜蛋白酶属于巯基蛋白酶，具有酶活性高、热稳定性好的特点，所述中性蛋白酶属于内切酶，可将大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，当两者共同作用时，可提高酶解的速率及肽得率。所述类蛋白反应，能对小分子肽进行修饰，增加小分子肽的活性位点，从而提高小分子肽的抗氧化活性。上述制备方法中，所述燕窝的冻融破碎处理步骤具体包括：将燕窝置于-10℃～0℃条件下放置30～40min，然后迅速升温至30℃进行破碎，然后重复冷冻-破碎步骤2～4次，过筛，得60～100目燕窝粉。冻融破碎处理主要利用的是速冷速热的过程中，破坏细胞壁的弹性极限，再通过外力的作用，使得细胞壁破壁。破壁一方面利于蛋白质的溶出，另一方面提高比表面积，增大后续酶解过程中蛋白质与酶的有效接触面积。冻融处理中，温度是关键，温度越低，温差越大，温度变化的速度越快，破壁率越高，对细胞壁的破坏越大。但是温度过低，容易引起燕窝蛋白变质，降低其活性。当急冻温度控制为-10℃～0℃时，破碎温度控制为30℃时，具有较佳的破壁效果，且蛋白质的活性较高。上述制备方法中，所述燕窝的溶胀步骤具体包括：按1∶10～15配比取燕窝粉及去离子水，混合后超声振荡至完全溶胀，得燕窝溶胀液。冻融处理后的燕窝粉在水的作用下溶胀，通过超声振荡，能进一步促进破壁，使蛋白质较快的溶出。溶胀步骤中，燕窝与去离子水的配比影响溶胀的速度，也影响后续的酶解速度和效率，料液比太低或太高都会影响酶解效果，不利于酶解反应的进行，当料液比为1∶10～15时，具有较佳的溶胀效果，且后续的酶解效果好。上述制备方法中，所述ph值的调节步骤具体为：先测定燕窝溶胀液的ph值，然后调节燕窝溶胀液的ph值为6～8，最优ph值为6.7。调节溶胀液的ph值，使体系的ph值适合酶解。本发明中，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶两种酶，二者较适合的ph值范围为6～8。优选地，ph值为6.7时，具有最佳的酶解效果。上述制备方法中，所述酶解步骤具体包括：加入4000u/g～6000u/g木瓜蛋白酶及5000u/g～7000u/g的中性蛋白酶于燕窝溶胀液中，于50℃～60℃恒温且缓慢搅拌条件下酶解4～6h。本方法中，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶共同酶解的方式，以提高酶解率，同时具有去苦味，提高小分子肽风味的特点。酶解过程中，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的添加量、酶解温度，直接影响酶解速率，当为上述条件时，具有较佳的酶解速率，且肽得率较高。上述制备方法中，所述一次灭活步骤具体为：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活10～20min。由于木瓜蛋白酶的失活温度较高，在90℃还具有活性，因此需在沸水浴中灭活10～20min方才能将酶失效。上述制备方法中，所述分离浓缩干燥步骤包括：灭活后的酶解液通过无机陶瓷超滤膜进行分离，得清液，将清液通过真空冷冻干燥设备进行浓缩，干燥后得燕窝小分子肽。灭活结束后停止加热，冷却至室温，然后将酶解液通过无机陶瓷膜分离设备进行分离，得含有燕窝小分子肽的清液，将清液真空冷冻干燥设备进行干燥，冷冻温度为-10℃，真空度为-0.6mpa，得燕窝小分子肽。所述无机陶瓷膜分离备设有多层滤膜，最外层为超滤膜，通过超滤膜后的酶解液能得到分子量小于10000da的小分子肽。所述无机陶瓷膜的分离效率高，且操作简单，具有较佳的分离效果。上述制备方法中，所述类蛋白反应步骤具体包括：按1∶1～2比例取燕窝小分子肽和去离子水，将燕窝小分子肽溶于去离子水，加入1000u/g～2000u/g木瓜蛋白酶，于30℃～50℃的恒温条件下，缓慢搅拌反应4～6h。本发明中，所述类蛋白反应是在特定条件下，浓缩小分子肽在木瓜蛋白酶的作用下对小分子肽进行修饰的过程。所述类蛋白反应中，底物的浓度、反应温度、ph值及酶的浓度将影响类蛋白反应的方向与速度；其中，底物浓度需高，由于底物浓度过低时易产生水解反应，但是也并非越高越好，过高会形成粘稠物，不利于反应，当低物浓度在30～50％之间时具有较佳粘稠度，且反应易朝着类蛋白反应的方向进行；同样，酶的浓度及温度也不宜过高，太高容易引起酶解反应，当木瓜蛋白酶的添加量为1000u/g～2000u/g，反应温度为30℃～50℃，具有较佳的修饰效果。上述制备方法中，所述二次灭活具体步骤为：将类蛋白反应后的溶液于沸水浴中6～10min。上述制备方法中，所述浓缩干燥步骤包括：二次灭活结束后停止加热，冷却至室温，然后将类蛋白反应液通过离心分离设备进行分离，得清液，所述离心分离设备设有多层滤膜，最外层为超滤膜，通过超滤膜后的液体分子量小于10000da。将分离后得到的清液采用喷雾干燥的方式进行干燥，得到富含抗氧化肽的燕窝小分子肽粉末。喷雾干燥条件为：入风温度为120℃～180℃，出风温度为80℃～100℃，进风量为5m3/min。喷雾干燥得到的小分子肽具有较细较均匀的粒径，易于溶解和吸收，但是干燥过程中会损失部分小分子肽。上述富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法，具有酶解速率快、肽得率高、所得小分子肽的抗氧化活性高的优点，酶解后的产物经液质联用仪检测，发现为一系列含10～20个氨基酸的小分子肽，具有易消化吸收，且抗氧化活性高的特点。制备过程中，燕窝的冻融处理，能提高燕窝的破壁率，加速后续酶解的速率；添加的复合蛋白酶，能较好的酶解燕窝蛋白质，具有较高的肽得率；所述类蛋白反应，能够提高小分子肽的活性，提高抗氧化肽的含量。本发明中，所述酶解率在酶解4h后，燕窝小分子肽的肽得率均能达到60％～70％；酶解结束后经检测分析，所述方法小分子肽的肽得率达到72％-79％。需要说明的是，所述肽得率为：(酶解后清液的总氮量-清液中氨态氮含量)÷燕窝总氮量×100％。实施例1一种富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤一.燕窝的冻融破碎处理：将燕窝置于-10℃条件下放置30min，然后迅速升温至30℃进行破碎，然后重复冷冻-破碎步骤2次，过筛，得60～100目燕窝粉。步骤二.所述燕窝的溶胀：按1∶10配比取燕窝粉及去离子水，混合后超声振荡至完全溶胀，得燕窝溶胀液。步骤三.ph值的调节：先测定燕窝溶胀液的ph值，然后调节燕窝溶胀液的ph值为6。步骤四.酶解：加入4000u/g木瓜蛋白酶及7000u/g的中性蛋白酶于燕窝溶胀液中，于50℃恒温且缓慢搅拌条件下酶解4h。步骤五.灭活：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活10min。步骤六.分离浓缩干燥：灭活后的酶解液通过无机陶瓷超滤膜进行分离，得清液，将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥得燕窝小分子肽。步骤七.类蛋白反应：按1∶1比例取燕窝小分子肽和去离子水，将燕窝小分子肽溶于去离子水，加入1000u/g木瓜蛋白酶，于30℃的恒温条件下，缓慢搅拌反应4h。步骤八.二次灭活：将类蛋白反应后的溶液于沸水浴中6min。步骤九.分离干燥：将二次灭活后的溶液通过离心分离，得清液，将清液通过喷雾干燥，喷雾干燥的入风温度为120℃，出风温度为80℃，进风量为5m3/min，得富含抗氧化肽的燕窝小分子肽。实施例2一种富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤一.燕窝的冻融破碎处理：将燕窝置于0℃条件下放置40min，然后迅速升温至30℃进行破碎，然后重复冷冻-破碎步骤4次，过筛，得60～100目燕窝粉。步骤二.所述燕窝的溶胀：按1∶15配比取燕窝粉及去离子水，混合后超声振荡至完全溶胀，得燕窝溶胀液。步骤三.ph值的调节：先测定燕窝溶胀液的ph值，然后调节燕窝溶胀液的ph值为8。步骤四.酶解：加入6000u/g木瓜蛋白酶及5000u/g的中性蛋白酶于燕窝溶胀液中，于60℃恒温且缓慢搅拌条件下酶解6h。步骤五.灭活：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活20min。步骤六.分离浓缩干燥：灭活后的酶解液通过无机陶瓷超滤膜进行分离，得清液，将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥得燕窝小分子肽。步骤七.类蛋白反应：按1∶2比例取燕窝小分子肽和去离子水，将燕窝小分子肽溶于去离子水，加入2000u/g木瓜蛋白酶，于50℃的恒温条件下，缓慢搅拌反应6h。步骤八.二次灭活：将类蛋白反应后的溶液于沸水浴中10min。步骤九.分离干燥：将二次灭活后的溶液通过离心分离，得清液，将清液通过喷雾干燥，喷雾干燥的入风温度为180℃，出风温度为100℃，进风量为5m3/min，得富含抗氧化肽的燕窝小分子肽。实施例3一种富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤一.燕窝的冻融破碎处理：将燕窝置于-5℃条件下放置35min，然后迅速升温至30℃进行破碎，然后重复冷冻-破碎步骤3次，过筛，得60～100目燕窝粉。步骤二.所述燕窝的溶胀：按1∶12配比取燕窝粉及去离子水，混合后超声振荡至完全溶胀，得燕窝溶胀液。步骤三.ph值的调节：先测定燕窝溶胀液的ph值，然后调节燕窝溶胀液的ph值为7。步骤四.酶解：加入5000u/g木瓜蛋白酶及6000u/g的中性蛋白酶于燕窝溶胀液中，于55℃恒温且缓慢搅拌条件下酶解5h。步骤五.灭活：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活15min。步骤六.分离浓缩干燥：灭活后的酶解液通过无机陶瓷超滤膜进行分离，得清液，将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥得燕窝小分子肽。步骤七.类蛋白反应：按1∶1.5比例取燕窝小分子肽和去离子水，将燕窝小分子肽溶于去离子水，加入1500u/g木瓜蛋白酶，于40℃的恒温条件下，缓慢搅拌反应5h。步骤八.二次灭活：将类蛋白反应后的溶液于沸水浴中8min。步骤九.分离干燥：将二次灭活后的溶液通过离心分离，得清液，将清液通过喷雾干燥，喷雾干燥的入风温度为150℃，出风温度为90℃，进风量为5m3/min，得富含抗氧化肽的燕窝小分子肽。实施例4一种优选的富含抗氧化肽的燕窝小分子肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤一.燕窝的冻融破碎处理：将燕窝置于-8℃条件下放置32min，然后迅速升温至30℃进行破碎，然后重复冷冻-破碎步骤3次，过筛，得60～100目燕窝粉。步骤二.所述燕窝的溶胀：按1∶13配比取燕窝粉及去离子水，混合后超声振荡至完全溶胀，得燕窝溶胀液。步骤三.ph值的调节：先测定燕窝溶胀液的ph值，然后调节燕窝溶胀液的ph值为6.7。步骤四.酶解：加入5200u/g木瓜蛋白酶及5300u/g的中性蛋白酶于燕窝溶胀液中，于53℃恒温且缓慢搅拌条件下酶解5.5h。步骤五.灭活：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活12min。步骤六.分离浓缩干燥：灭活后的酶解液通过无机陶瓷超滤膜进行分离，得清液，将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥得燕窝小分子肽。步骤七.类蛋白反应：按1∶1.2比例取燕窝小分子肽和去离子水，将燕窝小分子肽溶于去离子水，加入1200u/g木瓜蛋白酶，于38℃的恒温条件下，缓慢搅拌反应5.5h。步骤八.二次灭活：将类蛋白反应后的溶液于沸水浴中7min。步骤九.分离干燥：将二次灭活后的溶液通过离心分离，得清液，将清液通过喷雾干燥，喷雾干燥的入风温度为166℃，出风温度为87℃，进风量为5m3/min，得富含抗氧化肽的燕窝小分子肽。对照例1一种燕窝小分子肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤一.燕窝的预处理：将燕窝粉碎，过筛，得60～100目燕窝粉。步骤二.所述燕窝的溶胀：按1∶10配比取燕窝粉及去离子水，混合后超声振荡至完全溶胀，得燕窝溶胀液。步骤三.ph值的调节：先测定燕窝溶胀液的ph值，然后调节燕窝溶胀液的ph值为6。步骤四.酶解：加入4000u/g木瓜蛋白酶及7000u/g的中性蛋白酶于燕窝溶胀液中，于50℃恒温且缓慢搅拌条件下酶解4h。步骤五.灭活：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活10min。步骤六.分离浓缩干燥：灭活后的酶解液通过无机陶瓷超滤膜进行分离，得清液，将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥得燕窝小分子肽。步骤七.类蛋白反应：按1∶1比例取燕窝小分子肽和去离子水，将燕窝小分子肽溶于去离子水，加入1000u/g木瓜蛋白酶，于30℃的恒温条件下，缓慢搅拌反应4h。步骤八.二次灭活：将类蛋白反应后的溶液于沸水浴中6min。步骤九.分离干燥：将二次灭活后的溶液通过离心分离，得清液，将清液通过喷雾干燥，喷雾干燥的入风温度为120℃，出风温度为80℃，进风量为5m3/min，得富含抗氧化肽的燕窝小分子肽。对照例2一种燕窝小分子肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤一.燕窝的冻融破碎处理：将燕窝置于-8℃条件下放置32min，然后迅速升温至30℃进行破碎，然后重复冷冻-破碎步骤3次，过筛，得60～100目燕窝粉。步骤二.所述燕窝的溶胀：按1∶13配比取燕窝粉及去离子水，混合后超声振荡至完全溶胀，得燕窝溶胀液。步骤三.ph值的调节：先测定燕窝溶胀液的ph值，然后调节燕窝溶胀液的ph值为6.7。步骤四.酶解：加入5200u/g木瓜蛋白酶及5300u/g的中性蛋白酶于燕窝溶胀液中，于53℃恒温且缓慢搅拌条件下酶解5.5h。步骤五.灭活：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活12min。步骤六.分离浓缩干燥：灭活后的酶解液通过无机陶瓷超滤膜进行分离，得清液，将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥得燕窝小分子肽。将实施例1-4及对比例1、对比例2进行肽得率的测试，通过凯氏定氮法测定总氮含量及蛋白质含量，通过单指示剂甲醛滴定法测定氨态氮量，通过总氮含量、蛋白质含量及氨态氮量计算肽得率，并通过清除dpph自由基及清除abts+˙，进行各样品的抗化活性分析。具体结果见表1。表1.提取率及抗氧化活性测试结果项目实施例1实施例2实施例3实施例4对照例1对照例2提取率72％75％77％79％65％80％dpph自由基清除率76％79％81％85％78％58％abts+˙清除率78％81％85％88％80％60％通过比对实施例1-5和对照例1-2可知，(1)除了燕窝的预处理步骤不同，实施例1的提取条件与对照例1的完全相同，但是二者的肽得率相差7个百分点，显然冻融处理能够提高小分子肽的肽得率；(2)实施例4与对照例2的提取条件相同，二者的肽得率较接近，但是，由于实施例4有进行类蛋白反应对小分子肽进行修饰，实施例4的抗氧化活性远高于对照例2的，显然，类蛋白反应能够大大提高小分子肽的抗氧化活性。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。当前第1页12