植物乳杆菌LP10及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及植物乳杆菌株lp10及其应用。
背景技术：
：非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)是代谢综合征的肝脏表现，可发展为肝硬化和肝癌。当肝中脂肪的含量超过肝重的5％时可定义为非酒精性脂肪肝。非酒精性脂肪肝的病因尚未明确，临床使用抗氧化剂、胰岛素敏感剂、降脂药等药物进行针对治疗。越来越多的证据表明肠道微生物与宿主生理具有紧密的联系。肠道微生物多样性降低和内毒素的增加都有助于nafld的发展。现有技术研究表明在动物模型中，益生菌可通过操控肠道微生物的组成和丰度影响宿主的代谢和调控葡萄糖稳态而减轻肝损伤。植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)是一类革兰氏阳性、兼性异型发酵乳酸菌，厌氧或兼性厌氧，是我国卫生部颁布的可用于食品的益生菌之一。植物乳杆菌广泛存在于发酵食品中，食用历史悠久、安全性高、具有多种益生作用，如调节肠道菌群平衡、改善胃肠道功能、增强生物屏障、参与免疫系统调节、降胆固醇、抗氧化、降血压及吸附重金属等，在食品发酵、工业生产和医疗保健等领域均有广泛应用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌菌株lp10。本发明的再一目的在于提供上述菌株的应用。本发明的再一目的在于提供含有上述植物乳杆菌lp10的药物。根据本发明具体实施方式的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)lp10，其保藏编号为cgmccno.17956，该菌株于2019年06月18日保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。本发明提供了上述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)lp10在用于制备降脂药物方面的应用。根据本发明具体实施方式的降脂药物，其中含有植物乳杆菌菌株lp10。本发明的有益效果：本发明的植物乳杆菌lp10能够提升肝功能，该菌株可提升肠道屏障与降低肝脏病理损伤，通过改变肠道微生物组成，增加短链脂肪酸产生菌，增强肠道紧密连接蛋白zo-1等，从而改善肠道通透性，通过降低内毒素受体tlr4的表达，降低炎症因子il-6。通过盲肠微生物16srrna测序考察细胞nafld建模以及加入植物乳杆菌后能否改变肠道菌群的组成，结果表明lp10具有修复细胞损伤的作用，减少炎症反应，从而改善非酒精性脂肪肝。附图说明图1显示构建hepg2细胞非酒精性脂肪肝模型情况；图2显示菌体与产物对模型细胞降脂效果；图3显示lp10在降低脂肪合成基因以及炎症基因的表达情况；图4显示凋亡途径检测植物乳杆菌lp10的作用方式；图5显示组织病理观察结果；图6显示lp10干预肝组织脂代谢相关基因qpcr结果；图7显示lp10干预结肠组织脂代谢相关基因qpcr结果。植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)lp10的保藏编号为cgmccno.17956，其于2019年06月18日保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。具体实施方式本发明所用菌株lactobacillusplantarum10，即lp10。实施例1利用油酸建立肝癌细胞hepg2非酒精性脂肪肝模型，油酸的浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6mmol/l，红油染色观察细胞中油酸的积累，结果如图1中a所示。测定上述各浓度油酸对细胞的损伤的情况，结果如图1中b所示。从以上两个方面筛选出建立非酒精性脂肪肝的油酸的最佳浓度为0.2mmol/l，hepg2细胞积累甘油三酯并对细胞损伤小。将植物乳杆菌lp10以及2h代谢产物作用于模型细胞2h，测定其中的甘油三酯浓度。将实验分为若干组，其中，ct:对照组，未加油酸；0.2：为0.2mmol/l油酸诱导下的模型组；实验组1*108：lp10作用的活菌数为1*108cfu/ml；实验组1*109：lp10作用的活菌数为1*109cfu/ml。如图2所示，与模型组相比，lp10能降低甘油三酯浓度。1.1考察植物乳杆菌lp10降脂的作用机制为探索植物乳杆菌降脂的作用机制，设计脂肪酸合成路径引物(srebp-1、acaca、fas)、脂肪酸代谢氧化途径(cpt)、炎症路径(il-6)、抗氧化路径(pparα、nrf2)、angpl4、pnpla3，实时定量pcr探明植物乳杆菌的可能作用机制，设计引物序列如下：表1引物序列表引物名称正向反向srebp-15’-cagactcgctgcttctgaca-3'5'-ggactgttggccaagatggtt-3'acaca5'-ccgaacagtagaactaagtatccc-3'5'-catccacaatgtaagcaccaa-3'fas5'-acagcggggaatgggtact-3'5'-gactggtacaacgagcggat-3'cpt-1α5'-tccagttggcttatcgtggtg-3'5'-cgtttccagagtccgattgattt-3'il-65’-acagccactcacctcttc-3'5'-aagtctcctcattgaatccag-3'ppara5'-cagttctggaggctgggaag-3'5'-caccatcgcgaccagatgg-3'图3显示了植物乳杆菌降低脂肪合成基因以及炎症基因的表达，其降脂作用与这两方面作用密切相关。甾醇调节元件结合蛋白1(srebp-1)参与到肝中脂质合成的调节，同时调节acaca和fas，脂质合成的关键酶，其中模型组srebp-1，acaca与对照组相比显著升高，但在lp10菌体和产物的作用下降低，说明脂质合成降低；肝细胞损伤有低炎症，结果发现在lp10菌体和产物作用下，与模型组相比，tnfα和il-6显著降低，抑制了炎症反应。由于非酒精性脂肪肝中往往伴随着脂质合成增加和长期的低炎症反应，因而处理组脂质合成路径中相关酶及炎症因子降低与降脂密切相关。1.2检测植物乳杆菌是否对凋亡途径起作用。将实验分为ck组、模型组和lp10处理组，当细胞聚合度为70-80％时，加入lp10过滤除菌的代谢产物，放置37℃培养箱作用2h后，用annexinv-egfp/pi双染细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。如图4所示，在模型组中，有大量细胞pi着色，lp10处理后，pi着色细胞变少，而av染色在各组之间没有区别，因而，lp10的作用是抑制炎症反应，而不是凋亡。实施例2制备lp10菌剂将植物乳杆菌lp10按3％接种量接种于mrs培养基中，37℃静置培养24h，5000rpm，10min收集菌体，并用0.9％生理盐水清洗3次，通过10倍稀释法对lp10进行活菌计数，利用生理盐水调节lp10的活菌数为1*1010cfu/ml，以便饲喂用。实施例3动物实验购买7周雌性昆明小鼠36只，普通饲料喂食一周，随机分为2组，一组9只普通饲料饲喂(ct组)，另27只给予高脂饲料，自由采食与饮水。饲喂2个月后，将高脂组随机分为2个亚组，每组9只，hf组(继续高脂饮食)，处理组分为低剂量组和高剂量组：hf10l(hf+5*108cfu/mllp10)，hf10h(hf+5*109cfu/mllp10)，ct与hf分别灌胃等量体积的生理盐水，每天灌胃持续8周。每周测定体重和采食量，试验结束，全部试验小鼠饥饿6h，眼眶采血，收集血清，脱臼致死，收集肝脏、结肠、盲肠、脾等组织液氮速冻，-80℃储存。3.1测定生长性能生长性能结果如表2：表2生长性能结果组别初始体重(g)最终体重(g)增重(g)肝脏重量(g)脂肪重量(g)ct42.24±0.42b44.15±0.42c1.92±0.14c1.69±0.16b3.79±1.66bhf47.83±0.59a53.15±0.84a5.32±0.48a1.97±0.17a8.01±2.45ahf10l47.73±0.41a50.69±0.45b2.96±0.44b1.74±0.17b7.12±1.36ahf10h47.78±0.35a52.91±0.59a5.13±0.43a1.84±0.18ab6.67±2.00apvalue<0.0001<0.0001<0.00010.00580.0004有表2可知，模型组与ct相比，小鼠增重，肝重和脂肪重显著增加，经植物乳杆菌lp10灌胃后，小鼠增重、肝重和脂肪重显著降低。因此，植物乳杆菌lp10具有减轻脂肪肝的作用。3.2血清及肝脏生物化学标记分析血清与匀浆的肝脏经自动化生化分析仪，检测结果见表3与表4。表3肝生化检测结果表4血清生化检测结果由表3、4数据可知，模型组与对照ct组相比，肝与血清中的甘油三酯显著升高，在植物乳杆菌lp10处理组中，甘油三酯含量显著降低。丙氨酸转氨酶是肝损伤的标记物，在植物乳杆菌lp10处理后，丙氨酸转氨酶水平显著降低。因此，植物乳杆菌lp10具有缓解脂肪肝与肝损伤的作用。3.3肝脏组织病理学观察分析小鼠肝组织经苏木精和曙红(h&e)染色。结果如图5所示，hf组有严重的肝脂肪变性有明显的脂滴和泡状结果，经过植物乳杆菌lp10干预后，肝脂肪变性的性状得到了改善与缓解，植物乳杆菌可有效修复肝脏损伤，缓解脂肪细胞肥大的症状。3.4rt-qpcr脂代谢相关基因的表达肝甘油三酯的积累主要源于脂肪酸的不平衡，脂肪酸吸收、脂肪酸重新合成、脂肪酸氧化和脂肪酸转运，设计引物ppara(能量代谢路径)、srebp-1，dgat1(合成途径)、cpt1-α(β-氧化途径)、zo-1(肠上皮细胞紧密连接)以及受体tlr4，il-6(炎症路径)变化。表5引物序列表结果如图6、7所示，lp10在两个剂量组中脂肪生成调节基因srebp-1显著降低，结肠组织紧密连接zo-1显著升高，il-6降低，提示植物乳杆菌通过下调脂肪合成基因表达，降低炎症共同作用改善肝脏脂肪积累。3.5考察植物乳杆菌定植情况采用real-timepcr方法测定第三周和第七周粪便中的乳酸菌，检测乳酸菌相对于粪便总菌16srrna的量。所用引物序列如下：表6pcr扩增粪便中乳酸菌所用引物引物名称正向反向lpspp5’-agcagtagggaatcttcca-3’5’-attycaccgctacacatg-3’eub3385’-actcctacgggaggcagcag-3’5’-attaccgcggctgctgg-3’3.6肝脏代谢分析通过uhplc-q-tofms技术对小鼠肝脏代谢物进行分析，结果如表7、8所示：表7小鼠肝脏中胆碱及其中间代谢产物数据由表7可知，在模型组中，胆碱的中间代谢产物含量显著升高，经lp10处理后，中间代谢产物显著降低，趋向对照组ct，表明lp10在脂质运输中起作用，从而具有更少的胆碱中间代谢产物。表8小鼠肝脏中糖类代谢数据由表8可知，与模型组相比，lp10处理后，糖类物质显著降低，这部分糖类主要用于提供代谢的能量，降低胰岛抵抗和增加肠壁的完整性中起作用。因此，从肝代谢组数据判断降脂作用的路径主要在胆碱路径和糖路径。当前第1页12