基于双匙解锁机制检测miRNA的试剂盒及应用的制作方法

本发明属于检测用试剂盒领域，具体涉及一种基于“双匙解锁机制”检测mirna的试剂盒及应用。

背景技术：

微小rna(mirna)是一种具有短长度(约22个核苷酸)的内源性非编码小分子，并与信使rna结合以参与转录后水平的基因表达调控。大量的研究表明，多种mirna的异常表达与各种疾病，特别是人类肿瘤和癌症密切相关。例如，mirna-21和mirna-141是常见人类癌症中过表达的上皮相关mirna，包括乳腺癌，肺癌和前列腺癌等。实现mirna的高通量同检有助于提高检测的准确性。目标mirrna-21和mirna-141作为重要肿瘤标志物可用于肿瘤的的诊断，治疗和预后，具有重要的临床意义。然而，由于其低浓度，小尺寸和高同源性等特征，实现其简单、准确、特异及灵敏的检测仍是一项巨大的挑战。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于“双匙解锁机制”检测mirna的试剂盒及应用。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种基于“双匙解锁机制”检测mirna的试剂盒，包括荧光编码“锁状”探针、信号富集探针以及双链特异性核酸酶；所述的荧光编码“锁状”探针为氨基化茎环dna(dna-21:cctcaacatcagtctgataagctagttgaggttttttttttt-nh2，dna-141：attgtgacagaccatttctaccacaattttttttttttt-nh2)与羧基化荧光编码纳米微球(北京华泰昕，红色：cat.no.qdscf20050，绿色：cat.no.qdscf10050)偶联得到；所述的信号富集探针为氨基化单链dna(生工，ssdna-21：aaaacctcaacc-nh2，ssdna-141：aaaaattgtttt-nh2)与羧基化聚苯乙烯微球(天津倍思乐色谱技术开发中心，cat.no.6–3-1000)偶联得到。偶联剂为edc。

所述的试剂盒采用下述方法使用：

1)“双钥解锁”及靶标循环回收：mirna与所述的荧光编码“锁状”探针中的茎环dna互补配对，然后加入双链特异性核酸酶特异性切割杂交链中的dna，在mirna/dsn“双钥”作用下，解锁荧光编码“锁状”探针，并引发靶标循环反应，实现信号放大；

2)信号富集扩增及流式微球定量：解锁的荧光编码探针中的dna单链与所述的信号富集探针中dna单链互补配对，将荧光信号富集于比表面积较大的聚苯乙烯微球表面，实现信号富集扩增；无需多次清洗纯化步骤，直接将富集荧光信号的聚苯乙烯微球进行流式分析，实现定量检测。

优选的，所述的荧光编码“锁状”探针的制备具体的包括下述步骤：将羧基化荧光纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应15-30分钟，然后加入氨基化茎环dna，室温下反应过夜；反应结束后，采用离心分离进行纯化，用pbs缓冲液至少清洗三次以除去未反应的茎环dna，得到荧光编码“锁状”探针。

优选的，所述的信号富集探针采用下述方法制备：(1)将羧基化聚苯乙烯微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1-4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应15-30分钟，然后加入氨基化单链dna，室温下反应过夜；反应结束后，采用离心分离进行纯化，用pbs缓冲液至少清洗三次以除去未反应的单链dna，得到信号富集探针。

优选的，“双钥解锁”及靶标循环回收的具体步骤为：将荧光编码“锁状”探针、待检mirna按照体积比为1-3:1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.1-0.6u双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，35-60℃下反应20-120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，使酶失活。

优选的，富集扩增及流式微球定量的具体步骤为：加入信号富集探针加入5-30微升，使dna进行互补配对，实现荧光信号富集，并用流式进行微球荧光定量分析。

本申请还包括一种所述的基于“双匙解锁机制”检测mirna的试剂盒的应用，用于检测mirna-21、mirna-141或者混合同检。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明基于dsn-mirna双重解锁机制及信号富集扩增策略，结合流式荧光微球编码技术，实现了mirna-21及mirna-41的分检以及同检研究。

双链特异性核酸酶dsn是一种热稳定性核酸酶，能够选择性地切割降解双链dna和dna-rna杂交体中的dna，而对rna或者单链dna几乎没有作用。此外，这种降解作用仅针对于至少12个完全匹配的核苷酸序列，因此它具有高度特异性。本申请设计了荧光纳米球标记的分子信标作为“锁”结构，只有dsn-mirna“双钥”存在时，mirna基于碱基互补配对打开分子信标成为直链结构，此时dsn才能够特异性切割分子信标，将“锁”结构打开，标记荧光纳米球dna释放，保证了实验的特异性。

而基于dsn辅助靶标循化回收及信号富集扩增策略，提高了检测的灵敏度；基于流式微球编码技术，实现待检物的高通量同检研究。该方法操作简便，无需复杂的清洗分离等步骤，且具有低基质效应，为肿瘤的早期监测及预后治疗提供了良好的应用前景。

本发明制备的一种基于“双钥解锁机制”的mirna高通量检测研究及应用优势在于：1、本发明构建了一种“双钥解锁”微纳生物传感器，基于dsn-mirna双重解锁，保证了实验的特异性；2、基于dsn辅助靶标循化回收及信号富集扩增策略，提高了检测的灵敏度；3、基于流式微球编码技术，实现待检物的高通量同检研究。4、该传感操作简便，无需复杂的清洗分离等步骤，且具有低基质效应，成功应用于乳腺癌病人全血样品的分析检测，为肿瘤的早期监测及预后治疗提供了良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明制备的进行mirna-21的检测的红色荧光编码“锁状”探针示意图以及dna-21含量图。

图2为本发明基于不同双链特异性核酸酶的酶量进行mirna-21检测图。

图3为本发明基于不同信号富集探针量进行mirna-21检测图。

图4为本发明实施例12用于mirna-21的检测图。图4a为荧光强度值变化对，mirna-21的定量检测；图4b为mirna-21检测的标准曲线。

图5为本发明实施例15用于mirna-21与mirna-141的单独与同时检测研究。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：

将羧基化荧光纳米球(红色，cat.no.qdscf20050，市购)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：4比例混合于磷酸缓冲液中，室温下反应15-30分钟，然后加入氨基化茎环dna-21(5’-3’，cctcaacatcagtctgataagctagttgaggttttttttttt-nh2)，室温下反应过夜；

(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用pbs缓冲液至少清洗三次以除去未反应的茎环dna-21，得到红色荧光编码“锁状”探针。

(3)将探针沉淀及上清于nanodrop进行dna-21浓度检测，探究探针dna-21偶联量。

(4)将羧基化聚苯乙烯微球(cat.no.6–3-1000，市购)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：4比例混合于磷酸缓冲液中，室温下反应15-30分钟，然后加入氨基化单链dna(ssdna-21：5’-3,aaaacctcaacc-nh2)，室温下反应过夜；反应结束后，采用离心分离进行纯化除去未反应的ssdna-21，得到信号富集探针-21。

图1a是本发明制备的进行mirna-21的检测的红色荧光编码“锁状”探针的原理图解，图1b是探针偶联dna-21量的测定。由图1b可以看出，荧光编码纳米球本身不含有dna-21，偶联后探针含有dna-21，说明纳米球表面已成功偶联dna-21；离心上清也含有dna-21，说明在此浓度下，可获得dna-21在纳米球的最大偶联量。

(4)将红色荧光编码“锁状”探针、待检mirna按照体积比为1:1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.1u双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，35-60℃下反应20-120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活。加入信号富集探针-21(实施例1制备得到)20微升，使dna进行互补配对，实现荧光信号富集，并用流式进行微球荧光定量分析，实现mir-21的定量检测。

由图2可知，加入0.1u双链特异性核酸酶，荧光值较低，此酶量不是最佳反应量。

实施例2：

将羧基化荧光纳米球(绿色，cat.no.qdscf10050)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：4比例混合于磷酸缓冲液中，室温下反应15-30分钟，然后加入氨基化茎环dna-141(5’-3’，attgtgacagaccatttctaccacaattttttttttttt-nh2)，室温下反应过夜；

(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用pbs缓冲液至少清洗三次以除去未反应的茎环dna-141，得到绿色荧光编码“锁状”探针。

(3)将羧基化聚苯乙烯微球(cat.no.6–3-1000，市购)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：4比例混合于磷酸缓冲液中，室温下反应15-30分钟，然后加入氨基化单链dna(ssdna-141：5’-3,aaaaattgtttt-nh2)，室温下反应过夜；反应结束后，采用离心分离进行纯化，除去未反应的ssdna-141，得到信号富集探针-141。

(4)将绿色荧光编码“锁状”探针、待检mirna按照体积比为1:1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.1u双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，35-60℃下反应20-120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活。加入信号富集探针-141(实施例1制备得到)20微升，使dna进行互补配对，实现荧光信号富集，并用流式进行微球荧光定量分析，实现mir-141的定量检测。

实施例3-7：实施例3-7与实施例1的红色荧光编码“锁状”探针的制备方法相同，区别仅在于，双链特异性核酸酶的加入量不同。实施例3为对应0.2u双链特异性核酸酶；实施例4对应0.3u双链特异性核酸酶；实施例5对应0.4u双链特异性核酸酶；实施例6对应0.5u双链特异性核酸酶；实施例7对应0.6u双链特异性核酸酶；如图2示，当加入双链特异核酸酶0.5u时，获得荧光强度达到最大值，酶量加大至0.6u时，荧光强度未明显增高，且趋于平台趋势。因此，0.5u双链特异性核酸酶为最佳酶量，用于后续实验。

实施例8-14：实施例8-13与实施例6的区别仅在于信号富集探针的加入量不同，实施例8对应加入5微升信号富集探针、实施例9对应加入5微升信号富集探针、实施例10对应加入10微升信号富集探针、实施例11对应加入15微升信号富集探针、实施例12对应加入20微升信号富集探针、实施例13对应加入25微升信号富集探针,实施例14对应加入30微升信号富集探针，由图3可知，在信号富集实验加入信号富集探针20微升(即实施例12)，荧光强度达到最大值，20微升信号富集探针为最佳用量，用于后续实验。

实施例15：

(1)将红色荧光编码“锁状”探针(实施例1制备得到)、绿色荧光编码“锁状”探针(实施例2制备得到)、空白样品按照体积比为1：1：2比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.5u双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，35c-60℃下反应20-120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活。加入信号富集探针-21(实施例1制备得到)、信号富集探针-141(实施例2制备得到)各20微升，使dna进行互补配对，实现荧光信号富集，并用流式进行微球荧光定量分析。

(2)将红色荧光编码“锁状”探针(实施例1制备得到)、绿色荧光编码“锁状”探针(实施例2制备得到)、mirna-21样品、空白样品按照体积比为1：1：1：1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.5u双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，35-60℃下反应20-120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活。加入信号富集探针-21(实施例1制备得到)、信号富集探针-141(实施例2制备得到)各20微升，使dna进行互补配对，实现荧光信号富集，并用流式进行微球荧光定量分析。

(3)将红色荧光编码“锁状”探针(实施例1制备得到)、绿色荧光编码“锁状”探针(实施例2制备得到)、空白样品、mirna-141样品按照体积比为1：1：1：1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.5u双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，35c-60℃下反应20-120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活。加入信号富集探针-21(实施例1制备得到)、信号富集探针-141(实施例2制备得到)各20微升，使dna进行互补配对，实现荧光信号富集，并用流式进行微球荧光定量分析。

(4)将红色荧光编码“锁状”探针(实施例1制备得到)、绿色荧光编码“锁状”探针(实施例2制备得到)、mirna-21、mirna-141样品按照体积比为1：1：1：1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.5u双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，35-60℃下反应20-120分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，将双链特异性核酸酶灭活。加入信号富集探针-21(实施例1制备得到)、信号富集探针-141(实施例2制备得到)各20微升，使dna进行互补配对，实现荧光信号富集，并用流式进行微球荧光定量分析。

由图5可知，当只加入空白样品，未加入mirna-21与mirna-141时，fl1、fl2两通道均未检出荧光信号，两种mirna含量均未检出；当加入只mirna-21时，只有检测mirna-21含量的fl1通道荧光值达到2300，而检测mirna-141含量的fl2通道荧光值极低，说明可成功用于mirna-21的检测；当加入只mirna-141时，只有检测mirna-141含量的fl2通道荧光值达到700，而检测mirna-21含量的fl2通道荧光值极低，说明可成功用于mirna-141的检测；当同时加入mirna-21与mirna-141时，两通道均检测出荧光，且与单独加入时荧光强度相差不大，说明可成功应用于mirna-21与mirna-141的同时检测。

本发明基于“双钥解锁机制”实现了对mirna-21和mirna-141的同检研究。本研究设计了荧光纳米球标记的分子信标作为“锁”结构，只有dsn-mirna“双钥”存在时，mirna基于碱基互补配对打开分子信标成为直链结构，此时dsn才能够特异性切割分子信标，将“锁”结构打开，标记荧光纳米球dna释放，保证了实验的特异性。解锁后，待检物mirna不被割游离出来，dsn辅助靶标循环，实现信号第一重放大；而标记荧光纳米球的dna富集在微球载体上，实现信号的第二重放大，提高了检测的灵敏度。最后基于流式荧光微球编码及检测技术，实现了mirna的高通量定量检测。本发明能够很好地区分了微小rna家族成员之间的差异；整个检测过程，操作简便，快速检测，适合高危人群的社区肿瘤筛选，建立了一种肿瘤检测的新方法，并且可用于肿瘤与癌症的的诊断，治疗和预后，在生物医学研究和临床诊断中具有很大的应用价值。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。