用于检测运动性猝死相关基因的探针、基因芯片及试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测
技术领域：
，特别涉及用于检测运动性猝死相关基因的探针、基因芯片及试剂盒。
背景技术：
：剧烈运动或情绪过分激动可诱发晕厥或猝死。其中肥厚性心肌病(hcm)和qt间期(心室去极化和复极化过程的总时程)延长综合征(lqts)是与运动有关的晕厥或猝死的主要原因，且上述病症均与遗传有关。据欧美研究显示，在35岁以下的年轻人或运动员中，hcm是最常见的猝死原因，占到约1/500。目前已发现或鉴定了与hcm有关的基因突变多达900多种，分别分布在13个编码心脏肌节蛋白的基因上，主要的基因有myh7(编码β-肌球蛋白重链)、mybpc3(编码肌球蛋白结合蛋白c)和tnnt2(编码心肌肌钙蛋白t)等。对于hcm，临床或法医报道均呈个案或家系报告，目前无任何一个单独的基因或一个单独的突变能特异性地准确预测携带者的临床表型及其风险程度，有些个案病例甚至为多基因、多突变合并存在。但双突变比单个突变更凶险；myh7突变的危害明显大于mybpc3突变的危害。现结合pubmed上检索的在中国人群的报告，建议用于检测的位点如下：1.myh7基因已报告与晕厥或猝死的相关基因突变：n391t、i736t、p731s、r723g、r719q、r663h等。2.mybpc3是一种相对分子质量约为150000的粗肌丝结合蛋白，mybpc3突变所致的hcm占病例的20％-25％，mybpc3基因已报告与晕厥或猝死的相关基因突变：y842x等。在lqts中，多个基因中的多种突变均能导致lqts。其中，lqt1(1型长qt综合症)影响约50％的lqt基因突变携带者，kcnq1是其致病基因，可导致男性青少年在运动、特别是在游泳过程中出现晕厥、猝死或溺亡；lqt2(2型长qt综合症)是中国人群中最常见的lqt亚型，影响约40％的携带者，致病基因为kcnh2，主要影响女性，表现为在夜间大噪音时可诱发晕厥或猝死；lqt3(3型长qt综合症)影响约10％的携带者，致病基因为scn5a，多见于成年男性，表现为在睡梦中发生晕厥或猝死。可见，在静息或睡眠中引发晕厥或猝死的基因多是lqt2和lqt3，故后两者均与运动诱发晕厥或猝死关系不太大。现结合pubmed上检索的在中国人群的报告，建议用于检测的位点如下：可诱发晕厥或猝死的kcnq1的突变有：r190w、r380s、w305l等。儿茶酚胺源性(或交感神经源性)多发性室性心动过速(cpvt)也与晕厥或猝死的发生有关。ryr2受体(心脏钙离子释放通道)基因(或cpvt-1型相关基因)的突变与50％以上的cptv病例发生有关。该病症始于青少年时期，在运动或情绪激动等应激情况下突然出现晕厥反复发作、意识丧失、甚至心脏猝死。ryr2基因已报道的snp位点主要有r2401h。目前在心源性猝死突变基因检测方面虽有部分研究，但更多的与猝死有关的基因检测尚未开展研究。因此，提供一种更优秀的用于检测运动猝死相关基因的探针、基因芯片及试剂盒是十分有必要的。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种用于检测运动猝死相关基因的探针、基因芯片及试剂盒。本发明具有特异性高、准确性好和可一次性快速检测多位点的优点。一种用于检测运动猝死相关基因的探针，所述探针的序列为：i736i探针：gttcattgatagcagga；i736t探针：gttcactgatagcagga；p731p探针：agcggccatccctgaggg；p731s探针：agcggccatctctgaggg；r723r探针：cctcaggtatcgcatcct；r723g探针：cctcaggtatggcatcct；r663r探针：caacttgcgctccaccca；r663h探针：caacttgcactccaccca；y842y探针：gtgtacgagatgcgcgtc；y842x探针：ggtgtaggagatgcgcgt；r190r探针：ctctgggggcggctgcgc；r190w探针：ctctgggggtggctgcgc；w305w探针：cgctgtggtggggggtgg；w305l探针：cgctgtggttgggggtgg；r2401r探针：ctcttgggacgctgtgctc；r2401h探针：ctcttgggacactgtgctc。一种用于检测运动猝死相关基因的基因芯片，含有上述的探针。一种用于检测运动猝死相关基因的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：(1)在衬底上镀膜，得到生物传感器；(2)在生物传感器上覆盖涂层，经6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐处理后，水洗；(3)将经修饰的探针点样在生物传感器上，制得基因芯片。优选的，步骤(1)中所述衬底为硅片(si)，硅片的厚度为2.5mm，直径为20-25cm。优选的，步骤(1)中镀膜为在硅片上镀上厚度为45-50nm的氮化硅及12-15nm的tsps(t结构聚氨二甲基硅烷烃)薄膜。优选的，步骤(2)中所述涂层为多聚苯丙氨酸-赖氨酸涂层，多聚苯丙氨酸-赖氨酸涂层的厚度为15nm；6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐的浓度为1-10μmol/l，6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐处理的时间为15-25min。优选的，步骤(3)中采用醛基或氨基对探针的一端进行修饰。一种用于检测运动性猝死相关基因的试剂盒，包括所述基因芯片、pcr反应体系、杂交缓冲液、洗涤液、bw反应液(辣根过氧化物酶+柠檬酸钠缓冲液)和tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液。优选的，所述pcr反应体系包括以下组分：5×buffer，dutpmix，f-引物，r-引物，hottaq，ung酶(尿嘧啶dna糖基化酶)和ddh2o(双蒸水)。pcr反应体系中加入ung酶能够去除扩增产物污染，减少假阳性结果。优选的，所述f-引物的序列为：663-f：5'-tgcatctctttctggcatt-3'；723/731/736-f：5'-tctatgggcagagcagatcac-3'；842-f：5'-tgcggctgaacttcgacc-3'；190-f：5'-gagtacgtggtccgcct-3'；305-f：5'-catcttctcctcgtactttgtg-3'；2401-f：5'-ggaacgcgatgacc-3'。优选的，所述r-引物的序列为：663-r：5'-cctcacctggagactttg-3'；723/731/736-r：5'-actggttgtgatcaatgtccag-3'；842-r：5'-aggctcaccgataggcat-3'；190-r：5'-tccacagggcaggcatgactc-3'；305-r：5'-caccagtgcccagatgtc-3'；2401-r：5'-atgctgttatgctctttgac-3'。优选的，所述杂交缓冲液包括0.3mol/l柠檬酸三钠、3mol/l氯化钠、0.3mol/l十二烷基硫酸钠和tritonx–1000.1％水溶液。优选的，所述洗涤液为0.1×ssc溶液。一种运动性猝死相关基因的检测方法，采用所述试剂盒进行检测，包括以下步骤：(1)将待测物加入至pcr反应体系中进行扩增，得到pcr扩增产物；(2)在基因芯片上加入pcr扩增产物和杂交缓冲液，进行反应；(3)用0.1×ssc溶液对基因芯片进行洗涤，洗涤后风干；(4)取bw反应液于基因芯片上，在室温条件下反应；(5)加入tmb显色液进行显色，加入tmb显色液的前后均使用0.1×ssc溶液对基因芯片进行洗涤并风干，通过拍照或肉眼读取检测结果。所述待测物中含有dna片段。用所述试剂盒与待测物进行的检测为杂交反应，当待测物中含有与探针能特异性结合的目的基因的snp(单核苷酸多态性)位点时，该探针所对应基因芯片区域显蓝色。优选的，步骤(1)中扩增的条件为：95℃反应10min；94℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸30s，重复40个循环；72℃延伸5min。优选的，步骤(2)中pcr扩增产物的加入量为10μl，杂交缓冲液为100μl；反应的条件为：在50-60℃的条件下反应30-60min。优选的，步骤(3)中0.1×ssc溶液的温度为50℃，进行洗涤的时间为1min。优选的，步骤(4)中bw反应液的加入量为100μl，反应时间为10min。优选的，步骤(5)中tmb显色液的加入量为100μl，反应时间为5min；用0.1×ssc溶液在加入tmb显色液的前后各洗涤3次，每次1min。相对于现有技术，本发明的有益效果如下：(1)采用基因芯片的方法，实现了运动性猝死相关基因的一次性多位点测定，减少了检测时间和成本；(2)本发明通过特异性探针和引物的选择，结合基因芯片的方法，具有特异性好、准确性高和快速方便的优势；(3)通过基因芯片的可见光光学放大，能达到较高的信号分辨率；(4)检测结果可由拍照或肉眼直接读取，简单方便。附图说明图1为本发明实施例1-2制得的基因芯片和试剂盒对含有质粒1、3、5、7、9、11、13、15的混合质粒的检测结果；图2为本发明实施例1-2制得的基因芯片和试剂盒对含有质粒2、4、6、8、10、12、14、16的混合质粒的检测结果；图3为本发明实施例1-2制得的基因芯片和试剂盒对含有质粒1-16的混合质粒的检测结果。具体实施方式为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。实施例1一种用于检测运动性猝死相关基因的探针，其探针的序列为：i736i探针：gttcattgatagcagga；i736t探针：gttcactgatagcagga；p731p探针：agcggccatccctgaggg；p731s探针：agcggccatctctgaggg；r723r探针：cctcaggtatcgcatcct；r723g探针：cctcaggtatggcatcct；r663r探针：caacttgcgctccaccca；r663h探针：caacttgcactccaccca；y842y探针：gtgtacgagatgcgcgtc；y842x探针：ggtgtaggagatgcgcgt；r190r探针：ctctgggggcggctgcgc；r190w探针：ctctgggggtggctgcgc；w305w探针：cgctgtggtggggggtgg；w305l探针：cgctgtggttgggggtgg；r2401r探针：ctcttgggacgctgtgctc；r2401h探针：ctcttgggacactgtgctc。一种含有上述用于检测运动性猝死相关基因的探针的基因芯片，其制备过程包括以下步骤：通过旋转真空镀膜机和真空气相沉淀法在厚度约为2.5mm，直径20cm的硅片(si)上镀上厚度为47.5nm的氮化硅及13.5nm的tsps的薄膜，制备出相应的生物传感器，并覆盖15nm的多聚苯丙氨酸-赖氨酸涂层，最后经过10μmol/l6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐处理20分钟，用清水洗净芯片。将上述用于检测运动性猝死相关基因的探针的5'端用醛基修饰后，将探针点样至处理好的芯片上，在室温下反应，制备出包含探针的基因芯片。每种探针在芯片上设置三个平行，故探针在芯片上的排列方法如表1所示：表1：基因芯片探针点样排列质控探针为polya，其序列为aaaaaaaaaaaaaaaaaa。质控探针在基因芯片上不仅起定位作用，而且起质控作用。当检测结果在质控探针点样处不显色时，证明该基因芯片失效。实施例2一种用于检测叶酸基因多态性的试剂盒，包括实施例1中的基因芯片、pcr反应体系、杂交缓冲液、洗涤液、bw反应液和tmb显色液。其中pcr反应体系的组成如表2所示：表2：pcr反应体系组成其中pcr反应体系中f-引物的序列为：663-f：5'-tgcatctctttctggcatt-3'；723/731/736-f：5'-tctatgggcagagcagatcac-3'；842-f：5'-tgcggctgaacttcgacc-3'；190-f：5'-gagtacgtggtccgcct-3'；305-f：5'-catcttctcctcgtactttgtg-3'；2401-f：5'-ggaacgcgatgacc-3'。其中pcr反应体系中r-引物的序列为：663-r：5'-cctcacctggagactttg-3'；723/731/736-r：5'-actggttgtgatcaatgtccag-3'；842-r：5'-aggctcaccgataggcat-3'；190-r：5'-tccacagggcaggcatgactc-3'；305-r：5'-caccagtgcccagatgtc-3'；2401-r：5'-atgctgttatgctctttgac-3'。其中杂交缓冲液包括0.3mol/l柠檬酸三钠、3mol/l氯化钠、0.3mol/l十二烷基硫酸钠和tritonx–1000.1％水溶液。其中洗涤液为0.1×ssc溶液。其中hot-taq酶、dutp、ung酶均购自深圳菲鹏生物股份有限公司。其中引物、探针为自行设计，由上海生工生物工程有限公司合成。实施例3采用实施例1-2中制得的基因芯片和试剂盒进行检测，待检测物为含有目标基因的snp位点的质粒，质粒的类型如表3所示：表3：质粒类型质粒含有的目的基因snp位点质粒1myh7r663r质粒2myh7r663h质粒3myh7r723r质粒4myh7r723g质粒5myh7p731p质粒6myh7p731s质粒7myh7i736i质粒8myh7i736t质粒9mybpc3y842y质粒10mybpc3y842x质粒11kcnq1r190r质粒12kcnq1r190w质粒13kcnq1w305w质粒14kcnq1w305l质粒15ryr2r2401r质粒16ryr2r2401h以上质粒均由上海生工生物工程有限公司合成和提供。将质粒1、3、5、7、9、11、13、15混合，得到混合质粒，将混合质粒用1mlte缓冲液溶解，使得质粒的浓度为2μg/ml即2000ng/ml。取5μl质粒溶液作为待测物加入pcr反应体系中，使得反应总体积为50μl，制得pcr反应混合液。将上述pcr反应混合液放入pcr仪进行pcr扩增，pcr扩增的条件为：95℃反应10min；94℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸30s，重复40个循环；72℃延伸5min。扩增完成后，将pcr扩增产物95℃加热3分钟，迅速置于冰上；取10μlpcr扩增产物至所制得芯片上；取100μl杂交缓冲液于芯片上，在55℃反应60分钟；将芯片置于50℃的0.1×ssc溶液中洗涤1min，对芯片表面进行风干；取100μlbw反应液于芯片上，室温下反应10分钟；用0.1×ssc溶液清洗芯片3次，每次1分钟，对芯片表面进行风干；取100μltmb显色液于芯片表面，反应5分钟；用0.1×ssc溶液清洗芯片3次，每次1分钟，对芯片表面进行风干，通过拍照或肉眼读取检测结果。检测结果如图1所示，i736i探针、p731p探针、r723r探针、r663r探针、y842y探针、r190r探针、w305w探针和r2401r探针在基因芯片的点样处(分别为区域1-8)均显蓝色，质控探针点样处(区域a)也显蓝色。证实采用实施例1-2制备的基因芯片和试剂盒，能够准确地对r663r、r723r、p731p、i736i、y842y、r190r、w305w、r2401r位点进行检测。探针处显色即证明待测物中含有与该探针特异性结合的snp位点，例如区域3和5中存在平行位点虽显色较浅，但仍有显色，显色的深浅不会影响检测结果。实施例4实施例4与实施例3基本相同，区别之处仅在于，所用待测物为含有质粒2、4、6、8、10、12、14、16的混合质粒。采用实施例1-2制得的基因芯片和试剂盒对该待测物进行检测。检测结果如图2所示，i736t探针、p731s探针、r723g探针、r663h探针、y842x探针、r190w探针、w305l探针和r2401h探针在基因芯片的点样处(分别为区域9-16)均显蓝色，质控探针的点样处(区域a)也显蓝色，证实采用实施例1-2制备的基因芯片和试剂盒可以准确地对i736t、p731s、r723g、r663h、y842x、r190w、w305l、r2401h位点进行检测。实施例5实施例5与实施例3基本相同，区别之处仅在于，所用待测物为含有质粒1-16的混合质粒。采用实施例1-2制得的基因芯片和试剂盒对该待测物进行检测。检测结果如图3所示，i736i探针、p731p探针、r723r探针、r663r探针、y842y探针、r190r探针、w305w探针、r2401r探针、i736t探针、p731s探针、r723g探针、r663h探针、y842x探针、r190w探针、w305l探针和r2401h探针在基因芯片的点样处(分别为区域1-16)均显蓝色，质控探针点样处(区域a)也显蓝色，证实采用实施例1-2制备的基因芯片和试剂盒，在16种类别质粒混合的情况下，也具备良好的特异性，同样能得到准确的检测结果。当前第1页12