尖孢镰刀菌TOR基因RNAi载体及其与水杨酸联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法与流程

本发明涉及分子生物学和植物病害防治技术领域，具体涉及一种尖孢镰刀菌tor基因rnai载体及其与水杨酸联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法。

背景技术：

马铃薯属于茄科草本植物，块茎可供食用，是仅次于小麦、水稻和玉米之后的全球第四大重要的粮食作物。中国作为世界上重要的马铃薯生产国，马铃薯种植面积和总产一直居世界首位，预计到2020年，中国马铃薯种植面积将扩大到1亿亩以上，平均亩产提高到1300公斤，总产达到1.3亿吨左右，因此我国马铃薯产业的发展必然对世界马铃薯产业产生重要影响。2015年，农业部提出了马铃薯主食产品及产业开发战略，着力推进马铃薯消费由副食向主食转变、由原料产品向产业化系列制成品转变，让马铃薯成为继水稻、小麦、玉米之后的我国第四大主粮作物。

马铃薯枯萎病和干腐病是马铃薯在生长和储存过程中遭受的重要真菌病害。马铃薯枯萎病在美国、乌拉圭、印度、伊朗、意大利等国家都有报道。马铃薯枯萎病在我国的发生也极为广泛，例如：河北、内蒙古、甘肃、新疆、贵州等地都有关于该病的报道。随着我国马铃薯种植面积的不断扩大，连作现象普遍，造成马铃薯枯萎病日益严重，给马铃薯生产造成的损失也愈来愈大。据报道，在贵州的一些种植区马铃薯枯萎病的平均发病率在25％以上；在内蒙古的一些种植区严重地块发病率达78％。据rakhimov和khakimov报道马铃薯枯萎病是由茄病镰刀菌(fusariumsolani)、串珠镰刀菌(fusariummoniliforme)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、接骨木镰刀菌(fusariumsambucinum)、雪腐镰刀菌(fusariumnivale)引起的，1979年首次在希腊发现尖孢镰刀菌可以导致马铃薯枯萎病的发生。在我国引起马铃薯枯萎病的主要病原菌为尖孢镰刀菌(f.oxysporum)。此外，尖孢镰刀菌也是我国马铃薯干腐病的病原菌之一，研究发现河北和内蒙古马铃薯干腐病由4种镰刀菌引起，分别为接骨木镰刀菌(fusariumsambucinum)、锐顶镰刀菌(fusariumacuminatum)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)和芬芳镰刀菌(fusariumredolens)。马铃薯干腐病作为一种在田间和窖储都常发生的块茎病害，其常年发病率达到20％～50％。由于马铃薯种子资源的全国性调运，导致马铃薯干腐病有从局部地区向全国各地发展的趋势。因此，防治尖孢镰刀菌对马铃薯产业来说具有重要的经济价值。

鉴于尖孢镰刀菌的致病力严重且致病面广泛，尖孢镰刀菌已被研究者列为世界上第三大土传病原真菌。而围绕以枯萎病菌的防治为中心开展的尖孢镰刀菌的致病机理、植物的抗病防御、植物与尖孢镰刀菌二者之间的互作机制也已成为植物病理学界的研究热点。tor(targetofrapamycin)是一种存在于真核生物中进化上保守的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶。在多种真核生物中，tor是细胞生长、新陈代谢、营养、能量、激素、胁迫响应等重要的调节因子；tor在酵母、植物、动物和人类进化中是一个保守的主调节因子，它整合营养和能量信号来促进细胞增殖和生长。在植物、酵母和哺乳动物等真核生物中，tor基因的突变都是致死突变。目前对尖孢镰刀菌tor蛋白在其菌丝生长和致病力方面的功能还鲜有报道。

植物激素水杨酸(salicylicacid；sa)在抵御各种病原菌的侵染过程中发挥着关键性的作用，已有的研究报道显示在病原菌侵染植物时，水杨酸通过激活抗病相关基因的表达来抵御病原菌的侵染。但目前还未见报道水杨酸是否直接进入病原菌体内通过抑制关键靶蛋白的活性来杀灭病原菌。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题，提供一种尖孢镰刀菌tor基因rnai载体及其与水杨酸联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法。

本发明实现其目的采用的技术方案如下：

一种尖孢镰刀菌tor基因rnai载体，所述tor基因rnai载体是以植物表达载体pearleygate303为骨架载体，在重组位点处插入seqidno：3所示的序列。

一种含有上述rnai载体的微生物转化体。

上述rnai载体在防治马铃薯干腐病和枯萎病中的应用。

一种尖孢镰刀菌rnai载体和水杨酸联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法，将上述的rnai载体转入马铃薯中得到转基因马铃薯，采用水杨酸处理转基因马铃薯防治马铃薯干腐病和枯萎病。

在上述的方法中，转基因马铃薯在植株生长过程中喷施水杨酸溶液防治干腐病和枯萎病。

本发明的有益效果是：成功构建尖孢镰刀菌tor基因rnai干扰载体，经实验验证发现植物激素水杨酸和fotor12-rnai转基因的联合使用可以非常显著地减弱尖孢镰刀菌的致病力，为防治由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病和干腐病提供了一种有效的方法。水杨酸是由植物产生的一种天然的抗病化合物，不仅能够大幅度减少化学农药的使用，而且将水杨酸可以作为一种潜在的无污染的生物杀菌剂，对维持生态系统的平衡和可持续发展也具有重大的现实意义和经济价值。但是单独使用水杨酸防治尖孢镰刀菌的效果有限，而转基因技术与水杨酸的联合应用，可显著减弱尖孢镰刀菌的致病力，植物枯萎病和干腐病的发生显著减少。

附图说明

图1是不同浓度的水杨酸抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长结果图，其中，a为培养5天后pda平板情况图，b为扫描电镜下菌丝形态图，c为菌落直径结果，d为相对孢子数量结果。

图2是sa减弱尖孢镰刀菌对马铃薯叶片和薯块的致病力结果图，其中，a为尖孢镰刀菌孢悬液接种叶片和薯块培养4天后的情况图，b为坏死斑直径结果，c为菌丝重量结果。

图3是针对fotor的sirnas减弱尖孢镰刀菌对马铃薯叶片和薯块的致病力实验结果图，其中，a为尖孢镰刀菌孢悬液和sirnas混匀后接种叶片和薯块培养4天的情况图，nc为阴性对照，b为坏死斑直径结果，c为菌丝重量结果。

图4是p35s::fotor12-ri干扰载体构建结果图，其中，a为该载体的结构示意图，b为转基因马铃薯植株的pcr鉴定结果。

图5是转基因p35s::fotor12-ri马铃薯植株抑制尖孢镰刀菌的致病力结果图，其中，a为尖孢镰刀菌孢悬液接种转基因马铃薯叶片和薯块培养4天后的情况图，b为坏死斑直径结果，c为菌丝重量结果，d为未接菌阴性对照的马铃薯植株生长情况图，e是接菌后正常培养1一个月的马铃薯生长情况图。

图6是用sa处理的转基因p35s::fotor12-ri马铃薯植株显著的抑制尖孢镰刀菌的致病力结果图，其中，a为尖孢镰刀菌孢悬液和sa混匀后接种转基因马铃薯叶片和薯块培养4天的情况图，b为坏死斑直径结果，c为菌丝重量结果，d为仅使用1mmsa处理的阴性对照组生长情况图，e为尖孢镰刀菌孢悬液和sa混匀后处理的转基因p35s::fotor12-ri马铃薯植株正常培养1一个月的情况图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、植物激素水杨酸(sa)抑制尖孢镰刀菌的菌丝生长和致病力一、用不同浓度的sa在平板上处理尖孢镰刀菌

无菌条件下分别配制0.5mmol/l、1mmol/l、5mmol/l、10mmol/l、15mmol/l不同浓度sa的pda平板，待凝固后用打孔器取一块含有尖孢镰刀菌菌丝的pda培养基放入平板正中间。封口后置于25℃真菌培养箱中培养，每个处理至少3个重复。尖孢镰刀菌培养5天后观察并统计真菌菌丝直径；同时，将培养5天后的尖孢镰刀菌在扫描电镜下观察菌丝形态，结果如图1b所示。根据实验结果发现随着sa浓度的增加，菌丝生长受到的抑制越来越明显，表明sa以剂量依赖性的方式抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长。根据统计的菌丝直径(图1c)可以发现，用sa处理尖孢镰刀菌，ic50(抑制菌丝生长一半时的药物浓度)的药物浓度为5mmol/l；当sa的浓度为10mmol/l时，菌丝完全停止生长，扫描电镜结果显示此时菌丝膨胀扭曲、隔间距缩短。此外，尖孢镰刀菌孢子的产量(图1d)也随着sa浓度的增加而显著的减少。

二、sa抑制尖孢镰刀菌的致病力实验

为了测试sa是否抑制尖孢镰刀菌的致病力，将不同浓度的sa和尖孢镰刀菌的孢子悬浮液混匀后接种马铃薯叶片和薯块，每个处理分别包含有10片叶片和薯块，每个实验重复3次。在温度为25℃左右、湿度大于75％的条件下培养4天，然后观察并记录叶片和薯块的坏死面积。结果表明(图2)sa抑制尖孢镰刀菌对马铃薯叶片和薯块的侵染能力；sa浓度越大，由尖孢镰刀菌引起马铃薯叶片和薯块的坏死斑越小(图2b和图2c统计的结果为3次重复实验的平均值)。当sa的浓度达到10mmol/l时，尖孢镰刀菌不能有效的侵染马铃薯，丧失了对马铃薯的致病力。

实施例2、通过sirnas沉默尖孢镰刀菌fotor基因后尖孢镰刀菌对马铃薯的致病力研究

一、设计并合成针对fotor的sirnas

使用酵母tor蛋白作为参考搜索尖孢镰刀菌基因组数据库，发现尖孢镰刀菌含有2个tor基因，其全长cds序列分别为fotor1:7329bp；fotor2:5277bp。针对fotor的cds序列，利用sirna设计软件设计并合成了如下几条sirnas。sirna1：ccttacaaacaccaggtaatt(seqidno：6)；sirna2：gcaagatcctgctcaacattt(seqidno：7)；sirna3：gaggtggcgatgaagagagtt(seqidno：8)；阴性对照(negativecontrol,nc)：ttctccgaacgtgtcacgttt(seqidno：9)。sirnas在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

二、sirnas接菌实验

用合成的sirnas分别和尖孢镰刀菌孢子悬浮液混匀后接种马铃薯叶片和薯块，每个处理分别包含有10片叶片和薯块，每个实验重复3次。在温度为25℃左右、湿度大于75％的条件下培养4天，然后观察并记录叶片和薯块的坏死面积。其结果如图3所示(图3b为坏死斑直径结果，图3c为菌丝重量结果，统计的结果为3次重复实验的平均值)，结果显示这些sirnas和尖孢镰刀菌孢子悬浮液混匀后，通过沉默fotor基因减小了由尖孢镰刀菌引起马铃薯叶片和薯块的坏死斑面积，从而减弱了尖孢镰刀菌的致病力。表明通过sirnas沉默fotor基因后能够有效的抑制尖孢镰刀菌的致病力，在此结果基础之上，申请人进一步做了fotor基因rnai干扰研究。

实施例3、尖孢镰刀菌tor基因rnai表达载体构建

用尖孢镰刀菌的fotor1和fotor2的cds序列在ncbi中进行同源比对，分别找出一段最合适的序列用于构建rnai干扰载体，将fotor1和fotor2的rnai干扰序列合并后命名为fotor12。fotor12的序列为seqidno：1(无下划线的是fotor1，有下划线的是fotor2):

cgatccaggagagactacttgatatgctcagcgtagttctctgcggtgagccatttaaaccccttggcgctccacaaccaaatactctcagctcagtcccgattattcccaaagacgcaaaagacccccacgcttatgagcaccgaagggctgaggtcaagttggcgctcaacactctcggtagtttcgatttctcaggacatgttctgaacgagtttgttcgagacgtcgcaatcaagtacgttgaagacgaggatccagaaatccgtgaggcagcggccttgacatgctgccaattatcaccacgcggctgtgattgaagctattatgaacatcttccgcaccctgggcttggagtgtgtttcgttccttgatagaatcataccggcattcctccaggtgatacgatcggccacttccacgagacccgagtcttacttcaaccaactggccactctcgtcagcatcgtgcggcaacatataagaaattatcttccattaattgtcgagattttgcaggagtactggcacacctcgccatcactacagaccaccatcttgtcgcttgtagaggccatttcgaggtcgcttgagggtgaa。

在fotor12序列两端加上相应的酶切位点，在融合的序列的5’端加上asci-noti酶切位点，在3’端加上sbfi-bbvci酶切位点。在生工生物工程有限公司合成如下所示的序列seqidno：2(下划线字母代表相应的酶切位点)：ggcgcgccgcggccgccgatccaggagagactacttgatatgctcagcgtagttctctgcggtgagccatttaaaccccttggcgctccacaaccaaatactctcagctcagtcccgattattcccaaagacgcaaaagacccccacgcttatgagcaccgaagggctgaggtcaagttggcgctcaacactctcggtagtttcgatttctcaggacatgttctgaacgagtttgttcgagacgtcgcaatcaagtacgttgaagacgaggatccagaaatccgtgaggcagcggccttgacatgctgccaattatcaccacgcggctgtgattgaagctattatgaacatcttccgcaccctgggcttggagtgtgtttcgttccttgatagaatcataccggcattcctccaggtgatacgatcggccacttccacgagacccgagtcttacttcaaccaactggccactctcgtcagcatcgtgcggcaacatataagaaattatcttccattaattgtcgagattttgcaggagtactggcacacctcgccatcactacagaccaccatcttgtcgcttgtagaggccatttcgaggtcgcttgagggtgaacctgcagggctgagg。骨架载体pcr8/gw/topo使用花椰菜病毒的启动子(p35s)、拟南芥actin2的第四个内含子(in4)和花椰菜病毒的终止子(t35s)使其形成含有fotor12序列的“发夹”结构，然后在酶的作用下形成dsrna。

将seqidno：2所示的序列插入到骨架载体pcr8/gw/topo中，即得到重组载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接的p35s启动子、noti酶切位点、seqidno:1所示的序列、sbfi酶切位点、actin2的第四个内含子(in4)、bbvci酶切位点、seqidno:1所示的反向互补序列、asci酶切位点、t35s终止子，在pcr8/gw/topo中插入的这些片段连接起来的序列如序列表seqidno：3所示。通过gatewaylr反应将seqidno：3序列重组到植物表达载体pearleygate303上，即得到尖孢镰刀菌tor基因的rnai表达载体，将其命名为p35s::fotor12-ri，其结构如图4a所示，该干扰载体在植物中的抗性为卡那霉素抗性。

上述尖孢镰刀菌tor基因的rnai表达载体构建的具体过程参照中国专利zl201510742083.6的“实施例1小菜蛾tor基因rnai载体的构建”的步骤。

通过测序验证无误后，将构建好的p35s::fotor12-ri的rnai干扰载体转化农杆菌lba4404菌株，筛选并鉴定阳性克隆；将含有阳性克隆的农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化技术转入野生型马铃薯desiree植株中，卡那霉素抗性筛选获得转基因植株。用dna提取试剂盒提取卡那霉素抗性植株的dna，对筛选到的抗性植株做pcr检测。用p35sf(序列是5’-atgacgcacaatcccactatccttc-3’，seqidno：4)和fotor12r(序列是5’-gcggccgccgatccaggagagactac-3’，seqidno：5)引物检测，结果如图4b所示，其扩增的片段长度约为1500bp。

实施例4、p35s::fotor12-ri转基因马铃薯接菌实验

通过pcr鉴定总共获得13株含有干扰载体的转基因马铃薯株系。将含有p35s::fotor12-ri载体的转基因马铃薯(命名为fotor12-ri)植株培养长大后进行尖孢镰刀菌接菌实验。通过表型观察显示转基因马铃薯植株和野生型植株无明显的区别。将转基因马铃薯的叶片和薯块接种尖孢镰刀菌的孢子悬浮液后，在温度为25℃左右、湿度大于75％的条件下培养4天，然后观察并记录叶片和薯块的坏死面积，每个株系分别包含有10片叶片和薯块，每个实验重复3次。结果显示大部分转基因马铃薯都具有尖孢镰刀菌抗性，表现为减少的坏死斑面积和较少的菌丝重量；其中，抗性最明显的为转基因马铃薯株系fotor12-ri-8和fotor12-ri-12。其结果如图5a、5b、5c所示，其中wt为野生型马铃薯desiree。进一步将野生型马铃薯desiree植株、转基因马铃薯株系fotor12-ri-8和fotor12-ri-12植株种植于花盆中1个月左右后进行尖孢镰刀菌接菌实验，每个株系分别种植10个花盆。将约10⁷个/ml的尖孢镰刀菌孢子悬浮液通过根侵染法接种于马铃薯根系中，每个实验重复3次。接菌后的马铃薯继续在花盆中正常生长1个月后，观察发病情况。结果如图5e所示，与wt野生型马铃薯植株相比，转基因马铃薯fotor12-ri-8和fotor12-ri-12植株能够明显减缓马铃薯枯萎病的发生；与未接菌的转基因马铃薯植株(如图5d所示)相比，接菌后的转基因马铃薯fotor12-ri-8和fotor12-ri-12植株长势减缓，表明转基因马铃薯fotor12-ri-8和fotor12-ri-12植株只能部分减弱尖孢镰刀菌的致病力。

实施例5、sa和尖孢镰刀菌孢子悬浮液混匀后接种于fotor12-ri转基因马铃薯实验

使用低浓度的植物激素水杨酸sa和尖孢镰刀菌孢子悬浮液混匀后侵染fotor12-ri转基因马铃薯植株和野生型马铃薯植株，观察尖孢镰刀菌的致病力。将野生型马铃薯desiree、转基因马铃薯fotor12-ri-8和fotor12-ri-12植株的叶片和薯块接种混合有sa(1mm)的尖孢镰刀菌的孢子悬浮液(约10⁷个/ml)后，在温度为25℃左右、湿度大于75％的条件下培养4天，然后观察并记录叶片和薯块的坏死面积，每个株系分别包含有10片叶片和薯块，每个实验重复3次。结果如图6a、6b、6c所示(图6b和6c统计的结果为3次重复实验的平均值)，转基因马铃薯具有显著的尖孢镰刀菌抗性，表型为显著减少的坏死斑面积和更少的菌丝重量。进一步将野生型马铃薯desiree、转基因马铃薯fotor12-ri-8和fotor12-ri-12植株种植于花盆中1个月左右后进行尖孢镰刀菌接种实验，每个株系分别种植10个花盆，将约10⁷个/ml的尖孢镰刀菌孢子悬浮液和1mmsa混匀后通过根侵染法接种于马铃薯根系中，每个实验重复3次。接菌后的马铃薯继续在花盆中生长1个月后，观察发病情况。结果如图6e所示(图6d是不加尖孢镰刀菌仅使用1mmsa处理的阴性对照组)，混合有sa的转基因马铃薯fotor12-ri-8和fotor12-ri-12植株能够极显著的减缓马铃薯枯萎病的发生。fotor12-ri转基因马铃薯植株和低浓度的水杨酸联合使用能够极显著的抑制尖孢镰刀菌的致病力，表明运用植物激素水杨酸和fotor12-ri转基因马铃薯植株的联合使用能够有效防治由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病和干腐病。

序列表

<110>中国农业科学院都市农业研究所;中国农业科学院棉花研究所

<120>尖孢镰刀菌tor基因rnai载体及其与水杨酸联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法

<160>9

<210>1

<211>600

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>fotor12

<400>1

cgatccaggagagactacttgatatgctcagcgtagttctctgcggtgagccatttaaac60

cccttggcgctccacaaccaaatactctcagctcagtcccgattattcccaaagacgcaa120

aagacccccacgcttatgagcaccgaagggctgaggtcaagttggcgctcaacactctcg180

gtagtttcgatttctcaggacatgttctgaacgagtttgttcgagacgtcgcaatcaagt240

acgttgaagacgaggatccagaaatccgtgaggcagcggccttgacatgctgccaattat300

caccacgcggctgtgattgaagctattatgaacatcttccgcaccctgggcttggagtgt360

gtttcgttccttgatagaatcataccggcattcctccaggtgatacgatcggccacttcc420

acgagacccgagtcttacttcaaccaactggccactctcgtcagcatcgtgcggcaacat480

ataagaaattatcttccattaattgtcgagattttgcaggagtactggcacacctcgcca540

tcactacagaccaccatcttgtcgcttgtagaggccatttcgaggtcgcttgagggtgaa600

<210>2

<211>631

<212>dna

<213>人工序列

<223>两端加上酶切位点的fotor12

<400>2

ggcgcgccgcggccgccgatccaggagagactacttgatatgctcagcgtagttctctgc60

ggtgagccatttaaaccccttggcgctccacaaccaaatactctcagctcagtcccgatt120

attcccaaagacgcaaaagacccccacgcttatgagcaccgaagggctgaggtcaagttg180

gcgctcaacactctcggtagtttcgatttctcaggacatgttctgaacgagtttgttcga240

gacgtcgcaatcaagtacgttgaagacgaggatccagaaatccgtgaggcagcggccttg300

acatgctgccaattatcaccacgcggctgtgattgaagctattatgaacatcttccgcac360

cctgggcttggagtgtgtttcgttccttgatagaatcataccggcattcctccaggtgat420

acgatcggccacttccacgagacccgagtcttacttcaaccaactggccactctcgtcag480

catcgtgcggcaacatataagaaattatcttccattaattgtcgagattttgcaggagta540

ctggcacacctcgccatcactacagaccaccatcttgtcgcttgtagaggccatttcgag600

gtcgcttgagggtgaacctgcagggctgagg631

<210>3

<211>2284

<212>dna

<213>人工序列

<223>

<400>3

gaattcgcgatcgcgtttaaacttgctgccagcaggtccgattgagacttttcaacaaag60

ggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaa120

gatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccat180

cgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcat240

cgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatggtcc300

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gcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggggatctttttattt660

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tatgctcagcgtagttctctgcggtgagccatttaaaccccttggcgctccacaaccaaa780

tactctcagctcagtcccgattattcccaaagacgcaaaagacccccacgcttatgagca840

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ttgtcgagattttgcaggagtactggcacacctcgccatcactacagaccaccatcttgt1260

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actccaagcccagggtgcggaagatgttcataatagcttcaatcacagccgcgtggtgat1740

aattggcagcatgtcaaggccgctgcctcacggatttctggatcctcgtcttcaacgtac1800

ttgattgcgacgtctcgaacaaactcgttcagaacatgtcctgagaaatcgaaactaccg1860

agagtgttgagcgccaacttgacctcagcccttcggtgctcataagcgtgggggtctttt1920

gcgtctttgggaataatcgggactgagctgagagtatttggttgtggagcgccaaggggt1980

ttaaatggctcaccgcagagaactacgctgagcatatcaagtagtctctcctggatcggc2040

ggccgcggcgcgcccggccatgctagagtccgcaaaaatcaccagtctctctctacaaat2100

ctatctctctctatttttctccagaataatgtgtgagtagttcccagataagggaattag2160

ggttcttatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgt2220

atttgtaaaatacttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtgacga2280

attc2284

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<223>p35sf

<400>4

atgacgcacaatcccactatccttc25

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<223>fotor12r

<400>5

gcggccgccgatccaggagagactac26

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>sirna1

<400>6

ccttacaaacaccaggtaatt21

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>sirna2

<400>7

gcaagatcctgctcaacattt21

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>sirna3

<400>8

gaggtggcgatgaagagagtt21

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>阴性对照

<400>9

ttctccgaacgtgtcacgttt21