一种EV71病毒核酸质粒及其构建方法及应用与流程

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种ev71病毒核酸质粒，以及该ev71病毒核酸质粒的构建方法，以及该ev71病毒核酸质粒用于制备抑制实体瘤药物的用途。
背景技术：
：目前，大多数癌症治疗采用传统的手术、放疗、化疗方法，传统的癌症治疗技术存在副作用大的缺点，严重影响了癌症患者的生存质量。特别是当患者发展到癌症的中晚期时，传统的治疗技术效果不明显，预后较差，严重的副作用也影响到患者的生存质量。目前治疗癌症采用了免疫节点技术，取得一定的治疗效果。副作用小，在pd-1和pd-l1蛋白高表达的肿瘤患者中有效率可以达到50％，有效改善了患者的生存质量。但是近年来开始发现很多的癌症患者对pd-1单抗药物产生耐药性，特别是用了1年以上的患者。总体而言，癌症疾病是一种进化性复杂性疾病，单一靠一种治疗方法是无法解决的。溶瘤病毒发展多年，可以算是治疗肿瘤的新奇治疗的方法，该方法利用病毒直接凋亡肿瘤细胞的功能以及免疫刺激的作用。但是传统的溶瘤病毒治疗方法存在的一些瓶颈问题，比如免疫屏障、耐药等。由于人体天然的免疫屏障，溶瘤病毒一旦进入体内就会被机体的免疫物质所识别，比如抗病毒的中和抗体和各种免疫细胞，病毒在到达肿瘤细胞之前就会被中和抗体结合或者被免疫细胞所吞噬，只有极少量的病毒能够进入肿瘤细胞发挥功效。人体免疫系统大大降低了溶瘤病毒的功效。另外溶瘤病毒需要进入到肿瘤细胞中，必须借助肿瘤细胞上存在的受体蛋白。肿瘤细胞就是天生不断进化变异细胞，很快会进化出缺乏溶瘤病毒的受体蛋白的肿瘤细胞，此时溶瘤病毒就无法侵入这些变异的肿瘤细胞，从而产生耐药性。技术实现要素：本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够使肿瘤细胞凋亡的ev71病毒核酸质粒。本发明的另一个目的是提供所述ev71病毒核酸质粒的构建方法。本发明的再一个目的是提供所述ev71病毒核酸质粒的应用。为了实现以上目的，本发明提供了一种ev71病毒核酸质粒，其中所述ev71病毒核酸质粒质粒包括ev71病毒全长cdna序列和真核表达质粒序列。此外，本发明还提供了所述ev71病毒核酸质粒的构建方法，该方法包括：提取ev71病毒rna核酸，将所述ev71病毒rna反转录为cdna，然后再将ev71病毒cdna全长序列利用同源重组的方法连接到真核质粒载体上，从而构建所述ev71病毒核酸质粒。优选地，所述构建方法的具体步骤如下：步骤1：提取ev71病毒的rna；步骤2：将ev71病毒的rna反转录为cdna；步骤3：用ev71病毒引物扩增ev71病毒的cdna片段，电泳扩增产物，然后回收扩增的ev71病毒cdna核酸片段；步骤4：用真核表达质粒的引物扩增真核表达质粒的dna片段，电泳扩增产物，然后回收扩增的真核表达质粒核酸片段；步骤5：连接步骤3所得到的ev71病毒cdna核酸片段和步骤4所得到的真核表达质粒核酸片段，将连接产物转化到感受态细菌中，得到转化细菌；步骤6：将培养的转化细菌涂板到含有氨苄的lb琼脂板上，挑选单克隆细菌，筛选和鉴定连接成功的ev71病毒核酸质粒细菌。步骤7：将连接成功的ev71病毒核酸质粒细菌大量培养，抽提ev71病毒核酸质粒，抽提的所述ev71病毒核酸质粒经过转染鉴定后，加入保存液放置-20℃保存。优选地，本发明所述的ev71病毒包括a、b、c亚型，最优选为c型ev71病毒。优选地，本发明所述的真核表达质粒包括pcdna-3.1、pcdna-3.1-e、pcdna3.1/zeo(+/-)、pcdna4、pcdna4/hismax、prc/rsv，最优选为pcdna-3.1。本发明还提供了所述ev71病毒核酸质粒用于制备抑制实体瘤药物的用途。本发明还提供了所述ev71病毒核酸质粒用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物的用途。优选地，所述肿瘤是宫颈癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、肌肉瘤、胃癌、结肠癌、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌中的一种或多种。本发明还提供了ev71病毒核酸质粒转染至细胞中的运载方法，其中体外转染ev71病毒核酸质粒至细胞，主要采用lip3000转染方法；体内将ev71病毒核酸质粒转染至肿瘤细胞，主要采用脂质体、纳米材料方法等。其中体外转染病毒核酸质粒的方法优选脂质体方法。本发明还根据常规溶瘤病毒容易被机体中和抗体所阻断的特性，设计了体外中和抗体的细胞模型，将ev71病毒中和抗体添加至细胞培养液中，然后分别转染ev71病毒核酸质粒或者加入ev71病毒，观察两者的作用差别。结果显示本发明的ev71病毒核酸质粒能够在添加ev71病毒中和抗体的hela细胞中包装出活体病毒，快速导致hela细胞的凋亡。而ev71病毒则无法感染添加ev71病毒中和抗体的hela细胞。以宫颈癌为例，本发明建立的宫颈癌实体瘤动物模型具体操作步骤如下：培养hela细胞，消化细胞，用pbs溶液将离心后的hela细胞稀释至2*107个/ml浓度，保存在冰上。注射hela细胞至balb/c裸鼠的后肢外侧，注射量为0.2ml。一般2周后，裸鼠的肿瘤组织生长到500mm3(长*宽2/2)就可以开始注射ev71病毒核酸质粒药物。ev71病毒是引起5岁以下儿童手足口病的主要病原体，很少能够导致成人年患病。ev71病毒基因小，容易在肿瘤细胞中复制出活体病毒，病毒繁殖速度快，凋亡肿瘤细胞的效率高。因此本发明选择ev71病毒作为溶瘤病毒核酸质粒构建的研究对象。另外大多数成年人都存在ev71病毒中和抗体，ev71病毒核酸质粒在肿瘤细胞中包装出病毒，能够在肿瘤细胞表面展示ev71病毒蛋白，也会引发体内免疫系统攻击被病毒感染的肿瘤细胞，从而形成肿瘤细胞的二次攻击。本发明ev71病毒核酸质粒是通过运载工具(如脂质体或者纳米材料等)运载进入肿瘤细胞中，能够进入肿瘤细胞中包装出活体ev71病毒，通过直接裂解肿瘤细胞、破坏肿瘤细胞酶功能、释放病毒蛋白在肿瘤细胞表面，最终导致肿瘤细胞的凋亡，引发实体瘤组织的消亡，而不是通过肿瘤细胞上的受体蛋白作用。本发明提供的ev71病毒核酸质粒可以在大多数的肿瘤细胞中包装出活体病毒引发肿瘤细胞凋亡，而人体内不存在病毒核酸质粒的中和抗体，因此病毒核酸质粒在人体内不会被免疫系统识别和攻击，从而保证溶瘤的功效。病毒核酸质粒进入肿瘤细胞，是借助脂质体或者纳米材料等，主要是利用细胞膜存在负电荷的特点。肿瘤细胞膜带有负电荷的特性是不可能改变的，因此它无法通过进化抵抗病毒核酸质粒进入细胞膜。因此本发明提供的ev71病毒核酸质粒可以克服肿瘤组织异质性的问题，部分解决因为肿瘤变异而产生耐药性的问题。附图说明图1是ev71病毒核酸质粒组和ev71病毒组在中和抗体干扰下hela细胞的存活率示意图。图2是ev71病毒核酸质粒组和ev71病毒组治疗荷瘤小鼠后肿瘤体积的变化示意图。图3是ev71病毒核酸质粒组和ev71病毒组治疗下肿瘤重量对比示意图。图4是ev71病毒核酸质粒组和ev71病毒组的抑瘤率对比示意图。具体实施方式以下结合具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。值得注意的是，如未特别指出，以下实施例中所采用的材料、试剂和仪器均为现有的或可通过商业渠道购买获得，尽管部分实验操作未描述细节，但本领域技术人员熟知这些操作。实施例1：溶瘤病毒质粒的构建实验材料：ev71病毒培养液(genebank编号，病毒浓度：107tcid50)，pcdna3.1质粒(罗氏公司，质粒浓度300ng/μl)，dna/rna提取试剂盒(takara公司)，rt试剂盒，高保真pcr酶primestarmax(takara公司，2×)，同源重组试剂盒hdcloning(takara公司)，感受态top10(takara公司)，引物。试验步骤如下：1.1病毒rna抽提：根据dna/rna提取试剂盒(takara公司)操作说明书，抽提ev71病毒的rna。1.2两步法rt反应：配置变性反应液(oligodtprimer(50μm)1μl；dntp1μl；ev71病毒rna2μl；rnasefreedh2o6μl)，65℃(金属浴)保温5min后，冰上迅速冷却。再配置rt反应液(变性后的反应液10μl；5×primerscriptⅱbuffer4μl；rnaseinhibitor0.5μl；primescriptⅱrtase1μl；rnasefreedh2o4.5μl)，将上述溶液缓慢混匀，采用42℃60min；70℃15min进行长片段cdna扩增，获得ev71病毒cdna模板。1.3pcr反应:分别对ev71病毒cdna和pcdna3.1质粒进行pcr扩增，扩增ev71病毒cdna引物分别是引物1(seqidno.1)和引物2(seqidno.2)；扩增pcdna3.1质粒的引物分别是引物3(seqidno.3)和引物4(seqidno.4)。病毒cdna的pcr反应液配置：病毒cdna2μl；primestarmax(2×)25μl；引物11μl；引物21μl；dh2o21μl。质粒pcdna3.1反应液的pcr反应液配置：pcdna3.1(100倍稀释)2μl；primestarmax(2×)25μl；引物31μl；引物41μl；dh2o21μl。pcr反应程序：98℃预变性3min；再进行30个循环反应(95℃10s；58℃10s；72℃60s)；最后72℃5min。引物序列见表1。表1.pcr反应引物序列表1.4电泳：凝胶电泳(1％琼脂糖，130v电压)，电泳30分钟，在目标位置进行切胶。1.5胶回收：根据胶回收试剂盒的操作说明书对病毒pcr扩增产物和pcdna3.1质粒的pcr扩增产物进行胶回收。1.6同源重组：根据takarahdcloning试剂盒的操作说明书，将胶回收的产物与同源重组酶按照一定的比例进行混合，反应50℃15min。1.7转化：感受态(top10)冰静置30min，将同源重组的产物吸取加入到感受态中，42℃热激45s；加入900μllb培养基(无抗生素)，放置摇床振荡(37℃250rpm)培养45min；5000rpm离心5min，弃去850μl上清，剩余的液体重悬沉淀，涂板，a+mp琼脂平板，37℃培养箱中静置12-16h。1.8、质粒鉴定：挑选单菌落，800μllb培养基37℃250rpm摇菌6hr；使用小样dna抽提试剂盒抽提质粒，进行电泳测试，以及测序分析。实施例2：溶瘤病毒质粒的抗肿瘤细胞效应。实验材料：12株肿瘤细胞(见表1)，ev71病毒核酸质粒，lip3000转染试剂，dmem培养基、f12培养基、胎牛血清、cck-8。实验步骤如下：2.1细胞培养：培养细胞，选择生长状态良好(铺板效果达到90％)，消化细胞制成细胞悬液，细胞浓度为105个/ml，以100μl/孔加入到96孔细胞培养板上，培养16-18小时。2.2细胞转染：当细胞的铺板率为85-90％，按照lip3000试剂操作说明书方法，每孔加入0.1ug的ev71病毒核酸质粒。实验设置阴性对照组：只加入培养基。每组细胞均设置3个复孔。转染后将细胞板放置到37℃二氧化碳培养箱培养，每天观察细胞的病变情况。2.3测试细胞的凋亡情况：细胞培养72小时，加入cck-8试剂，每孔加入10μl，轻轻混匀，作用1小时后，取出细胞培养板至酶标仪(波长450nm)测试。细胞存活率＝转染组od值/阴性对照组od值×100％。结果如表2所示，ev71病毒核酸质粒能够有效使12种肿瘤细胞凋亡。表2.12株人肿瘤细胞在转染ev71病毒质粒后细胞存活率细胞株名称肿瘤类型存活率(％)hela人宫颈癌细胞2.5a549人肺癌细胞12.6u-87mg人星形胶质母细胞瘤1.8hgc-27人胃癌细胞8.9rd人横纹隔肌肉瘤2.3bt-474人乳腺导管癌细胞12.3lovo人结直肠癌细胞16.8a-375人恶性黑色素瘤细胞17.2sk-mes-1人肺鳞癌细胞9.2mda-mb-231人乳腺癌细胞12.1te-1人食管癌细胞8.3du145人前列腺癌细胞3.5实施例3：溶瘤病毒质粒的安全性测试实验材料：mrc-5细胞(人胚肺细胞)，ev71病毒核酸质粒，lip3000转染试剂，dmem培养基、胎牛血清。实验步骤如下：3.1细胞培养：培养mrc-5细胞，选择生长状态良好(铺板效果达到90％)，消化细胞制成细胞悬液，细胞浓度为105个/ml，以1000μl/孔加入到24孔细胞培养板上，培养16-18小时。3.2细胞转染：当细胞的铺板率为85-90％，按照lip3000试剂操作说明书方法，每孔加入0.5ug的ev71病毒核酸质粒。实验设置阴性对照组：只加入培养基。转染后将细胞板放置到37二氧化碳培养箱培养，每天观察细胞的病变情况。3.3细胞病变及病毒培养：细胞培养72小时，没有发现细胞病变。将细胞板反复冻融3次，离心吸取细胞培养上清，将细胞上清转接到vero细胞37℃作用2小时。除去细胞培养上清，加入dmem培养基，然后放置二氧化碳培养箱培养3天，每天观察细胞病变情况。三天后吸取细胞培养上清，提取病毒核酸，测试ev71病毒核酸。结果显示：ev71病毒核酸质粒无法凋亡mrc-5细胞。ev71病毒核酸质粒转染的mrc-5细胞的细胞上清没有含有活体ev71病毒，证明ev71病毒核酸质粒无法在mrc-5细胞中包装出ev71病毒。mrc-5细胞属于人正常细胞体系，ev71病毒核酸质粒对mrc-5没有毒性。实施例4：溶瘤病毒质粒体外中和抗体干扰试验实验材料：hela细胞，ev71病毒核酸质粒，ev71病毒(107tcid50)，ev71病毒中和抗体血清(中和效价1:512)，lip3000转染试剂，dmem培养基、胎牛血清。实验步骤如下：4.1细胞培养：培养hela细胞，消化hela细胞制成细胞悬液，细胞浓度为105个/ml，以100μl/孔加入到96孔细胞培养板上，培养16-18小时。4.2感染对比实验：当hela细胞的铺板率为85-90％，换去dmem培养基，加入不完全dmem培养基100μl/孔，同时加入10μlev71病毒中和抗体血清(血清中和效价为1:256)。按照lip3000试剂操作说明书方法，每孔加入0.1ug的ev71病毒核酸质粒。另外一组实验组，将ev71病毒稀释至106tcid50加入到hela细胞，每孔加入10μl病毒稀释液。实验组设计阴性对照。每组细胞均设置3个复孔。转染后将细胞板放置到37℃二氧化碳培养箱作用2小时，然后所有的细胞孔去除培养基，加入含有2％胎牛血清的dmem培养基，每天观察细胞的病变情况。4.3测试细胞的凋亡情况：细胞培养72小时，加入cck-8试剂，作用1小时后，取出细胞培养板至酶标仪(波长450nm)测试。细胞存活率＝转染组od值/阴性对照组od值×100％。实验结果见图1。试验结果显示：ev71病毒核酸质粒在ev71病毒中和抗体的作用能够凋亡hela细胞，而天然的ev71病毒在中和抗体的作用下则无法感染hela细胞，无法造成hela细胞凋亡。实施例5：溶瘤病毒质粒的实体瘤效果测试实验材料：ev71病毒核酸质粒，balb/c裸鼠，hela细胞，dmem培养基，胎牛血清，胰酶-edta，turbofectinvivotransfection试剂，电子天平，游标卡尺、注射器。实验步骤如下：5.1动物模型建立：培养hela细胞，胰酶消化hela细胞，1500rpm离心hela细胞，加入pbs稀释hela细胞，控制hela细胞浓度为2×107个/ml。将hela细胞注射到balb/c裸鼠后肢侧边，每只注射0.1ml。共注射15只balb/c裸鼠，每周观察小鼠1次，每次称量小鼠的体重和肿瘤大小。5.2肿瘤治疗：10天后，小鼠的肿瘤体积达到500cm3(长×宽2/2),就注射药物进行治疗。本次实验设计：ev71病毒核酸质粒瘤内注射组、ev71病毒瘤内注射组、pbs瘤内注射对照组。ev71病毒核酸质粒按照turbofectinvivotransfection试剂说明书，50ug的ev71病毒核酸质粒溶解于400μl的5％葡萄糖溶液中，再加入6μl的turbofectinvivotransfection试剂混合，室温感作20分钟。然后按照瘤内注射50μl的体积注射ev71病毒核酸质粒。ev71病毒稀释至107tcid50，瘤内注射50μl/只。pbs瘤内注射50μl/只。每周注射一次，共注射4周。每周观察小鼠1次，每次称量小鼠的体重和肿瘤大小。肿瘤体积＝长×宽2/2。小鼠的体重和肿瘤体积大小见图2。5.331天后，人道处死小鼠，取下小鼠皮下肿瘤，称量小鼠肿瘤克数，见图3。肿瘤抑制率计算公式为：抑瘤率＝(c-t)/c×100％，其中c为对照组肿瘤的平均重量(pbs对照组)，t为其它实验组肿瘤的平均重量。根据抑瘤率计算公式计算出ev71病毒核酸质粒组和ev71病毒组的抑瘤率，见图4。实验结果显示：小鼠的肿瘤在接种ev71病毒核酸质粒治疗，肿瘤的生长受到明显抑制，肿瘤生长速度明显小于pbs对照组，并且显著小于ev71病毒实验组。ev71病毒核酸质粒的治疗组抑瘤率可以达到59％，显著高于ev71病毒治疗组(12％)。序列表<110>广州医科大学附属第一医院(广州呼吸中心)<120>一种ev71病毒核酸质粒及其构建方法及应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttaaaacagcctgtgggttgcaccca26<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttgctattctggttataacaaatttacccc30<210>3<211>36<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cacaggctgttttaaccctatagtgagtcgtattaa36<210>4<211>58<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4taaccagaatagcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagctcgagtctagagggcccg58<210>5<211>7405<212>dna<213>肠道病毒71型(enterovirus71)<400>5ttaaaacagcctgtgggttgtacccacccacagggcccactgggcgcaagcactctggta60cttcggtacctttgtgcgcctgttttataccccccccccagtgaaacttagaagcagcaa120accacgatcaatagcaggcatagcgctccagttatgtcttgatcaagcacttctgtttcc180ccggactgagtatcaatagactgctcgcgcggttgaaggagaaaacgttcgttacccggc240caactacttcggaaaacctagtaacaccatgaaagttgcggagagcttcgttcagcactc300ccccagtgtagatcaggtcgatgagtcaccgcattccccacgggcgaccgtggcggtggc360tgcgttggcggcctgcccatggggtaacccatggggcgctctaatacggacatggtgtga420agagtctactgagctagttggtagtcctccggcccctgaatgcggctaatcccaactgcg480gagcacacgcccacaagccagcgggtagtgtgtcgtaatgggtaactctgcagcggaacc540gactactttgggtgtccgtgtttccttttatctttatattggctgcttatggtgacaatc600agagaattgttaccatatagctattggattggccatccggtgtgcaacagagcaattatc660tacctatttgttggttttgtaccattaactttgacttctgtgaccacccttaattatatc720ttgacccttaacacagttaaacatgggttcgcaagtgtctacacagcgctccggttctca780cgaaaactcaaactcagccactgagggttctaccataaactacaccaccatcaattacta840taaagactcctatgctgccacagcaggcaaacagagtctcaagcaggatccagacaagtt900tgcaaatcctgttaaagacatcttcactgaaatggcagcgccgctgaagtccccatccgc960tgaggcgtgtgggtacagtgatcgagtggcgcagttaactataggcaactccaccatcac1020tacgcaagaagcggctaacatcatagtcggttatggtgaatggccttcctactgctcaga1080ttctgacgctacagcggtggataaaccaacgcgcccggatgtttcagtgaacaggtttta1140cacgttggacactaaattatgggagaaatcgtctaagggatggtactggaagttcccgga1200tgtattaacagaaactggggtctttgggcaaaatgcacaattccactacctctaccgatc1260agggttctgcatccacgtgcagtgcaatgccagtaaattccatcaaggagcactcctagt1320cgctgtcctaccagagtatgttattgggacagtggcaggcggtacagggacggaagacac1380ccaccccccttacaagcagactcaacccggcgctgatggtttcgagttgcaacacccgta1440cgtgcttgatgctggcatcccgatatcacagttaacagtgtgcccgcaccagtggattaa1500tttgaggaccaataattgtgccacaataatagtgccatacattaacgcactgccttttga1560ttctgccttgaaccattgcaactttggcctgttagtagtgcctgttagcccactagacta1620cgaccaaggagcgacgccagtaatccctataactatcacattagccccaatgtgttctga1680attcgcaggtcttaggcaggcagtcacgcaagggttccccaccgagccaaagcctggcac1740aaatcaatttttaaccaccgatgatggcgtttcagcacctattctaccaaacttccaccc1800caccccgtgcatccacatacctggtgaagttaggaacttgctagagttatgccaggtgga1860gaccattctggaggttaacaatgtgcccacaaatgccactagcttaatggagagactgcg1920cttcccagtctcagcacaagcagggaaaggtgagctgtgtgcggtgtttagagccgaccc1980cgggcgaaatggaccatggcaatccaccttactgggtcagttgtgcgggtattacaccca2040atggtcaggatcattggaagtcactttcatgtttactggatccttcatggctaccggtaa2100gatgctcatagcttatacaccaccaggaggtcctctacccaaggatcgggcaaccgccat2160gttgggcacgcacgtcatctgggatttcgggctgcaatcgtctgttacccttgtaatacc2220atggattagcaacactcattatagagcacatgcccgagatggagtgtttgactactacac2280cacagggttagttagtatatggtatcagacaaattacgtggttccaa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