一种影响人扩张型心肌病诊治的TTNG52522T突变及其应用的制作方法

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，特别涉及一种影响人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预的错义突变及其应用。

背景技术：

心肌病是一组以心肌直接受累为主要特征的疾病，这类疾病不是由心包疾病、高血压、先天性心脏病以及瓣膜病引起，但是这组疾病本身有许多固有的特征，包括临床表现和血流动力学异常。随着诊疗技术水平的不断提高，人们对疾病的认识也更加深刻，诊断手段也越来越丰富，目前已经充分认识到心肌病是致病和致死的重要心脏疾病之一。自从1990年发现心肌病的第一个致病基因以来，对疑似遗传性心肌病的基因检测经历了从基础研究到临床应用的发展过程，对其发病机制的认识发展到基因水平，大大促进了心肌病在微管领域的认识，目前心肌病的基因检测在临床上已经应用于辅助诊断。

ttn基因的致病性变异可导致遗传性肥厚型心肌病、扩张型心肌病、胫骨肌肉萎缩症，遗传方式为常染色体显性遗传（ad）；肢带型肌营养不良症2j，salmy（早发致命性肌病），遗传方式为常染色体隐性遗传（ar）；伴有早期呼吸衰竭的遗传性肌病。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种导致人类扩张型心肌病的错义突变。

本发明的另一目的在于提供上述导致人类扩张型心肌病的错义突变在人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种用于鉴定上述导致人类扩张型心肌病的错义突变的引物。

本发明的第四个目的在于提供一种评估人类扩张型心肌病发病风险的方法。

本发明的第五个目的在于提供一种人类扩张型心肌病产前诊断的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种导致人类扩张型心肌病的错义突变，其突变位点对应于人类ttn基因编码区第52522位编码碱基由g突变为t，即ttnmutation：c.g52522t(p.glu17508ter)(nm_003319)；所属的人类错义突变的突变位点为seqidno.1所示，其中序列中的m是突变碱基，导致扩张型心肌病的发生；

所述的导致人类扩张型心肌病的错义突变在人类扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用；

所述的人类扩张型心肌病辅助诊断为利用上述错义突变鉴定人类扩张型心肌病；

所述的人类扩张型心肌病辅助诊断还包括利用上述错义突变评估、干预人类扩张型心肌病发病风险；

所述的临床干预为利用上述错义突变实行临床干预；

所述的人类为亚洲人群；

一种用于鉴定上述影响人类扩张型心肌病发病风险的错义突变的引物，包含上游引物pcr-f和下游引物pcr-r；

上游引物pcr-f为：5′-ttgacctttgcccctccatc-3′(seqidno.2)；

下游引物pcr-r为：5′-acgccgcattacagatttgc-3′(seqidno.3)。

所述的用于鉴定上述导致人类扩张型心肌病的错义突变的引物在扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中的应用；

所述的人类为亚洲人群；

一种评估人类扩张型心肌病发病风险的方法，包含如下步骤：

检测人ttn基因上述错义突变的单核苷酸是g还是t；

所述的人类为亚洲人群；

一种人类扩张型心肌病的产前诊断的方法，包含如下步骤：

确定受检者夫妻双方的上述错义突变，并根据错义突变做出相应的措施：

如受检者夫妻中一方上述错义突变为杂合突变，提示受检者子女出现扩张型心肌病风险高，应积极采取预防措施；如受检者夫妻双方上述错义突变为无突变，提示受检者子女出现扩张型心肌病风险降低，可仅进行常规检查；

所述的人类为亚洲人群；

本发明的测定方法测定来源于人的基因组dna，样品没有限制，如体液(如血液)、组织细胞(如皮肤组织)等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组dna。本发明公开了ttn基因编码区第52522位碱基由g到t的变异，且ttn基因的序列已知，用现有检测核苷酸变异的方法均可以检测上述位点的多态性。

本发明通过检测ttn基因编码区第52522位g→t变异来辅助扩张型心肌病的筛查，具有可靠的特异性。本发明在正常人中未能检测到所述突变，而在所检测的扩张型心肌病家系的确诊患病成员中，都检测出所述突变，检测结果具有可重复性。应用前景良好。

本发明通过检测夫妻双方上述错义突变，能够预测子代获得扩张型心肌病的风险，有助于产前诊断，及早作出确诊，防止扩张型心肌病蔓延。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

附图说明

图1是本发明所述突变位点测序图，箭头所示为突变位点。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1突变位点的疾病相关性

1.dna提取及全外显子测序

取全血样本200微升，采用萃取方法提取全基因组dna，使用nanodrop2000对dna行质量检测和浓度测定。a260/280比值在1.8～2.0，a260/230壁纸在1.7～1.9判定为合格。最后将合格的dna样品统一稀释至100纳克/微升。对合格的dna样品进行高通量测序获取相关基因突变信息。

2.acmg遗传变异分类分析：

受检人样品中检测到ttn基因杂合错义突变c.g52522t（编码区第52522位核苷酸g变为t），该变异导致第17508位编码氨基酸残基谷氨酸glu变为终止密码子ter，产生过早的翻译终止信号，导致编码蛋白的截短突变。该变异是ttn基因的无功能变异，且该基因的无功能变异是扩张型心肌病的已知致病机制（pvs1）；该变异未见报道但该变异上下游的其他多个无义突变已被clinvar数据库收录，如上游变异ttn:p.tyr17504ter（variationid:566989）并有多篇文献报道（pmid:23975875,25589632,28492532）；该变异频率在已知参考数据库中未被收录，该变异不属于多态性变化（pm2）。

3.结果判定：

根据acmg指南判定该变异为可能致病性变异。

实施例2突变位点的检测方法

1.含有与人扩张型心肌病发病显著相关基因错义突变位点的目的片段的扩增。

目的片段为ttn基因第154外显子上一段834bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为：

上游引物pcr-f为：5′-ttgacctttgcccctccatc-3′(seqidno.2)

下游引物pcr-r为：5′-acgccgcattacagatttgc-3′(seqidno.3)

浓度：100μmol/l

2)体系配制：

3)反应程序：

3.dna序列测序鉴定：序列测序在3730xldnaanalyzer（abi公司）上进行。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，得出对应单核苷酸位点的基因型。测序结果如下所示：

ttgacctttgcccctccatcaatgatgggtggctcccataccaggaaggcagaatcttttctcacttctttgactgccaaattctgtggtggtcctggagtgtcaagaactttcacagttacaaaagcagactttgatccactgctgttttccaacttaagaatgtattttccagcatcatttctatcacagttatctattgatagttgggtatagtttactcccttttcaatttggaccttatctgtgaattcaccttcctctcgagaccaagtgatctcaggcgttggacgacctttgaatggaatgtgaattctggcagatccaccagctcttacaacaattccttttcttaattcggagtcaaggtcaagttcaggtgcttcaagtttatcttctggtttcacagtaccaggaactgatgtagcctm(g\t)acctaaaccaactttgttgagggcacagactcgtattttatactcttggtgttcagtgagttttgaaatttcaaatcgagtgactctcaggccagtctgtggagtaactatttgccattcttcttcatctgctttacagatttctactacatatcccaagatctcactgccgccatcatagatgggtttaccccaggcaagtgtgattgaatttttagtggtgtctacaatgtgtgcattggtaggtgggccaggtttgaacacaggatcacaggctttataataaactgtagctggacttggttccccaactccagcagcattttctgcagagaccctgaattcatactcatgatcttctgttaatcctgtcactcttagacgcaaatctgtaatgcggcgt

（seqidno.1）

注：序列表中标注的m为突变位点，用标有下划线显示（括号中为突变碱基、为等位基因突变），在该序列的首尾加粗显示为引物序列。

综上，本发明将ttn基因c.g52522t位点的变异，应用于扩张型心肌病辅助诊断及临床干预中，具有良好的应用前景。

序列表

<110>郑州大学第一附属医院

<120>一种影响人扩张型心肌病诊治的ttng52522t突变及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>834

<212>dna

<213>人(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

ttgacctttgcccctccatcaatgatgggtggctcccataccaggaaggcagaatctttt60

ctcacttctttgactgccaaattctgtggtggtcctggagtgtcaagaactttcacagtt120

acaaaagcagactttgatccactgctgttttccaacttaagaatgtattttccagcatca180

tttctatcacagttatctattgatagttgggtatagtttactcccttttcaatttggacc240

ttatctgtgaattcaccttcctctcgagaccaagtgatctcaggcgttggacgacctttg300

aatggaatgtgaattctggcagatccaccagctcttacaacaattccttttcttaattcg360

gagtcaaggtcaagttcaggtgcttcaagtttatcttctggtttcacagtaccaggaact420

gatgtagcctgacctaaaccaactttgttgagggcacagactcgtattttatactcttgg480

tgttcagtgagttttgaaatttcaaatcgagtgactctcaggccagtctgtggagtaact540

atttgccattcttcttcatctgctttacagatttctactacatatcccaagatctcactg600

ccgccatcatagatgggtttaccccaggcaagtgtgattgaatttttagtggtgtctaca660

atgtgtgcattggtaggtgggccaggtttgaacacaggatcacaggctttataataaact720

gtagctggacttggttccccaactccagcagcattttctgcagagaccctgaattcatac780

tcatgatcttctgttaatcctgtcactcttagacgcaaatctgtaatgcggcgt834