一种巨大芽孢杆菌及其降解拟除虫菊酯类杀虫剂的应用的制作方法

本发明属于农药污染治理技术领域。更具体地，涉及一株降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药的巨大芽孢杆菌(bacillusmegalosporus)菌株hlj7及其生产的菌剂和应用。

背景技术：

拟除虫菊酯类农药包括丙烯菊酯等，丙烯菊酯是由右旋反式第一菊酸和烯丙醇酮酯化而成的一种合成的i型拟除虫菊酯，因其具有触杀、趋避和击倒蚊虫的功效，大多数蚊香、气雾剂、液体喷雾等都以此为原料，尽管已有部分昆虫对这种杀虫剂逐渐产生耐药性，但其仍然对控制虫传病害的传播起着至关重要的作用。随着丙烯菊酯使用范围不断增广，使用剂量不断增大，有关其毒理以及残留物对环境的污染影响的报道也日益增多。

丙烯菊酯能够抑制atp酶的产生，在地表水和食品中经常可以检测到丙烯菊酯残基。丙烯菊酯对啮齿动物具有神经毒性。急性和慢性接触丙烯菊酯可损害组织，包括血液、神经、脂肪和其他组织。空气中残留的丙烯菊酯接触到人体眼角膜上皮细胞通过线粒体途径使得细胞调亡，进而会对人类视力造成负面影响。大量研究表明，丙烯菊酯对环境甚至人类健康具有潜在威胁。因此，如何消除环境中的丙烯菊酯农药残留已成为科研工作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的科研命题。

生物修复技术是一种利用微生物或其他生物将环境中的有害污染物降解为无机小分子化合物的新兴技术，具有高效、安全、无残留、无二次污染等优点，逐渐成为治理农药残留污染的最佳选择方案。

但是，由于微生物对农药的矿化能力和降解性能不稳定，导致现有的降解菌资源库远远不能满足化学农药残留污染生物降解的实际需求。特别是目前还没有专门针对丙烯菊酯的降解制剂产品。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一株丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药降解菌，即巨大芽孢杆菌(bacillusmegalosporus)hlj7。该菌能够快速高效降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药，其在培养11天后对50mg/l的丙烯菊酯降解率达80％以上，可用于修复此类农药残留污染的土壤和水体等环境。

本发明的目的是提供一株高效降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药的巨大芽孢杆菌(bacillusmegalosporus)菌株hlj7。

本发明另一目的是提供所述巨大芽孢杆菌菌株hlj7降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究发现，巨大芽孢杆菌(bacillusmegalosporus)对丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药具有很好的降解作用。并筛选得到一株高效降解菌株，即巨大芽孢杆菌(bacillusmegalosporus)菌株hlj7，于2019年9月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmccno:60760，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明的巨大芽孢杆菌菌株hlj7来源于黑龙江哈尔滨郊区农田土壤，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌株对丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药具有高效快速的降解效能，在培养11天后对50mg/l的丙烯菊酯降解率达80％以上，证明菌株hlj7可以作为优良的生物降解菌应用于丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药污染的生物修复。

因此，以下应用也在本发明的保护范围之内：

巨大芽孢杆菌(bacillusmegalosporus)在降解丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药或制备丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解菌剂方面的应用。

巨大芽孢杆菌(bacillusmegalosporus)在修复丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药的自然环境或制备修复菌剂方面的应用。所述自然环境为水体或土壤。

优选地，所述巨大芽孢杆菌为上述巨大芽孢杆菌菌株hlj7。

优选地，所述拟除虫菊酯类农药为丙烯菊酯、右旋苯醚菊酯、胺菊酯、氯菊酯或氯氰菊酯。

一种高效降解丙烯菊酯的菌剂，含有巨大芽孢杆菌(bacillusmegalosporus)。优选地，所述巨大芽孢杆菌为上述巨大芽孢杆菌菌株hlj7。

本发明具有以下有益效果：

本发明研究发现，巨大芽孢杆菌对丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药具有很好的降解作用，并筛选得到上述高效快速降解菌株hlj7，丰富了农药降解菌的种质资源库，而且该菌对丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药降解效果,显著，在培养11天后对50mg/l的丙烯菊酯降解率达80％以上，证明菌株hlj7在丙烯菊酯等拟除虫菊酯类农药污染环境的生物修复方面具有很大的发展潜力。

附图说明

图1为菌株hlj7的形态学特征。

图2为菌株hlj7的16srdna系统发育树。

图3为丙烯菊酯含量与峰面积关系的标准曲线。

图4为丙烯菊酯的高效液相色谱峰图。

图5为外加甘露醇碳源对丙烯菊酯降解菌hlj7生长的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所述培养基配方如下：

无机盐培养基：2.0g(nh4)2so4；1.5gnahpo4·12h2o；1.5gkh2po4；0.2gmgso4·7h2o；0.01gcacl2·2h2o；0.001gfeso4·7h2o；蒸馏水1000ml；ph＝7.1。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：10.0g蛋白胨(typetone)；5.0g牛肉膏(yeast)；10.0gnacl；蒸馏水1000ml；琼脂1.5％。

基础培养基：13.75gk2hpo4；4.50gkh2po4；2g(nh4)2so4；2g甘露醇；2g甘油；0.2gmgso4·7h2o；0.0132gcacl2；0.009gfeso4；0.003gmncl2；蒸馏水1000ml。

所有的培养基在121℃的高压灭菌锅中灭菌20min。

实施例1农药降解菌株hlj7的分离、筛选和鉴定

1、丙烯菊酯降解菌的富集培养和分离筛选：

采集黑龙江哈尔滨郊区农田土壤，称取5g活性污泥样品加入到50ml含有丙烯菊酯(50mg/l)的上述液体基本培养基中。经30℃，200rpm培养7d后，每次按10％的接种量，将农药质量浓度从50mg/l依次升至100mg/l、200mg/l、400mg/l、800mg/l连续富集培养。然后将转接4次的培养液梯度稀释涂布于含有50mg/l丙烯菊酯的lb固体平板上，30℃倒置培养2d。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编号为hlj7。

2、菌株hlj7形态学鉴定：

将菌株hlj7接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上30℃倒置培养2d，观察其菌落形态。牛肉膏蛋白胨培养基平板培养2d的菌落呈淡黄色椭圆形，菌落大且边缘光滑，质地软，不粘稠，易挑取(见图1)。该菌为革兰氏阳性菌，好氧，产芽孢。细胞杆状，末端圆，单个或呈短链排列。可以液化明胶、水解淀粉、胨化牛奶，不还原硝酸。

3、菌株hlj7的16srdna分子生物学鉴定：

提取菌株hlj7基因组dna，以提取的基因组为模板，采用16srdna细菌通用引物(27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'；1429r：5'-ggttaccttgttacgactt-3')进行pcr扩增，pcr产物委托上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。将菌株测得的16srdna序列在genbank数据库中利用blast进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列利用clustal1.8.1及mage5.0软件构建系统进化树及分析进化关系。如图2所示，本发明分离纯化得到的菌株hlj7的16srdna序列与bacillusmegateriumnbrc15308同源性最高，进化距离最近。

因此，综合形态学观察、生理生化特性及16srdna序列分析，菌株hlj7鉴定为巨大芽孢杆菌(bacillusmegalosporus)，并于2019年9月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmccno:60760，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2巨大芽孢杆菌菌株hlj7对丙烯菊酯的降解能力测定

1、实验方法

(1)种子液制备：

将纯化后的菌种hlj7接入含有5ml的lb液体培养基过夜活化培养至对数期，4℃低温离心后菌体用生理盐水(0.9％nacl)冲洗，所得菌体作为接种体。

(2)降解性能测定：

按1.0×10⁷cfu/ml湿菌体的接种量，分别向50ml含有丙烯菊酯(50mg/l)的基础培养基和无机盐培养基中接种，并分别以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，200rpm恒温摇床培养11d，定期取样，采用分光光度计测定od600值表示菌株hlj7的生长情况，采用hplc测定其对丙烯菊酯的降解情况。

(3)色谱条件：

采用2690型高效液相色谱仪(water，美国)。色谱柱为c18反相柱(phenomenex,250nm×4.60mm,5μm)，进样温度为28℃，进样量10μl，流速0.7ml/min，流动相为色谱乙腈：超纯水＝80：20，检测波长254nm。

按照下式计算丙烯菊酯降解率：

其中为加菌组农药残留质量浓度，为ck组农药残留质量浓度，单位为mg/l。

(4)质量控制：采用外标法校正标准物质制作标准曲线。

(5)添加回收率测定:设置添加回收实验，配制标准样品，向20ml无菌水中加入丙烯菊酯使其质量浓度分别为5mg/l、10mg/l、25mg/l、50mg/l、100mg/l，再向其中加入20ml丙酮，超声30min后提取并采用hplc进行测定，计算添加回收率。

2、实验结果如下：

(1)丙烯菊酯的含量与峰面积关系的标准曲线：丙烯菊酯的含量与峰面积呈良好的线性关系。丙烯菊酯的标准曲线方程为：y＝2.6552x+88327(r²＝0.9974)。见图3。

(2)添加回收率测定:标准样品中丙烯菊酯的添加回收率试验结果见表1。

表1标准样品中丙烯菊酯的添加回收率

表中数据分析得出，丙烯菊酯的添加回收率区间为84.7％～92.3％。

(3)外加碳源对丙烯菊酯降解菌生长状况的影响:通过对挑选出的高效降解菌株hlj7在以丙烯菊酯为唯一碳源条件下和在基本培养基中以甘露醇为外加碳源条件下菌株的1、3、5、7天的od600值进行测定，得到如图5所示分析图。由图中数据可以得知，外加甘露醇对丙烯菊酯降解菌株hlj7影响显著，外加甘露醇能够增加降解菌的生长，在以丙烯菊酯为唯一碳源msm中，菌株生长数值小且增量较少，而外加甘露醇作为碳源时，降解菌株hlj7生长数量明显增长。

(4)丙烯菊酯降解菌的降解效果：

结果如表2所示，菌株hlj7能快速降解丙烯菊酯。在含有50mg/l丙烯菊酯的基础培养基中，菌株hlj7快速生长没有产生明显的滞后期，并迅速进入生长对数期。培养5、7、9和11d后，降解菌株hlj7对50mg/l的丙烯菊酯降解率分别达到48.6％、58.3％、69.4％和82.3％，而对照(自然降解率)仅为8.6％。

该结果说明菌株hlj7可利用丙烯菊酯作为生长基质进行生长繁殖，在丙烯菊酯浓度为50mg/l时，培养至11d，降解率达到82.3％，表明该菌株具有高效快速降解丙烯菊酯的能力。

表2菌株hlj7对丙烯菊酯的降解能力

另外测试显示，巨大芽孢杆菌菌株hlj7对其他拟除虫菊酯类农药如右旋苯醚菊酯、胺菊酯、氯菊酯和氯氰菊酯也具有很好的降解作用。

实施例3巨大芽孢杆菌菌株hlj7降解土壤中丙烯菊酯的效果测定

1、供试土样

农田表层土(3～10cm)，取自华南农业大学教学农场试验田，属红壤土，超过3年未施用丙烯菊酯农药。

土壤样品取回后首先置于阴凉通风处自然风干，风干后碾磨，过2mm筛，分别取一定量的丙烯菊酯溶于丙酮中，然后浸泡硅藻土，使丙烯菊酯被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中丙烯菊酯的终浓度为50mg/kg。取500g土样于30℃恒温恒湿培养箱中培养，按1.0×10⁷cfu/ml的接种量接入hlj7降解菌悬液，以加蒸馏水的作为对照，土壤的持水量保持在40％。在30℃和避光条件下连续培养15天，并定期取样，hplc法测定丙烯菊酯残留量并计算降解率。降解率计算方法如实施例2。

2、测定结果如表3，培养15d后，菌株hlj7对土壤中的丙烯菊酯降解率可达到77.1％。

表3菌株hlj7降解土壤中丙烯菊酯效果

结果表明，菌株hlj7在直接施入土壤中后，没有出现不降解或降解滞后效应。