一种烟碱拟杆菌及其在病害防治中的应用的制作方法

本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一种烟碱拟杆菌及其在病害防治中的应用。

背景技术：

十字花科蔬菜种类很多，其中主要包括大白菜、小青菜、甘蓝、萝卜、花椰菜等，在我国蔬菜销售市场占有很大的份额。软腐病、病毒病和霜霉病是世界性的十字花科蔬菜的三大病害(颜邦斌，樊平.十字花科蔬菜软腐病的综合防治[j].四川农业科技,2001,11:32)。其中软腐病不仅仅危害十字花科蔬菜，还能够侵染莴苣、马铃薯、番茄、茄子、辣椒、黄瓜、胡萝卜、芹菜、葱、猕猴桃等作物，但以白菜、萝卜和甘蓝受害最为严重，造成严重的经济损失。在软腐病严重的年份造成大白菜减产50％以上，甚至成片无收；在运输、销售、贮藏过程中引起腐烂会加重损失(刘志恒.十字花科蔬菜软腐病和黑腐病[j].新农业,2002,8:38-39)。北京市芹菜种植的主要地区为大兴、顺义及通州区县，其中通州区的果村是专业生产芹菜的村落，该村一度成为优质芹菜的主要产地。但是，近几年在芹菜种植过程中出现了破坏性较强的软腐病，引起了巨大的经济损失，严重受灾区域甚至绝产(晋知文，宋加伟，谢学文，等.芹菜细菌性软腐病病原的分离与鉴定[j].植物病理学报,2016,3:304-312)。猕猴桃因其具有丰富的营养和较高的药用价值被誉为，是广受欢迎的水果之一。猕猴桃软腐病是贮藏期危害最为严重的病害。该病病程短，难于防治，给猕猴桃产业带来巨大的威胁(周游.猕猴桃软腐病病原学研究[d].四川农业大学,2016)。

软腐病的主要致病菌为胡萝卜软腐果胶杆菌，是多种经济作物的细菌软腐病重要病原菌。胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovora,pcc)和胡萝卜软腐果胶杆菌黑胫亚种(pectobacteriumcarotovorumsubsp.atroseptica,pca)均属于此种，并能够引起软腐病。其中pcc引发的细菌性软腐病发生范围广泛，在多国均有发生并且危害严重，已经成为世界性病害。pcc可以合成和分泌水解酶(果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶)来破坏植物细胞壁，使植物组织结构受到破坏，同时也可以获得水分和营养成分以支持自身生长和繁殖。而pcc水解酶的合成和分泌受到群体感应系统的调控，pcc自身可以产生并分泌一种或多种化学物质，当其群体密度变大时，这种或这些化学物质浓度随之增大，化学物质浓度到达一定阈值后，pcc水解酶的合成和分泌基因开始表达，从而pcc具有致病性。这些化学物质被称为群体感应信号分子或自诱导剂(autoinducers,ais)(whiteleym,digglesp,greenbergep.progressinandpromiseofbacterialquorumsensingresearch[j].nature,2017,551:313-320.)pcc的群体感应信号分子为n-酰基高丝氨酸内酯类物质(n-acylhomoserinelactones,ahls)中的n-(3-oxohexanoyl)-l-homoserinelactone(ohhl)。

噻菌酮、噻枯唑、代森铵、硫酸链霉素及中生菌素等化学农药被用来防治细菌性软腐病。然而，化学农药的大量使用已经带来了众所周知的环境污染、生态平衡破坏、病原菌抗药性和食品安全等一系列严重问题，另外，抗生素的滥用亦引起了微生物耐药性的产生。所以，一种新的，有效的，毒性最小的病害防治策略--群体感应淬灭(quorumquenching,qq)被发现。群体感应淬灭是指通过抑制信号分子的合成、积累、监测，或对信号分子进行酶降解或修饰的机制来干扰群体感应系统，抑制微生物与致病性相关的基因的表达，减弱微生物的致病性，从而达到防治病害的目的。

群体感应淬灭是通过调控群体感应系统进行来防治病害，所以不会对微生物产生选择压力，理论上细菌不会产生抗药性。群体感应淬灭是一种有效防治植物细菌病害的新途径，具有操作简便、经济实用、环境友好、效率高且周期短等优点。针对不同群体感应信号发展群体淬灭制剂是目前国际范围的研究热点。如本发明人团队前期研究显示(201711248767.6)硝基还原假单胞菌(pseudomonasnitroreducens)具有较好的微生物群体感应信号分子的作用，群体淬灭方向、抑制软腐病病害、防治依赖微生物群体感应信号介导致病的病原菌危害方面具有巨大推广应用的潜力。更多、更优秀的微生物降解菌库的充实建设，对依赖微生物群体感应信号介导致病的病原菌危害的防治意义重大。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种新的、降解效果更好的微生物群体感应信号分子dsf/ahls淬灭菌，即烟碱拟杆菌(paenarthrobacternicotinovorans)菌株d-9，及其在生物防治中解决作物病害的应用。该菌株对多种ahls群体感应信号分子具有显著且快速的降解作用，在防治群体感应信号分子介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力，这为以生物防治替代化学防治且以阻断群体感应为靶标而不引起选择压力的防治策略提供了新的开发途径。

本发明的目的是提供一株可降解微生物群体感应信号分子的烟碱拟杆菌(paenarthrobacternicotinovorans)菌株d-9。

本发明另一目的是烟碱拟杆菌在淬灭微生物群体感应信号分子中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究发现，烟碱拟杆菌(paenarthrobacternicotinovorans)具有非常高效的降解微生物群体感应信号分子的作用，并筛选得到一株高效降解菌烟碱拟杆菌菌株d-9，已于2019年6月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmccno.60691，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

该从采集自华南农业大学树木园及兰花大棚土壤样本，经分离纯化筛选获得，对该菌株的16srdna序列、形态学特征进行分析，菌株d-9被鉴定为烟碱拟杆菌(paenarthrobacternicotinovorans)。

菌株d-9的菌落形态特征为：在营养琼脂平板上培养24h，菌落呈白色，圆形，凸起，不透明，边缘整齐，表面较光滑。

电镜观察菌体的形态特征为：细胞呈杆状。

所述菌株d-9对庆大霉素(gen)与羧苄青霉素(carb)表现出高浓度敏感，而低浓度具有抗性，达到40mg/ml；对氨苄青霉素(amp)、卡那霉素(kan)、链霉素(str)及四环素(tc)高度敏感，无论浓度高低均不表现抗性。

实验结果表明，该烟碱拟杆菌菌株d-9对中长链的ahls群体感应信号分子具有淬灭活性，能够显著且快速的降解中长链的ahls。菌株d-9可在浓度高达0.4mm的以群体感应信号分子ohhl为唯一碳源的基础盐培养基中正常生长并在32h内将ohhl完全分解。在防治ahls类群体感应信号分子介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力。

因此，烟碱拟杆菌在淬灭群体感应信号分子ahls中的应用，或在制备降解ahls的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

烟碱拟杆菌在防治群体感应信号分子ahls介导致病的植物病害中的应用，或在制备依赖群体感应信号分子ahls致病的致病菌的防治制剂方面的应用也属于本发明的保护范围。

优选地，上述任一所述的应用中，所述烟碱拟杆菌为烟碱拟杆菌菌株d-9。

一种防治依赖ahls群体感应信号分子致病的致病菌病害的方法，是用烟碱拟杆菌菌株d-9的菌液对作物进行处理，以预防依赖ahls致病的致病菌的侵染。

优选地，所述处理的方式为对作物进行接种处理。

优选地，应用时，所述的烟碱拟杆菌淬灭ahls的最适ph为6.5，最适温度为30℃。

实验显示，烟碱拟杆菌菌株d-9对依赖ahls致病的病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(pcc)引起的病害具有显著的生防作用。

一种含有上述烟碱拟杆菌菌株d-9和/或其菌液的可降解群体感应信号分子ahls的降解菌剂，以及一种含有菌株d-9和/或其菌液的依赖ahls致病的病原菌的生防制剂，也都应在本发明的保护范围之内。

为了达到更好的降解微生物群体感应信号分子的作用，本发明同时还提供了在富营养培养基中所述菌株d-9菌液的制备方法：具体是将菌株d-9划线于lb固体培养基平板上，30℃下培养24h，挑取单菌落接种于lb液体培养基中预培养至对数期，得到菌株d-9菌液。菌液的浓度不做严格限制，具体可根据实际病害程度和应用效果进行调整。

优选地，所述lb培养基为：胰蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，氯化钠10.0g/l，ph6.8～7.2，121℃灭菌20min。lb固体培养基配方是在液体培养基中加入1.5％(w/ν)的琼脂。

本发明具有以下有益效果：

本发明研究发现，烟碱拟杆菌对多种ahls群体感应信号分子具有淬灭活性，能够快速且显著地降解多种ahls群体感应信号分子，在防治ahls介导致病的致病菌危害方面有巨大的应用潜力，这为以生物防治替代化学防治且以阻断群体感应为靶标而不引起选择压力的治疗策略提供了新的开发途径。

同时，本发明筛选获得了一株烟碱拟杆菌(ochrobactrumintermedium)d-9，可在浓度高达0.4mm的ohhl为唯一碳源的培养基中正常生长，在32h内可完全降解群体感应信号分子ohhl，具有显著的生物降解效果。同时，该菌株对其他ahls，如：oohl和oddhl也具有较好降解效果。

依据本发明，由于菌株d-9具有稳定高效降解植物病原菌中群体感应ahls信号分子的特性，因此，菌株d-9可应用于自然环境中ahls介导致病的植物致病菌的防治，既可以减少农药滥用问题，又给植物病害防治带来了新思维、新途径和新方法。

附图说明

图1为本发明的菌株d-9在lb培养基上的正反面菌落形态图。

图2为本发明的菌株d-9的扫描电镜图。

图3为本发明的菌株d-9的系统进化树分析图。

图4为本发明的菌株d-9在不同抗生素中的生长情况图。

图5为本发明的菌株d-9对ohhl淬灭活性结果图(e.coli为阴性对照，b23为阳性对照)。

图6为本发明的菌株d-9对ohhl降解的hplc图(线1为未接种菌株d-9的对照图，线2、3分别为菌株d-9对ohhl降解8h和16h的高效液相色谱(hplc)图)。

图7为本发明的菌株d-9以ohhl为唯一碳源时的生长曲线和降解曲线图。

图8为本发明的菌株d-9、e.coli、b23分别与z3-3共同接种于白萝卜块茎24h后的发病情况。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1烟碱拟杆菌菌株d-9的获取与鉴定

1、菌株d-9的分离、筛选

(1)土样采集：采集自华南农业大学树木园及兰花大棚土壤样本作为微生物源

土样分离从广东省华南农业大学内，进行取样、装袋、保存作为微生物源带回实验室进行菌株分离。

(2)菌株的富集培养：制备基础盐(msm)培养基，分装至100ml锥形瓶中，每瓶各50ml。称取5g土样，无菌条件下在锥形瓶中加入土样(5g)以及ahls信号分子(c6o3hsc,100mmol,12.5μl)，置于200rpm，30℃摇床中7天。约一周后，在无菌条件下取出1ml溶液，ahls信号分子浓度加大为原来的两倍(即25μl)，一并添加到新的msm培养基中，置于200rpm，30℃摇床中7天。以此类推，每个土样递增式富集培养8次，各换瓶7次，不断增加ahls信号分子在培养基中的浓度，达到富集菌株的目的。

其中，所述基础盐(msm)培养基的配方为：硫酸铵2g；七水合硫酸镁0.2g；二水合氯化钙0.01g；七水合硫酸亚铁0.001g；十二水合磷酸氢二钠1.5g；磷酸二氢钠1.5g；ph6.5。

(3)菌株分离与纯化：采用稀释、平板涂布法进行分离。

按照10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的6个梯度浓度，取1ml最后一个msm培养基的发酵液，用无菌水依次进行稀释，然后吸取0.1ml各个浓度的发酵液均匀地用涂布棒涂布在lb固体平板上，置于30℃培养箱培养24h。根据观察，选取单菌落形态较好的对应浓度的固体培养基。一般地，单菌落在10-4、10^-5、10^-6浓度的平板中形态较好，单菌落相对较小且独立分散。紧接着，在这三个浓度的培养基中，共选取35个不同的单菌落，分别在35个lb固体培养皿中划板，做好标记，置于30℃培养箱培养24h以上。上述培养24h的菌落，记为纯化的第一代。在第一代的培养基中各挑取一个单菌落，划线接种到新的lb固体培养基中，放置在30℃培养中24h以上，此视为纯化的第二代。以此类推，不断地划线接种和培养，直到完成第五代纯化。

(4)菌株筛选：利用报告菌株(agrobacteriumtumefaciensnt1)对从土样中分离得到的菌株进行筛选。

在-80℃冰箱取出保藏菌种，分别将实验菌种划线接种到lb固体平板上，将cf11报告菌株接种到卡那平板上。实验菌株的平板放置在30℃培养箱，培养24h；cf11报告菌株的平板放置在28℃培养箱，培养48h。用牙签在平板上分别挑取单菌落放入管中，每个离心管做好标记，在30℃，200rpm摇床中过夜摇菌。将菌液进行离心(4000rpm，5min)，超净工作台中倒掉上清液，加入含有ahls的msm液体培养基各1ml，并设置ck对照管；培养24h后取5μl反应混合物点样至1cm宽的mm琼脂条顶端，然后在下方点一排可以检测ahls的报告菌株cf11(agrobacteriumtumefaciensnt1)。其中mm琼脂条的ph值为6.5，琼脂条中含有40μg/ml的x-gal。将mm琼脂条放置在28℃培养箱，避光培养24h后观察实验结果。

其中，所述基础(mm)培养基的配方为：硫酸铵2g；七水合硫酸镁0.2g；无水氯化钙0.01g；硫酸亚铁0.005g；氯化锰0.002g；磷酸氢二钾10.5g；磷酸二氢钾4.5g；ph6.5。

实验相关原理：ahls信号分子能够沿着mm固体培养基的琼脂条实现扩散，其扩散距离正比于其本身浓度。当mm固体培养基的琼脂条上存在ahls信号分子时，对应条带的报告菌株cf11则开启转录表达β-半乳糖苷酶的相关基因，随即向环境中释放β-半乳糖苷酶；此时，培养基中的x-gal接触到β-半乳糖苷酶，被催化分解产生5-溴-4-靛蓝。其中，x-gal本身为无色化合物，5-溴-4-靛蓝为深蓝色化合物。

空白对照为lb液体，不具备ahls信号分子降解能力，对应琼脂条上的ahls信号分子浓度高，扩散距离远，β-半乳糖苷酶正常表达，x-gal发生酶解反应，导致斑点变蓝；筛选菌中，若具备较强ahls信号降解分子能力，使之无法在环境中扩散，x-gal不被分解，则斑点呈现白色，若ahls信号分子降解能力较弱或不具备ahls信号分子降解能力则斑点变成蓝色。自两端至中间，蓝色斑点越多，则ahls降解能力越弱，反之越强。分析实验结果发现，标号为d-9的菌株具有较强的淬灭ahl的能力，待进一步研究。

2、菌株d-9的鉴定及系统进化分析

(1)菌落形态特征(图1所示)：在营养琼脂平板上培养24h，菌落呈白色，圆形，凸起，不透明，边缘整齐，表面较光滑。

(2)菌体形态特征：如图2所示，细胞呈杆状。

(3)16srdna序列及系统进化分析：菌株d-9的16srdna基因序列长度为1386bp，与ncbi数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，发现所述菌株d-9与paenarthrobacternicotinovorans具有很好的同源性(>99％)，其系统进化树如图3所示。

综上所述，通过对菌株d-9的16srdna序列、形态学特征进行分析，将菌株d-9鉴定为烟碱拟杆菌(paenarthrobacternicotinovorans)，并于2019年6月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmccno.60691，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。。

实施例2菌株d-9的抗生素敏感性分析

1、为了能够更好地研究实施例1获得的菌株d-9的生防潜力，我们对该菌株的生物学特性进行了深入的研究。实验研究了菌株d-9对不同抗生素的敏感性，方法如下：

将菌株d-9划线活化于固体lb平板，挑取单菌落接种到1ml液体lb中，在30℃、200rpm条件下培养，直至菌液od600值位于1.0～1.5；每种抗生素设置13个浓度梯度进行检测，分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml，及一个空白对照。将卡那霉素(kan)、氨苄青霉素(amp)、庆大霉素(gen)、链霉素(str)、羧苄青霉素(carb)、四环素(tc)等6种抗生素按不同浓度加入到具有5ml液体lb的离心管中，每个浓度设置两个平行。再每管接种1μl菌液，在30℃、200rpm摇床中培养9h，测量每管混合体系的od600值并记录，观察所筛选的淬灭菌在不同抗生素种类及不同抗生素浓度梯度中的生长状况。

2、实验结果表明(如图4)：所述菌株d-9对庆大霉素(gen)与羧苄青霉素(carb)表现出高浓度敏感，而低浓度具有抗性，达到40mg/ml；对氨苄青霉素(amp)、卡那霉素(kan)、链霉素(str)及四环素(tc)高度敏感，无论浓度高低均不表现抗性。这一结果利于后续研究中选取合适的抗生素作为参考。

实施例3菌株d-9淬灭活性鉴定

1、菌株培养与样品采集：30℃条件下，将菌株d-2在lb固体平板上进行活化。挑取单菌落接种至lb液体培养基，以30℃，200rpm条件过夜培养得到菌液。取一定体积(v＝1/od600)的菌液以4000rpm、10min的条件进行离心，弃上清，得到一个od600值的菌体。将1个od600值的菌体，接种至1ml分别以不同ahls作为唯一碳源的msm无机盐培养基中。将反应混合物分别放置于2ml离心管中，使离心管在30℃，200rpm的条件下培养24h。24h后，取5μl反应混合物点样至1cm宽的mm琼脂条顶端，然后在下方点报告菌株(agrobacteriumtumefaciensnt1)菌液。然后将已经好反应混合物和报告菌株的琼脂条放置于28℃培养箱，避光培养24h后观察实验结果。其中，琼脂条为含有浓度为40μg/mlx-gal的mm板切条所得。根据琼脂条上报告菌株自顶端变蓝的距离可以判断出样本中酰基高丝氨酸内酯(ahls)含量的多少。从而确定菌株d-2对不同ahls是否具有淬灭活性。

2、在试验中，以已知能够淬灭多种ahls的苏云金芽孢杆菌以色列亚种(bacillusthuringiensissubsp.israelensis)b23为阳性对照，以不具备淬灭ahls活性的大肠杆菌(escherichiacoli)作为阴性对照。试验结果显示(如图5)，在ohhl、oohl、oddhl试验组中，ck与阴性对照e.coli的ahls扩散距离一致，即两者反应混合物中ahls含量相近；阳性对照b23与实验组d-9的琼脂条上的报告菌株均未变蓝，两者的反应混合物中不含有ahls，ahls已经被菌株d-9降解完全。表明菌株d-9对ahls信号分子ohhl具有淬灭活性。

实施例4菌株d-9生长和降解ohhl关系曲线的测定

1、接种：自-80℃冰箱划线活化d-9，30℃培养24h后，挑取单菌落至8～10ml液体lb中摇菌培养至对数期(30℃，200rpm)，od600值约为1.0～1.5；取特定体积的菌液(v＝1/od600)至灭菌的2ml离心管中，10000rpm离心1min，弃上清液。用灭菌的msm培养基中溶液重悬浮沉淀的菌体后，接种至20mlmsm培养基中，添加ahls母液(浓度为100mmol/l)，使培养基体系中信号分子终浓度为0.4mmol/l，在30℃、200rpm摇床中培养，定时取样检测。设定为每8小时取样一次，一直到第48小时，时间点为8h、16h、24h、32h、40h、48h，共6个取样点。

2、取样：在每个培养基中各取7ml液体至15ml离心管中，其中1ml用以测量od600值(超纯水调零)并记录；其余6ml在4000rpm条件下离心5min，取其中5ml上清液至玻璃刻度试管中，等待萃取。

3、萃取与旋蒸：用等量乙酸乙酯萃取上述上清液，在分液漏斗中充分震荡后静置分层，将下层液体回收至原玻璃刻度试管，等待二次萃取，上层溶液经滤纸过滤到圆底烧瓶中；二次萃取后，弃去下层液体，上层液体同样过滤至同一圆底烧瓶；将圆底烧瓶中液体经旋转蒸发仪充分蒸发后，用2ml乙腈重新溶解圆底烧瓶中附着物质，每次使用1ml乙腈，分两步重复进行，全部转移至干净试管中；再利用注射器将试管中样品溶液经微孔滤膜转移到色谱小瓶，封口待测。

4、hplc测定：

3oc6hsl的hplc测定方法的各部分参数如下：①hplc：waters2695；②色谱柱：kinetexevoc18反相色谱柱(250μm×4.6mm×5μm)；③流速：0.5ml/min；④柱温：30℃；⑤流动相：乙腈：水＝30：70(v：v)；检测波长：210nm；进样量：20μl。

5、hplc检测结果如图6所示(其中线1为未接种菌株d-9的对照图，线2，3为菌株d-9对ohhl8h和16h降解图)，在8h、16h菌株d-9对ohhl降解率分别达到91.8％，99.8％。相应的菌株d-9以ohhl为唯一碳源时的生长曲线和降解曲线图如图7所示。

如图7所示，在0～12h，菌株生长速度最快，40～48h次之。在0～12h，信号分子ahls(ohhl)被降解的速率最大；到达第12h，信号分子ahls(ohhl)几乎被完全完全降解。在本次实验中，在8h，16h，24h，32h，40h，48h时，降解率分别达到：91.8％，99.8％，99.9％，100％，100％，100％。综上可得，淬灭菌d-9的生长与信号分子的降解基本呈现正相关的状态。烟碱拟杆菌d-9对ahls信号分子具有较明显且高效的降解作用，对于防治介导ahls信号分子致病的一类病害具有巨大的可应用价值。

实施例5菌株d-9对白萝卜软腐病的的生防效果研究

本实施例以引起马铃薯软腐病的病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovora,pcc)z3-3(刘春妍等.不动杆菌属中aide基因编码高丝氨酸内酯酶[j].生物工程学报,2017,33:1625-1639.)为例，研究菌株d-9对依赖ahls致病的致病菌的生防效果。

接种试验中，淬灭菌d-2、大肠杆菌e.coli、苏云金芽孢杆菌b23均为安全不致病的菌种。

1、苏云金芽孢杆菌b23、大肠杆菌e.coli、菌株d-9、胡萝卜软腐果胶杆菌z3-3划线于lb固体平板上，30℃培养。分别挑取平板上的单菌落，接种至液体lb培养基中，以30℃、200rpm的条件过夜培养，得到菌液。

用液体lb将b23、e.coli、菌株d-9和致病菌z3-3的菌液调整至1×10⁷cfu/ml。将z3-3分别与b23、e.coli、d-9和液体lb培养基以一定比例混合，并将5μl混合菌液分别接种至马铃薯上。即分别设置lb+z3-3、z3-3+e.coli、z3-3+b23、z3-3+d-9，四个实验组。将接种好的马铃薯放置在28℃生化培养箱，24h后观察其发病情况并拍照。

2、如图7所示，z3-3+lb和z3-3+e.coli实验组的白萝卜块茎病斑面积较z3-3+b23和z3-3+d-9实验组的马铃薯发病面积明显较大，发病较为严重。即淬灭菌d-9与致病菌共同接种较单独接种致病菌时无软腐病病害症状出现。

实验结果表明，菌株d-2对果胶杆菌z3-3引起的白萝卜软腐病具有一定程度的生物防治效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。