一种天然来源的多糖及促进皮肤修复、提高皮肤弹性进而制备化妆品的用途的制作方法

本发明属于化妆品领域，涉及天然来源的多糖在化妆品中用途，具体涉及一种天然来源的多糖及促进皮肤修复、提高皮肤弹性进而制备化妆品的用途。
背景技术：
：爱美是人之天性，但是随着年龄的增长，人的皮肤修复能力和皮肤弹性会下降。人的皮肤修复能力主要取决于人皮肤成纤维细胞的增殖速度和迁移能力，人的年龄增长后，皮肤成纤维细胞的增殖速度和迁移能力下降是皮肤修复能力下降的直接原因。人的皮肤弹性主要与胶原蛋白和弹性蛋白含量有关。胶原蛋白和弹性蛋白分别组成胶原纤维和弹性纤维，胶原纤维主要支撑体积，保持水分，让皮肤饱满，弹性纤维主要使皮肤能够伸展和回弹，二者共同决定了皮肤的弹性。由此可见，若要提高人的皮肤修复能力和皮肤弹性，需要寻找到可以提高皮肤成纤维细胞的增殖速度和迁移能力、胶原蛋白和弹性蛋白合成的成分。天然植物来源的多糖因其与人皮肤相容性好、温和无刺激、来源充足而广泛应用于化妆品领域，如用于化妆品美白祛斑、保湿补水等。蜂斗菜为一种极为常见的多年生草本植物，但是利用程度极低，造成极大的资源浪费。技术实现要素：本发明第一目的在于提供一种天然来源的多糖，第二目的在于提供该多糖促进皮肤修复、提高皮肤弹性进而制备化妆品的用途。实现本发明目的的技术方案为：一种天然来源的多糖，通过如下如下方法制备：将蜂斗菜的干燥全草粉碎，添加无水乙醇热回流提取脱脂，过滤，滤渣加入蒸馏水，加热提取，过滤，收集滤液，滤液减压浓缩至浸膏状，加入适量蒸馏水，搅拌使充分溶解，抽滤，滤液加入4倍体积无水乙醇，搅拌均匀，醇沉，离心，弃上清，依次用丙酮、无水乙醇洗涤，用适量蒸馏水溶解，冻干。优选地，脱脂步骤中，按照料液比1:5添加无水乙醇热回流提取3h脱脂。优选地，蒸馏水提取步骤中，滤渣按照料液比1:10加入蒸馏水，85℃加热提取12h。优选地，醇沉时间为12h。上述的多糖用于促进皮肤修复的用途。上述的多糖用于制备促进皮肤修复的化妆品的用途。上述的多糖用于提高皮肤弹性的用途。上述的多糖用于制备提高皮肤弹性的化妆品的用途。有益的效果：本发明提供的天然来源的多糖一方面可以促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移，具有促进皮肤修复的作用；另一方面可以促进人皮肤成纤维细胞产生胶原蛋白和弹性蛋白，具有提高皮肤弹性的作用。而且，该多糖对人皮肤无明显刺激，因而具有用于制备促进皮肤修复、提高皮肤弹性的化妆品的价值。附图说明图1为细胞划痕试验中倒置显微镜拍照结果；图2为i型胶原蛋白与弹性蛋白表达水平的westernblot结果。具体实施方式一、实验方法1、多糖的制备将蜂斗菜的干燥全草粉碎，按照料液比1:5(kg:l)添加无水乙醇热回流提取3h脱脂，重复脱脂1次，过滤，滤渣按照料液比1:10(kg:l)加入蒸馏水，85℃加热提取12h，过滤，收集滤液，滤液减压浓缩至浸膏状，按照料液比1:5(kg:l)加入蒸馏水，搅拌使充分溶解，抽滤，滤液加入4倍体积无水乙醇，搅拌均匀，醇沉12h，离心，弃上清，依次用丙酮、无水乙醇洗涤，用适量蒸馏水溶解，冻干，即得蜂斗菜多糖。2、人皮肤成纤维细胞培养和传代将人皮肤成纤维细胞hff-1，用含有15％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基于37℃、5％co2培养箱中培养，每3d换一次培养液，等到细胞生长融合达到85％左右时，用0.25％胰蛋白酶消化，按1:3比例传代。取对数生长期细胞用于试验。3、促进皮肤修复活性测试3.1促进人皮肤成纤维细胞增殖(mtt试验)取对数生长期细胞，消化，用含有15％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基制成浓度为1×105/ml的细胞悬液，接种于96孔板，每孔150μl，37℃、5％co2培养箱中培养24h后，更换培养基为含有50μg/ml蜂斗菜多糖、15％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基继续培养，继续培养24h、48h后，吸弃培养基，pbs洗涤，加入150μl含有15％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基以及20μlmtt溶液(5mg/ml)，37℃、5％co2培养4h，吸弃上清，每孔加入dmso150μl，摇床振荡10min，使结晶物充分溶解。同时设置对照组，对照组与多糖组相比仅不添加蜂斗菜多糖，其余完全相同，每组5个复孔。于490nm处测量各孔的吸光度，并按照如下所示的计算公式计算多糖组的促增殖率。促增殖率(％)＝(多糖组吸光度值-对照组吸光度值)÷对照组吸光度值×100％3.2促进人皮肤成纤维细胞迁移(细胞划痕试验)取对数生长期细胞，消化，用含有15％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基制成浓度为1×105/ml的细胞悬液，接种于6孔板，每孔2ml，37℃、5％co2培养箱中培养24h后，用1ml移液枪尖端轻轻于各培养孔中央分别笔直划痕，pbs洗涤，多糖组加入2ml含有50μg/ml蜂斗菜多糖、15％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基，对照组加入2ml含有15％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基，各3个复孔，继续培养24h后于倒置显微镜下观察并拍照，使用imagej软件测量划痕距离，并按照如下所示的计算公式计算多糖组的促迁移率。促迁移率(％)＝(对照组划痕距离-多糖组划痕距离)÷对照组划痕距离×100％4、提高皮肤弹性活性测试采用westernblot法测定蜂斗菜多糖对人皮肤成纤维细胞中i型胶原蛋白与弹性蛋白表达水平的影响。具体方法如下：取对数生长期细胞，消化，用含有15％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基制成浓度为1×105/ml的细胞悬液，接种于6孔板，每孔2ml，37℃、5％co2培养箱中培养24h后，多糖组更换培养基为含有20、50μg/ml蜂斗菜多糖、15％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基，对照组更换培养基为含有15％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基继续培养，继续培养48h后，吸弃培养基，pbs洗涤，收集细胞、裂解，按照bca试剂盒说明书提取总蛋白并计算蛋白浓度，分别取50μg蛋白进行sds-page电泳分离后，将蛋白转移至pvdf膜，用脱脂奶粉封闭，4℃一抗孵育过夜，洗涤后加入二抗室温孵育1h，通过化学发光成像系统拍照比较多糖组与对照组i型胶原蛋白与弹性蛋白表达水平的差异。5、对皮肤刺激性测试根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)，按受试者入选标准选择30名受试人员，选用合格斑贴材料，取0.025g上述方法制备的蜂斗菜多糖放入斑试器内，对照孔不加任何物质。将加有受试物的斑试器用无刺激胶带贴敷于志愿者的背部，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，斑试器持续停留在皮肤上24h。去除斑试器后间隔30min，待压痕消失后观察皮肤反应。斑贴试验后24和48h分别观察一次。结果判断，0级反应：受试部位无反应；1级反应：皮肤出现淡红斑；2级反应：皮肤出现红斑、浸润或丘疹；3级反应：皮肤出现水肿性红斑、丘疹；4级反应：皮肤出现显著红肿、伴丘疹或大疱。6、统计学处理使用spss17.0分析，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析one-wayanova检验方差齐性，并用student’s-ttest进行分析，p<0.05表示差异具有显著性。三、实验结果1、多糖促进皮肤修复活性mtt试验结果如表1所示，与对照组相比，多糖组吸光度值显著升高，且多糖对人皮肤成纤维细胞的促增殖率呈现时间依赖性。表1不同时间点各组吸光度值对照组多糖组促增殖率24h0.36±0.090.55±0.1152.8％48h0.58±0.120.97±0.1467.2％细胞划痕试验结果如图1所示，与对照组相比，多糖组划痕距离显著减小，蜂斗菜多糖的促迁移率为(73.9±3.4)％(复孔1：71.9％、复孔2：71.9％、复孔3：77.8％)。mtt试验结果和细胞划痕试验结果表明，蜂斗菜多糖可以促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移，具有促进皮肤修复的作用。2、多糖提高皮肤弹性活性westernblot法测定结果如图2所示，与对照组相比，多糖组人皮肤成纤维细胞的i型胶原蛋白与弹性蛋白表达水平显著升高，且具有浓度依赖性，该结果表明，蜂斗菜多糖可以促进人皮肤成纤维细胞产生胶原蛋白和弹性蛋白，具有提高皮肤弹性的作用。3、多糖斑贴试验结果斑贴试验结果如表2所示，可见蜂斗菜多糖对人的皮肤较为温和，可以用于制备化妆品以提高化妆品促进皮肤修复、提高皮肤弹性的功效。表2斑贴试验结果上述实施例表明，本发明提供的天然来源的多糖一方面可以促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移，具有促进皮肤修复的作用；另一方面可以促进人皮肤成纤维细胞产生胶原蛋白和弹性蛋白，具有提高皮肤弹性的作用。而且，该多糖对人皮肤无明显刺激，因而具有用于制备促进皮肤修复、提高皮肤弹性的化妆品的价值。当前第1页12