一种结核杆菌阿拉伯半乳聚糖适配子及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及结核杆菌阿拉伯半乳聚糖适配子及其应用。

背景技术：

结核病(tb)是由结核分枝杆菌(mtb)引起的慢性传染病，并且是单一传染因子的第二大死亡原因。世界卫生组织估计，2017年有100万人患结核病，160万人死于结核病。世界卫生组织提出了在2035年结束全球结核病流行的目标。了解结核病的发病机制有助于更有效地诊断和治疗结核病。

mtb的特异性细胞壁结构对于其存活和繁殖至关重要，其由分枝菌酸(mycolicacid，ma)、阿拉伯半乳聚糖(ag)和肽聚糖(pgn)组成。由于细胞外壁中的ma通过ag连接到细胞内壁中的pgn，因此ag在维持细胞壁完整性方面起重要作用。此外，乙胺丁醇(emb)是结核病治疗中必不可少的一线药物，它通过抑制阿拉伯糖基转移酶破坏ag合成，然后抑制分枝杆菌生长。因此，ag的合成对mtb的生长至关重要，据此，参与ag合成的基因是mtb生长的必需基因。ag是分枝杆菌细胞壁的必需结构组分，但目前其在mtb和宿主相互作用中的功能尚不清楚。现在还没有商品化的ag抗体，并且作为碳水化合物的ag难以制备抗体，除此之外，抗体的制备复杂，耗时且需要动物免疫。

指数富集的配体系统进化技术(systematicevolutionofligandbyexponentialenrichment，selex)是ellington与szostak(1990)最先报道使用，是一种新型体外筛选技术。该技术的基本原理是利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸文库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子，再经扩增、反复筛选，使该类寡核苷酸分子得到富集，该富集的寡核苷酸分子称为适配子。与抗体蛋白相比，适配子具有分子识别能力强、稳定性高、制备简单、经济、快速等优点。该技术已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、细胞，药物、氨基酸以及各种细胞因子等，可用于相应靶分子的检测识别。目前该技术在在人类病原微生物检测方面得到了广泛的应用。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术中的问题，本发明提供了一种结核杆菌阿拉伯半乳聚糖适配子及其筛选方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种结核杆菌阿拉伯半乳聚糖(ag)特异性适配子，命名为aa835，所述的适配子的核苷酸序列为：

5'-gggagctcagaataaacgctcaacggattagtcaatggactggtggctttgtgtggtgttagacatgaggcccggatcatcacgttcgacatgaggcccggatc-3'(seqidno.1)。

另一方面，本发明提供上述适配子的筛选方法，其具体步骤包括：

步骤一，构建随机单链dna文库：以寡核苷酸模板进行pcr扩增获得随机单链dna文库；其中，所述寡核苷酸模板为5'-gggagctcagaataaacgctcaa-n35-ttcgacatgaggcccggatc-3'，其中n35代表a，g，c和t的等量加入；

步骤二，筛选ag的适配子：用包被缓冲液(在100μl0.1mol/lnahco3缓冲液，ph9.6)将ag包被于微孔板中，同时设空白对照孔；封闭elisa板上的孔；单链dna文库和shcmk结合缓冲液混匀后先于空白反筛孔进行孵育；然后将未结合的单链dna转移到ag包被孔进行孵育，shcmt冲洗缓冲液冲洗，甩干后加入洗脱缓冲液洗脱与ag结合的单链dna，产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化，将沉淀物溶于te缓冲液中；不对称pcr扩增后的产物进行下一轮筛选；进行7轮筛选，筛选后的饱和文库，经克隆测序，获得单个适配子序列和二级结构；

步骤三，确定适配子对ag是否有亲和力，以筛选所述结核杆菌ag特异性适配子。

进一步地，步骤二中使用的shcmk结合缓冲液成分为：20mmol/lhepes，120mmol/lnacl，5mmol/lkcl，1mmol/lmgcl2，1mmol/lcacl2。

进一步地，步骤二中使用的shcmt冲洗缓冲液成分为：20mmol/lhepes，120mmol/lnacl，5mmol/lkcl，1mmol/lmgcl2，1mmol/lcacl2，0.05％tween20。

进一步地，步骤二中使用的洗脱缓冲液成分为：20mmol/ltris-hcl，4mol/l异硫氰酸胍，1mmol/ldtt。

进一步地，洗脱缓冲液ph为8.3。

进一步地，步骤三中利用ag与适配子进行酶促反应，并通过加elisa终止缓冲液终止酶促反应，测定450nm处的光密度以确定适配子对ag是否有亲和力。

进一步地，步骤三中od值超过1.0的适配子被认为对ag具有高亲和力。

进一步地，步骤一先通过对称pcr获得双链dna，后通过不对称pcr构建的单链dna文库。

进一步地，pcr扩增的引物序列包括：

正向引物：5'-gggagctcagaataaacgctcaa-3'(seqidno.2)；

反向引物：5'-gatccgggcctcatgtcgaa-3'(seqidno.3)。

进一步地，不对称pcr扩增的参数包括：95℃，5分钟；40个循环，94℃30秒，65℃30秒，72℃30秒；72℃，5分钟。

进一步地，在不对称pcr过程中，正向引物和反向引物的摩尔比例为1：100。

又一方面，本发明提供了一种上述结核杆菌阿拉伯半乳聚糖(ag)特异性适配子在制备治疗结核病药物中的应用。

进一步地，所述结核病为结核分枝杆菌(h37rv)感染。

本发明筛选的结核杆菌ag适配子可用于探究ag的生物学功能，探究其在mtb和宿主相互作用中的功能，研究表明特异性适配子aa835阻断结核杆菌ag之后，可以加强scid小鼠的存活期，其可应用辅助治疗结核病。

附图说明

图1是本发明一实施例中的结核分枝杆菌标准株h37rv适配子的二级结构图；

图2是本发明一实施例中的aa835处理的结核分枝杆菌感染scid小鼠与对照组的存活对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

下述实施例提供了结核杆菌ag适配子aa835及其应用，并且提供了aa835的制备与筛选方法。

实施例一aa835的制备和筛选

本实施中所用的ag为商品化试剂购置，sigmaaldrich(https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/851361？lang＝zh&region＝cn)。

步骤一，构建随机单链寡核苷酸文库：设计合成78碱基的寡核苷酸模板，5'-gggagctcagaataaacgctcaa-n35-ttcgacatgaggcccggatc-3'，其中n35代表a，g，c和t的等量加入。通过对称pcr获得双链dna和通过不对称pcr的获得单链dna，其中上游引物为5’-gggagctcagaataaacgctcaa-3’，下游引物为5’-gatccgggcctcatgtcgaa-3’。

步骤二，筛选ag的适配子：将ag(在100μl0.1mol/lnahco3缓冲液，ph9.6)通过在4℃温育过夜包被到elisa板(96孔)。留下未包被的孔(空白)作为对照孔。使用洗涤缓冲液(含有0.05％tween20的pbs，ph7.4，pbst)洗涤板三次，然后在室温下与200μl封闭缓冲液(含有3％牛血清白蛋白(bsa)的pbs和0.05％tween20，ph7.2)一起温育1小时。将空白孔同时封闭。在shcmk结合缓冲液(20mmol/lhepes，ph7.35，120mmol/lnacl，5mmol/lkcl，1mmol/lmgcl2，1mmol/lcacl2)中于94℃加热5分钟后，将ssdna文库冷却至室温15分钟。为了筛选出与bsa结合的ssdna，首先将ssdna加入空白孔中并在37℃下孵育，然后取出未结合的ssdna并将其置于ag包被的孔中，在37℃下孵育。通过用洗涤缓冲液(shcmk和0.05％吐温20；shcmkt)六次冲洗丢弃未结合的ssdna序列。然后，加入洗脱缓冲液(20mmol/ltris-hcl，4mol/l异硫氰酸胍和1mmol/ldtt，ph8.3)并在80℃温育10分钟，洗脱与ag结合的ssdna并与苯酚混合氯仿。将混合物在4℃下以12,000g离心5分钟。使用脱水醇和naac(3mol/l，ph5.2)在-20℃下与上清液混合过夜，然后在4℃下以12,000g离心20分钟。弃去上清液后，向沉淀中加入75％乙醇并离心10分钟。将沉淀物溶于30mlte缓冲液(ph8.0)中，并作为dna文库模板应用于下一轮筛选。扩增热循环参数如下：95℃，5分钟；18个循环，94℃30秒，65℃30秒，72℃30秒；72℃，5分钟。不对称热循环参数如下：正向引物：反向引物为1：100；一个95℃，5分钟；40个循环，94℃30秒，65℃30秒，72℃30秒；一个72℃，5分钟。使用不对称pcr将ssdna分离至富集的文库用于下一轮选择。

在七轮筛选后，使用tiangelmidipurificationkit(tiangenbiotechco.，ltd，beijing，china)纯化第六轮和第七轮的pcr产物，并使用ta克隆试剂盒克隆到pmd18-t载体中(takara，大连，中国)，转化入大肠杆菌dh5α感受态。随机挑取单克隆用于测序(sangon，shanghai，china)。通过dnaman6.0版(lynnon，quebec，canada)确认单个适体序列和二级结构。

步骤三，确定适配子对ag是否有亲和力：将ag(4μg在100μl0.1mol/lnahco3缓冲液，ph9.6中)包被96孔elisa板，并在4℃温育过夜。将板用pbst洗涤三次，并与200μl封闭缓冲液在37℃下孵育1小时。在5次漂洗pbst后，加入1μg/孔的具有生物素标记的单个dna适体(在shcmk缓冲液中)，并在37℃下与ag反应40分钟。用shcmkt缓冲液冲洗三次后，加入100μl链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(hrp；在pbs中1：30)，37℃下孵育30分钟，pbst漂洗三次后，在孔中加入100μl的3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(tmb，surmodics)作为底物。20分钟后，通过加入50μlelisa终止缓冲液终止酶促反应，用分光光度计(multiskanmk3；thermoscientific，waltham，ma，usa)测定450nm处的光密度(od)。

在22个测试的适配子中，由od值显示aa835具有最高亲和性(二级结构如图1所示)，核苷酸序列如下：

5'-gggagctcagaataaacgctcaacggattagtcaatggactggtggctttgtgtggtgttagacatgaggcccggatcatcacgttcgacatgaggcccggatc-3'(seqidno.1)

其中，aa835的核苷酸序列长度大于模板的原因是序列的自联。

实施例二结核杆菌ag特异性适配子(aa835)对mtb(h37rv)感染后scid小鼠存活的影响

本实施例所采用的实验材料包括：小鼠笼具，鼠粮垫料，饮用水及饲料，其采用的小鼠为scid小鼠：实验分为a、b两组，每组2笼，每笼5只小鼠。共4笼，实验地点为：广州中山大学生物安全三级实验室(bsl-3)。

该实验要求包括：一周2次观察小鼠存活情况，并及时记录。每周换一次笼具、垫料及饲料；每周滴鼻ddh2o和aa835。时间允许的话，观察至感染后2-3个月。2-3个月后，未死的小鼠脱颈椎处死。

本实验的具体步骤包括：

步骤一，菌株制备：将结核分枝杆菌标准株h37rv(atcc27294)转种至含有10％oadc(含油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶)营养添加剂的米氏7h9液体培养基中，37℃培养至对数生长期，转至1.5ml离心管中，12000rpm离心5min，1×pbs洗涤两遍，80℃水浴，灭菌30min，-20℃保存。

步骤二，配制aa835溶液(1ug/10μl)。化合物aa835是干粉，使用时，先离心(10000rpm，3min)于管底，然后用灭菌水溶解，每支ep管中的aa835是1od＝33μg，每支用330μl灭菌水(1μg/10μl)溶解，之后95℃，5min，短暂离心并冰浴降至室温，方可与菌液混合，37℃(若无水浴，金属浴或培养箱亦可，时间10min)，10min后用于小鼠滴鼻。

步骤三，h37rv滴鼻感染scid小鼠：

a组(10只)，先吸取20mg/ml的菌350μl与ddh2o350μl混匀，37℃，10min后，每只小鼠滴鼻40μl，每侧滴鼻10μl，2轮滴鼻。

b组(10只)，先吸取20mg/ml的菌350μl与吸取aa835(1ug/10μl)350μl混匀，37℃，10min后，每只小鼠滴鼻40μl，每侧滴鼻10μl，2轮滴鼻。之后每周，a组：滴鼻水(20μl/只)；b组：滴鼻化合物aa835(2μg/只，也即是20μl/只)组。

上述实验结果如图2所示，用aa835处理过的结核分枝杆菌感染scid小鼠相对于对照组的存活时间更长。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>上海市肺科医院

<120>一种结核杆菌阿拉伯半乳聚糖适配子及其应用

<140>ipi192995

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>104

<212>dna

<213>适配子序列（artificialsequence）

<400>1

gggagctcagaataaacgctcaacggattagtcaatggactggtggctttgtgtggtgtt60

agacatgaggcccggatcatcacgttcgacatgaggcccggatc104

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>适配子上游引物的序列（artificialsequence）

<400>2

gggagctcagaataaacgctcaa23

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>适配子下游引物的序列（artificialsequence）

<400>3

gatccgggcctcatgtcgaa20