一种雏鹅性别的鉴定方法与流程

本发明涉及生物检测领域，具体涉及生物的分子检测，更具体地涉及一种雏鹅性别的鉴定方法。

背景技术：

由于不同性别的个体间生长速度和生长性能等存在差异，在现代养禽业中往往需要按性别分群饲养，因此需要在早期对家禽进行性别鉴定。目前传统的鹅性别鉴定主要通过外形鉴别和翻肛鉴别。在雏鹅阶段，公母鹅外形外貌差异较小，根据外形对鹅进行性别鉴定难度较大，鉴定的准确率较低。采用翻肛鉴定的方法准确率高，一般准确率可达98％-99％，但是该方法必须在雏鹅出壳后24小时内完成，超过24小时后雏鹅肛门收缩生殖突起萎缩不易观察。同时该方法对操作者技术要求高，否则对雏鹅的伤害较大且误判率增加。因此通过采取鹅羽毛、血液等，通过分子生物学手段进行性别鉴定具有重要意义。

禽类的性别决定系统为zw型，雄性染色体为zz型，雌性染色体为zw型。因此，禽类性别pcr鉴定方法基础就是要寻找w染色体上的特异基因或者序列。目前已经发现可用于性别鉴定的性连锁基因有染色体螺旋蛋白基因(chromoboxhelicasednabindinggene,chd1)、三磷酸腺苷5a1(atp5a1)和假基因序列(ee0.6序列)等。chd1基因在非平胸鸟类有2个同源拷贝(chd-w和chd-z)，分别与w染色体和z染色体连锁。这两个同源拷贝的外显子序列相似，但是内含子大小却有很大差别。因此，利用该差异设计特异性引物进行pcr扩增之后，再对pcr产物进行电泳检测，雌性(zw)会产生2条带，而雄性(zz)则只有1条带。该方法是通过双阳性结果来判断雌雄的，排除了假阴性的可能，结果更加可靠准确。

目前应用pcr技术对家禽和鸟类的性别进行鉴定已有较多报道，一般是先提取基因组dna，然后再进行pcr鉴定，例如cn103468825b、cn107354219a分别公开了pcr引物用于鹅、企鹅的性别鉴定，均经过了提取dna的过程，dna提取比较繁琐，因此整个鉴定过程耗时较长。而以全血样品直接进行pcr简便快速，但是全血pcr的试剂盒价格较高，cn106701910a公开了一种用于鉴定鸽子性别的引物对、试剂盒及方法，该方法直接使用鸽子血液进行pcr检测，该技术方案的pcr反应体系中，taq聚合酶选用的是omniklentaq，这种酶是从文库中筛选出来的具有极高耐受性的taq或者klentaq突变体，可以直接以全血、血清等材料为模板一步扩增目的基因，避免了繁琐的核酸dna提取过程，但是这种酶价格昂贵，使用该酶进行雏鹅性别鉴定成本太大。因此，对于家禽养殖者，尤其是家禽养殖大户，需要一种耗时短且成本低的家禽性别鉴定方法。

技术实现要素：

为了消除现有技术的缺陷，本发明对taq聚合酶、血样、镁离子浓度等梯度进行反应体系优化，不仅免去了基因组dna抽提的步骤，大大节约时间和人工成本，而且采用普通taq聚合酶进行血样pcr，大大降低了鉴定成本。

一种雏鹅性别的鉴定方法，包括以下步骤：

s1.采集待鉴定雏鹅的血样，用ddh2o稀释500～1000倍，得到鹅血样稀释液；

s2.以雏鹅血样稀释液作为模板，用seqno.1和seqno.2所示序列的引物对进行pcr扩增反应，20μl的pcr扩增反应体系中包括0.5～4.0mm的mg²⁺2.0μl；

s3.琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，扩增产物条带出现455bp和300bp两个条带为母鹅，扩增产物条带仅有455bp一个条带为公鹅。

本发明之所以可以免去基因组dna抽提、而且使用普通的taq聚合酶就可以进行血样pcr，关键之处在于引物的设计、血样的稀释倍数、pcr反应体系中mg²⁺的浓度和用量的优化。本发明seqno.1和seqno.2所示序列的引物对是根据鹅chd1基因在z、w染色体上不同拷贝内含子差异设计，具体的位置见附图1。本发明以不同的mg²⁺浓度(0.5mm、1.0mm、2.0mm和4.0mm)和不同血样稀释倍数(50、100、200、500和1000倍)组合进行pcr反应，发现，mg²⁺浓度0.5～4.0mm、血样稀释500～1000倍，再结合特定序列的引物，才能做到免去基因组dna抽提、而且使用普通的taq聚合酶就可以进行血样的准确分子鉴定。

本发明发现鹅血样稀释的倍数会显著影响检测的准确性和灵敏性，优选地，s1中用ddh2o稀释500倍，得到鹅血样稀释液。

本发明发现pcr扩增反应体系中mg²⁺的浓度会协同鹅血样稀释的倍数一起影响检测的准确性和灵敏性，优选地，20μl的pcr扩增反应体系中包括2.0mm的mg²⁺2.0μl。

优选地，所述血样稀释前用edta进行抗凝处理。

优选地，所述20μl的pcr扩增反应体系为：10×pcrbuffer2.0μl，2.0mmmg²⁺2.0μl，200μmdntpmixture1.0μl，1.0utaqdna聚合酶0.2μl，4pmol的seqno.1所示引物0.4μl，4pmol的seqno.2所示引物0.4μl，鹅血样稀释液10μl，ddh2o4μl；

优选地，所述pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸5min；12℃保存。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明可以在2h内快速完成雏鹅性别的分子鉴定，准确率100％。本发明只需普通pcr仪及琼脂糖凝胶电泳设备，直接采用血样作为pcr模板，避免传统抽提dna的过程，大大提高效率。

附图说明

图1为本发明中扩增目的序列和引物在鹅chd1基因上的位置指示图；鹅chd1基因位于基因组的1990082-2046480，全长56399bp；黑色箭头为引物的位置，f为上游引物，r为下游引物，pcr产物位于2022023-2022477。

图2本发明以不同的mg²⁺浓度(0.5mm、1.0mm、2.0mm和4.0mm)和不同血样稀释倍数(50、100、200、500和1000倍)组合进行pcr产物的凝胶电泳图；m为markerdl2,000；a-e分别为血样稀释50、100、200、500和1000倍；1-4分别为mg²⁺浓度0.5mm、1.0mm、2.0mm和4.0mm。

图3为本发明中雏鹅血样pcr性别鉴定的凝胶电泳图；m为markerdl2,000，1-6为检测样品，nc1为没加模板的阴性对照，nc2为没加引物的阴性对照。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

一种鉴定雏鹅性别的方法，包括如下步骤：

1.雏鹅血样的采集和稀释：待鉴定雏鹅进行翅下静脉微量采血(约0.1ml)，直接取2μl血样，用ddh2o稀释50～1000倍，直接用作pcr反应的模板。

如果待鉴定雏鹅数量较大，可先保存血样，然后再进行鉴定，这时血样采集后需要进行抗凝处理，具体实施方式如下：进行翅下静脉微量采血(约0.1ml)，注入装有15μl2％无菌edta抗凝剂(ethylenediaminetetraaceticacid)的1.5ml离心管中，轻轻摇匀，记录编号，-20℃保存备用。取2μl血样，用ddh2o稀释50～1000倍，直接用作pcr反应的模板。

2.以雏鹅血样稀释液作为模板，用pcr引物对进行pcr扩增反应

根据鹅chd1基因的基因组dna序列，设计包含不同拷贝内含子片段的引物(见图1)。

pcr引物对的上游引物核苷酸序列seqno.1为：5’-aatgagtgcactgcagaaa-3’；下游引物核苷酸序列seqno.2为：5’-taatgaggtagcaatggtt-3’。

本发明以不同的mg²⁺浓度(0.5mm、1.0mm、2.0mm或4.0mm)和不同血样稀释倍数(50、100、200、500或1000倍)组合进行pcr反应，20μlpcr反应体系的组成如表1所示。

表1鹅chd1基因血样pcr反应体系

pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸5min；12℃保存。

3.琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物。通过比较发现血样稀释倍数为500，mg²⁺浓度为2.0mm的条件下，才能检测出结果条带(图2)。

实施例2

一种鉴定雏鹅性别的方法，包括如下步骤：

1.雏鹅血样的采集和稀释：待鉴定雏鹅进行翅下静脉微量采血(约0.1ml)，直接取2μl血样，用ddh2o稀释500倍，直接用作pcr反应的模板。

如果待鉴定雏鹅数量较大，可先保存血样，然后再进行鉴定，这时血样采集后需要进行抗凝处理，具体实施方式如下：进行翅下静脉微量采血(约0.1ml)，注入装有15μl2％无菌edta抗凝剂(ethylenediaminetetraaceticacid)的1.5ml离心管中，轻轻摇匀，记录编号，-20℃保存备用。取2μl血样，用ddh2o稀释500倍，直接用作pcr反应的模板。

3.以雏鹅血样稀释液作为模板，用pcr引物对进行pcr扩增反应，pcr引物同实施例1。

20μlpcr反应体系的组成如表2所示。

表2鹅chd1基因血样pcr反应体系

pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸5min；12℃保存。

3.琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，根据扩增产物条带判断性别

取5μl的pcr产物(可直接点样)，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并以dnamarker2000作为参照。根据电泳结果进行性别判定(图3)，当产物出现455bp和300bp两个条带时为母鹅，当产物条带产物出现455bp一个条带时为公鹅。共鉴定6只，雌雄个体各半，根据本发明专利方法鉴定结果与解剖鉴定或专业人员翻肛鉴别结果一致，鉴定准确率为100％。