一种人类多能干细胞分化巨噬细胞的方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种人类多能干细胞分化巨噬细胞的方法。
背景技术：
：人类多能干细胞包括人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞，能分化为人体内各种类型的细胞，可以用来制作疾病模型、进行药物毒性检验，并可通过细胞移植，取代损伤病变的细胞，促进机体创伤修复和治疗疾病。巨噬细胞是人体重要的天然免疫细胞，在抵御病原微生物感染、清除坏死细胞和组织残骸、动脉粥样硬化的发生发展研究等方面有重要应用价值。目前很难获得大量的人类巨噬细胞，而且很难进行扩增和基因操作，大大限制了相关研究和临床应用。目前从人多能干细胞分化为巨噬细胞采用的主要方法为拟胚体(embryoidbody)分化法。该方法采用培养在小鼠滋养层上的人多能细胞产生拟胚体，将大小适中的拟胚体在含有巨噬细胞刺激因子和白介素3的培养液中分化大约3-4周。该方法主要的问题是分化周期长、效率低、且含有动物源成分，这些缺点妨碍了其潜在的临床应用。技术实现要素：本方法的目的是独创一种分化方法，通过一种化学成分确定，而且成本较低的细胞培养添加剂，促使人多能干细胞快速高效的分化成高纯度的巨噬细胞。第一方面，本发明要求保护一种用于将多能干细胞分化为巨噬细胞的试剂盒。本发明所要求保护的用于将多能干细胞分化为巨噬细胞的试剂盒，包括培养液ⅱ、培养液ⅲ、培养液ⅳ、培养液ⅴ、培养液vi和培养液vii；所述培养液ⅱ为如下(a1)-(a6)中的任一种：(a1)含有无胰岛素的b27添加剂和人骨形成蛋白4的培养液；(a2)含有无胰岛素的b27添加剂和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的b27添加剂在培养液ⅱ中的体积百分含量为1-2％；所述人骨形成蛋白4在培养液ⅱ中的浓度为5-10ng/ml；(a3)含有无胰岛素的b27添加剂和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的b27添加剂在培养液ⅱ中的体积百分含量为2％；所述人骨形成蛋白4在培养液ⅱ中的浓度为5ng/ml；(a4)含有无胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c和人骨形成蛋白4的培养液；(a5)含有无胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的b27添加剂在培养液ⅱ中的体积百分含量为1-2％；所述l-谷氨酰胺或其替代物在培养液ⅱ中的浓度为1-2mm；所述甘氨酸在培养液ⅱ中的浓度为7.5μg/ml；所述l-丙氨酸在培养液ⅱ中的浓度为8.9μg/ml；所述l-门冬氨酸在培养液ⅱ中的浓度为13.2μg/ml；所述l-天冬氨酸在培养液ⅱ中的浓度为13.30μg/ml；所述l-谷氨酸在培养液ⅱ中的浓度为14.70μg/ml；所述l-脯氨酸在培养液ⅱ中的浓度为11.50μg/ml；所述l-丝氨酸在培养液ⅱ中的浓度为10.5μg/ml；所述青霉素在培养液ⅱ中的浓度为50-100u/ml；所述链霉素在培养液ⅱ中的浓度为50-100μg/ml；所述维生素c在培养液ⅱ中的浓度为25-50ng/ml；所述人骨形成蛋白4在培养液ⅱ中的浓度为5-10ng/ml；(a6)含有无胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的b27添加剂在培养液ⅱ中的体积百分含量为2％；所述l-谷氨酰胺或其替代物在培养液ii中浓度为2mm；所述甘氨酸在培养液ⅱ中的浓度为7.5μg/ml；所述l-丙氨酸在培养液ⅱ中的浓度为8.9μg/ml；所述l-门冬氨酸在培养液ⅱ中的浓度为13.2μg/ml；所述l-天冬氨酸在培养液ⅱ中的浓度为13.30μg/ml；所述l-谷氨酸在培养液ⅱ中的浓度为14.70μg/ml；所述l-脯氨酸在培养液ⅱ中的浓度为11.50μg/ml；所述l-丝氨酸在培养液ⅱ中的浓度为10.5μg/ml；所述青霉素在培养液ⅱ中的浓度为100u/ml；所述链霉素在培养液ⅱ中的浓度为100μg/ml；所述维生素c在培养液ⅱ中的浓度为50ng/ml；所述人骨形成蛋白4在培养液ⅱ中的浓度为5ng/ml。所述培养液ⅲ为如下(b1)-(b3)中的任一种：(b1)含有gsk3抑制剂的培养液ⅱ；(b2)含有1-2μmgsk3抑制剂的培养液ⅱ；(b3)含有2μmgsk3抑制剂的培养液ⅱ。所述培养液ⅳ为如下(c1)-(c6)中的任一种：(c1)含有添加了胰岛素的b27添加剂、人血管内皮生成因子vegf-165和人成纤维生长因子bfgf的培养液；(c2)含有添加了胰岛素的b27添加剂、人血管内皮生成因子vegf-165和人成纤维生长因子bfgf的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液ⅳ中的体积百分含量为1-2％；所述人血管内皮生成因子vegf-165在培养液ⅳ中的浓度为25-50ng/ml；所述人成纤维生长因子bfgf在培养液ⅳ中的浓度为5-10ng/ml；(c3)含有添加了胰岛素的b27添加剂、人血管内皮生成因子vegf-165和人成纤维生长因子bfgf的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液ⅳ中的体积百分含量为2％；所述人血管内皮生成因子vegf-165在培养液ⅳ中的浓度为50ng/ml；所述人成纤维生长因子bfgf在培养液ⅳ中的浓度为10ng/ml；(c4)含有添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c、人血管内皮生成因子vegf-165和人成纤维生长因子bfgf的培养液；(c5)含有添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c、人血管内皮生成因子vegf-165和人成纤维生长因子bfgf的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液iv中的体积百分含量为1-2％；所述l-谷氨酰胺或其替代物在培养液iv中浓度为1-2mm；所述甘氨酸在培养液iv中的浓度为7.5μg/ml；所述l-丙氨酸在培养液iv中的浓度为8.9μg/ml；所述l-门冬氨酸在培养液iv中的浓度为13.2μg/ml；所述l-天冬氨酸在培养液iv中的浓度为13.30μg/ml；所述l-谷氨酸在培养液iv中的浓度为14.70μg/ml；所述l-脯氨酸在培养液iv中的浓度为11.50μg/ml；所述l-丝氨酸在培养液iv中的浓度为10.5μg/ml；所述青霉素在培养液iv中的浓度为50-100u/ml；所述链霉素在培养液iv中的浓度为50-100μg/ml；所述维生素c在培养液ⅳ中的浓度为25-50ng/ml；所述人血管内皮生成因子vegf-165在培养液ⅳ中的浓度为25-50ng/ml；所述人成纤维生长因子bfgf在培养液ⅳ中的浓度为5-10ng/ml；(c6)含有添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c、人血管内皮生成因子vegf-165和人成纤维生长因子bfgf的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液iv中的体积百分含量为2％；所述l-谷氨酰胺或其替代物在培养液iv中浓度为2mm；所述甘氨酸在培养液iv中的浓度为7.5μg/ml；所述l-丙氨酸在培养液iv中的浓度为8.9μg/ml；所述l-门冬氨酸在培养液iv中的浓度为13.2μg/ml；所述l-天冬氨酸在培养液iv中的浓度为13.30μg/ml；所述l-谷氨酸在培养液iv中的浓度为14.70μg/ml；所述l-脯氨酸在培养液iv中的浓度为11.50μg/ml；所述l-丝氨酸在培养液iv中的浓度为10.5μg/ml；所述青霉素在培养液iv中的浓度为100u/ml；所述链霉素在培养液iv中的浓度为100μg/ml；所述维生素c在培养液iv中的浓度为50ng/ml；所述人血管内皮生成因子vegf-165在培养液iv中的浓度为50ng/ml；所述人成纤维生长因子bfgf在培养液iv中的浓度为10ng/ml。所述培养液v为如下(d1)-(d3)中的任一种：(d1)含有tgfβ抑制剂的培养液ⅳ；(d2)含有5-10μmtgfβ抑制剂的培养液ⅳ；(d3)含有10μmtgfβ抑制剂的培养液ⅳ。所述培养液vi为如下(e1)-(e6)中的任一种：(e1)含有添加了胰岛素的b27添加剂、人白细胞介素-3和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；(e2)含有添加了胰岛素的b27添加剂、人白细胞介素-3和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液vi中的体积百分含量为1-2％；所述人白细胞介素-3在培养液vi中的浓度为10-20ng/ml；所述人巨噬细胞集落刺激因子在培养液vi中的浓度为50-100ng/ml；(e3)含有添加了胰岛素的b27添加剂、人白细胞介素-3和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液vi中的体积百分含量为2％；所述人白细胞介素-3在培养液vi中的浓度为10ng/ml；所述人巨噬细胞集落刺激因子在培养液vi中的浓度为50ng/ml；(e4)含有添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c、人白细胞介素-3和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；(e5)含有添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c、人白细胞介素-3和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液vi中的体积百分含量为1-2％；所述l-谷氨酰胺或其替代物在培养液vi中浓度为1-2mm；所述甘氨酸在培养液vi中的浓度为7.5μg/ml；所述l-丙氨酸在培养液vi中的浓度为8.9μg/ml；所述l-门冬氨酸在培养液vi中的浓度为13.2μg/ml；所述l-天冬氨酸在培养液vi中的浓度为13.30μg/ml；所述l-谷氨酸在培养液vi中的浓度为14.70μg/ml；所述l-脯氨酸在培养液vi中的浓度为11.50μg/ml；所述l-丝氨酸在培养液vi中的浓度为10.5μg/ml；所述青霉素在培养液vi中的浓度为50-100u/ml；所述链霉素在培养液vi中的浓度为50-100μg/ml；所述维生素c在培养液vi中的浓度为25-50ng/ml；所述人白细胞介素-3在培养液vi中的浓度为10-20ng/ml；所述人巨噬细胞集落刺激因子在培养液vi中的浓度为50-100ng/ml；(e6)含有添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c、人白细胞介素-3和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液vi中的体积百分含量为2％；所述l-谷氨酰胺或其替代物在培养液vi中浓度为2mm；所述甘氨酸在培养液vi中的浓度为7.5μg/ml；所述l-丙氨酸在培养液vi中的浓度为8.9μg/ml；所述l-门冬氨酸在培养液vi中的浓度为13.2μg/ml；所述l-天冬氨酸在培养液vi中的浓度为13.30μg/ml；所述l-谷氨酸在培养液vi中的浓度为14.70μg/ml；所述l-脯氨酸在培养液vi中的浓度为11.50μg/ml；所述l-丝氨酸在培养液vi中的浓度为10.5μg/ml。所述青霉素在培养液vi中的浓度为100u/ml；所述链霉素在培养液vi中的浓度为100μg/ml；所述维生素c在培养液vi中的浓度为50ng/ml；所述人白细胞介素-3在培养液vi中的浓度为10ng/ml；所述人巨噬细胞集落刺激因子在培养液vi中的浓度为50ng/ml。所述培养液vii为如下(f1)-(f6)中的任一种：(f1)含有添加了胰岛素的b27添加剂和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；(f2)含有添加了胰岛素的b27添加剂和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液vii中的体积百分含量为1-2％；所述人巨噬细胞集落刺激因子在培养液vii中的浓度为50-100ng/ml；(f3)含有添加了胰岛素的b27添加剂和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液vii中的体积百分含量为2％；所述人巨噬细胞集落刺激因子在培养液vii中的浓度为50ng/ml；(f4)含有添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；(f5)含有添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液vii中的体积百分含量为1-2％；所述l-谷氨酰胺或其替代物在培养液vii中浓度为1-2mm；所述甘氨酸在培养液vii中的浓度为7.5μg/ml；所述l-丙氨酸在培养液vii中的浓度为8.9μg/ml；所述l-门冬氨酸在培养液vⅱ中的浓度为13.2μg/ml；所述l-天冬氨酸在培养液vii中的浓度为13.30μg/ml；所述l-谷氨酸在培养液vii中的浓度为14.70μg/ml；所述l-脯氨酸在培养液vii中的浓度为11.50μg/ml；所述l-丝氨酸在培养液vii中的浓度为10.5μg/ml；所述青霉素在培养液vii中的浓度为50-100u/ml；所述链霉素在培养液vii中的浓度为50-100μg/ml；所述维生素c在培养液vii中的浓度为25-50ng/ml；所述人巨噬细胞集落刺激因子在培养液vii中的浓度为50-100ng/ml；(f6)含有添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c和人巨噬细胞集落刺激因子的培养液；所述添加了胰岛素的b27添加剂在培养液vii中的体积百分含量为2％；所述l-谷氨酰胺或其替代物在培养液vii中浓度为2mm；所述甘氨酸在培养液vii中的浓度为7.5μg/ml；所述l-丙氨酸在培养液vii中的浓度为8.9μg/ml；所述l-门冬氨酸在培养液vii中的浓度为13.2μg/ml；所述l-天冬氨酸在培养液vii中的浓度为13.30μg/ml；所述l-谷氨酸在培养液vⅱ中的浓度为14.70μg/ml；所述l-脯氨酸在培养液vii中的浓度为11.50μg/ml；所述l-丝氨酸在培养液vii中的浓度为10.5μg/ml；所述青霉素在培养液vii中的浓度为100u/ml；所述链霉素在培养液vii中的浓度为100μg/ml；所述维生素c在培养液vii中的浓度为50ng/ml；所述人巨噬细胞集落刺激因子在培养液vii中的浓度为50ng/ml。所述培养液ⅱ的组成如下：无胰岛素的b27添加剂、人骨形成蛋白4和细胞基础培养液。所述培养液ⅱ的组成如下：无胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c、人骨形成蛋白4和细胞基础培养液。所述培养液ⅲ的组成如下：gsk3抑制剂和培养液ⅱ。所述培养液ⅳ的组成如下：添加了胰岛素的b27添加剂、人血管内皮生成因子vegf-165、人成纤维生长因子和细胞基础培养液。所述培养液ⅳ的组成如下：添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c、人血管内皮生成因子vegf-165、人成纤维生长因子和细胞基础培养液。所述培养液ⅴ的组成如下：tgfβ抑制剂和培养液ⅳ。所述培养液vi的组成如下：添加了胰岛素的b27添加剂、人白细胞介素-3、人巨噬细胞集落刺激因子和细胞基础培养液。所述培养液vi的组成如下：添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c、人白细胞介素-3、人巨噬细胞集落刺激因子和细胞基础培养液。所述培养液vii的组成如下：添加了胰岛素的b27添加剂、人巨噬细胞集落刺激因子和细胞基础培养液。所述培养液vii的组成如下：添加了胰岛素的b27添加剂、l-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、l-丙氨酸、l-门冬氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素c、人巨噬细胞集落刺激因子和细胞基础培养液。以上任一所述细胞基础培养液具体可为rpmi1640基础培养液。进一步地，所述l-谷氨酰胺或其替代物为glutamax，具体为“glutamaxtmsupplement”(如gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品)。所述“glutamaxtmsupplement”的成分为l-alanyl-l-glutamine，是l-glutamine的替代物，浓度为200mm，溶剂为0.85％nacl溶液。以上任一所述人骨形成蛋白4(bmp4)的蛋白质序列见seqidno.1。以上任一所述血管生成因子(vegf-165)的蛋白质序列见seqidno.2。以上任一所述人成纤维生长因子(bfgf)的蛋白质序列见seqidno.3。以上任一所述人白细胞介素-3(il3)的蛋白质序列见seqidno.4。以上任一所述人巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)的蛋白质序列见seqidno.5。第二方面，本发明要求保护一种用于将造血干细胞分化为巨噬细胞的试剂盒。本发明所要求保护的用于将造血干细胞分化为巨噬细胞的试剂盒，包括前文所述培养液vi和所述培养液vii。在第一方面中，所述gsk3抑制剂可为如下(g1)-(g4)中的任一种：(g1)chir-99021；(g2)b216763；(g3)bio；(g4)tws119。在第一方面和第二方面中，所述tgfβ抑制剂可为sb431542。在第一方面中，所述试剂盒还可包括培养液ⅰ；所述培养液ⅰ可为如下(h1)-(h6)中的任一种：(h1)含有rock抑制剂的干细胞培养液；(h2)含有5-10μmrock抑制剂的干细胞培养液；(h3)含有10μmrock抑制剂的干细胞培养液；(h4)含有y27632的干细胞培养液；(h5)含有5-10μmy27632的干细胞培养液；(h6)含有10μmy27632的干细胞培养液。所述培养液ⅰ的组成如下：rock抑制剂和干细胞培养液。所述培养液ⅰ的组成如下：y27632抑制剂和干细胞培养液。其中，所述干细胞培养液可为tesr-e8培养液。第三方面，本发明要求保护一种将多能干细胞分化为巨噬细胞的方法。本发明所要求保护的将多能干细胞分化为巨噬细胞的方法，可包括如下步骤：(2)将多能干细胞接种于前文所述的培养液ⅱ中，培养0.5-1.5天(如1天)；(3)将步骤(2)的培养液更换为前文所述的培养液ⅲ，培养1.5-2.5天(如2天)；(4)将步骤(3)的细胞转移至前文所述的培养液ⅳ中，培养1.5-2.5天(如2天)；(5)将步骤(4)的培养液更换为前文所述的培养液ⅴ，培养2天-4天(如3天)；(6)将步骤(5)得到的细胞转移至前文所述的培养液ⅵ中，培养4-6天(如5天)；(7)将步骤(6)得到的细胞转移至前文所述的培养液vii中，培养2-4天(如3天)。进一步地，在步骤(2)前还可包括步骤(1)：将多能干细胞接种于前文所述的培养液ⅰ中培养。更进一步地，所述步骤(1)可为：(a)将多能干细胞接种于前文所述的培养液ⅰ中培养0.5-1.5天(如1天)；(b)将步(a)的培养液更换为前文中所述的干细胞培养液培养0.5-1.5天(如1天)。第四方面，本发明要求保护一种将造血干细胞分化为巨噬细胞的方法。本发明所要求保护的将造血干细胞分化为巨噬细胞的方法，可包括如下步骤：(6)将造血干细胞接种至前文所述的培养液ⅵ中，培养4-6天(如5天)；(7)将步骤(6)得到的细胞转移至前文所述的培养液vii中，培养2-4天(如3天)。在第三和第四方面中，任一所述培养的条件均为37℃、5％co2。进行任一所述培养时均可采用marigel包被的培养皿，具体为37℃包被2h。第五方面，本发明要求保护前文所述试剂盒在制备巨噬细胞中的应用。进一步地，所述应用是以多能干细胞(对应第一方面所述试剂盒)或造血干细胞(对应第二方面所述试剂盒)为出发细胞制备巨噬细胞。在本发明中，所述多能干细胞具体为人多能干细胞；所述造血干细胞具体为人造血干细胞。以上任一所述人多能干细胞为人胚胎干细胞系或人诱导多能干细胞。所述人胚胎干细胞系为商业化人胚胎干细胞系，如人胚胎干细胞系h1。所述人胚胎干细胞系h1具体可来自美国wicell细胞库，编号：wa01。所述人诱导多能干细胞为cd34-ipsc。所述诱导多能干细胞cd34-ipsc为利用仙台病毒重编程试剂盒(invitrogen，货号：a16517)诱导人脐带血造血干细胞(cd34阳性细胞)重编程获得。本发明研制了一种能够大幅增强人类多能干细胞向巨噬细胞分化效率的培养液添加剂，此种添加剂不含动物源成分、化学成分确定，有利于作为临床级别的干细胞分化培养体系。本发明还提供了一种人类多能干细胞向巨噬细胞分化的新方法，与现有方法相比，能显著提高分化效率并降低分化成本。采用本发明提供的制备方法可以获得巨噬细胞，采用单层细胞培养法首先分化获得造血干细胞，阶段性的加入调控wnt和tgfβ信号通路的小分子及阶段性撤除胰岛素的分化方法，与传统的基质细胞共培养法及拟胚体培养法相比，该方法可以高效获得表达cd34、cd43阳性的造血干细胞，并通过进一步加入il3和m-csf刺激获得cd14和cd163阳性巨噬细胞。该方法化学成分确定、无动物源成分，大大提高了制备细胞的安全性，且具有耗时短、分化效率高、成本较低等特点。采用本发明提供的制备方法可大规模生产人巨噬细胞，质量稳定，安全性高，为组织工程、药物研发和细胞治疗提供大量细胞来源。总之，本发明采用基于单层细胞分化的阶段性诱导方法，在16天左右即可从人多能干细胞分化获得大量巨噬细胞，极大缩短了分化周期，提高了分化效率，且化学成分确定，有助于未来应用于临床细胞替代治疗。附图说明图1为人多能干细胞的形态图。图2为h1向巨噬细胞分化过程中形态变化图。图3为cd34-ipsc向巨噬细胞分化过程中形态变化图。图4为造血祖细胞表面标志物检测的细胞流式仪检测结果。图5为巨噬细胞表面标志物检测的细胞流式仪检测结果。图6为巨噬细胞表面标志物检测的免疫荧光结果。图7为巨噬细胞的吉姆萨染色结果。图8为巨噬细胞吞噬功能检测结果。图9为巨噬细胞lps刺激结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。人胚胎干细胞系h1(简称h1细胞)：美国wicell细胞库，编号：wa01。诱导多能干细胞cd34-ipsc(简称cd34-ipsc细胞)：利用仙台病毒重编程试剂盒(invitrogen，货号：a16517)诱导人脐带血造血干细胞(cd34阳性细胞)重编程获得，具体方法根据试剂盒说明书操作。dmem培养液：gibco公司，货号：11965092。rpmi1640基础培养液：thermofisher公司，货号：11875093。tesr-e8培养液：stemcell公司，货号：05990。e8-y培养液为含有5-10μmrock抑制剂y27632的tesr-e8培养液；本发明的实施例中，rock抑制剂y27632在e8-y培养液中的浓度为10μm。m1培养液为含有1-2％(v/v)无胰岛素的b27添加剂(b27minusinsulin)、0.5-1％(v/v)glutamax(l-alanyl-l-glutamine终浓度为1-2mm)、0.5-1％(v/v)非必须氨基酸(neaa)、50-100u/ml青霉素、50-100μg/ml链霉素、25-50ng/ml维生素c和5-10ng/ml人骨形成蛋白4(bmp4)的rpmi1640培养液。本发明的实施例中，m1培养液中各组分浓度为：2％(v/v)无胰岛素的b27添加剂(b27minusinsulin)，1％(v/v)glutamax(l-alanyl-l-glutamine终浓度为2mm)，1％(v/v)非必需氨基酸(neaa)，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，50ng/ml维生素c，5ng/ml人骨形成蛋白4(bmp4)。m2培养液为含有1-2％(v/v)b27添加剂(b27supplement)、0.5-1％(v/v)glutamax(l-alanyl-l-glutamine终浓度为1-2mm)、0.5-1％(v/v)非必须氨基酸(neaa)、50-100u/ml青霉素、50-100μg/ml链霉素、25-50ng/ml维生素c、25-50ng/ml人血管内皮生成因子(vegf-165)和5-10ng/ml人成纤维生长因子(bfgf)的rpmi1640培养液。本发明的实施例中，m2培养液中各组分浓度为：2％(v/v)b27添加剂(b27supplement)，1％(v/v)glutamax(l-alanyl-l-glutamine终浓度为2mm)，1％(v/v)非必需氨基酸(neaa)，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，50ng/ml维生素c，50ng/ml人血管内皮生成因子(vegf-165)，10ng/ml人成纤维生长因子(bfgf)。m3培养液为含有1-2％(v/v)b27添加剂(b27supplement)0.5-1％(v/v)glutamax(l-alanyl-l-glutamine终浓度为1-2mm)、0.5-1％(v/v)非必需氨基酸(neaa)、50-100u/ml青霉素、50-100ug/ml链霉素、25-50ng/ml维生素c、10-20ng/ml人白细胞介素-3(il3)和50-100ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)的rpmi1640培养液。本发明的实施例中，m3培养液中各组分浓度为：2％(v/v)b27添加剂(b27supplement)，1％(v/v)glutamax(l-alanyl-l-glutamine终浓度为2mm)，1％(v/v)非必需氨基酸(neaa)，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素，50ng/ml维生素c，10ng/ml人白细胞介素-3(il3)和50ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)非必需氨基酸(neaa，100×)：gibco公司，货号：11140050；本发明的实施例中，在m1培养液或m2培养液中各氨基酸浓度为：甘氨酸7.5μg/ml，l-丙氨酸8.9μg/ml，l-门冬氨酸13.20μg/ml，l-天冬氨酸13.30μg/ml，l-谷氨酸14.70μg/ml，l-脯氨酸11.50μg/ml，l-丝氨酸10.50μg/ml。含胰岛素的b27添加剂(b27supplement)：gibco公司，货号：17504-044。无胰岛素的b27添加剂(b27minusinsulin)：gibco公司，货号：a1895601。glutamax：gibco公司，货号：35050061。维生素c：sigmaaldrich公司，货号：a4403。rock抑制剂y27632：targetmol公司，货号：t1870。y27632的结构式如下：人骨形成蛋白4(bmp4)：r&dbiosystems公司，货号：314-bp；蛋白质序列见seqidno.1。血管生成因子(vegf-165)：sinobiological公司，货号为：11066-hnah；蛋白质序列见seqidno.2。人成纤维生长因子(bfgf)：sinobiological公司，货号为：10014-hnae；蛋白质序列见seqidno.3。人白细胞介素-3(il3)：peprotech公司，货号为：200-03-10；蛋白质序列见seqidno.4。人巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)：peprotech公司，货号为：300-25-10；蛋白质序列见seqidno.5。gsk3抑制剂chir-99021：tocrisbiosciences公司，货号为：4423/10。chir-99021的结构式如下：tgfβ抑制剂sb431542：selleck公司，货号为：s1067。sb431542的结构式如下：细胞消化液accutase：merkmillipore公司，货号为：sf006。0.25％trypsin：gibco公司，货号为：25200056。matrigel：bdbiosciences公司，货号为：356231。pe标记的cd43抗体：ebioscience公司，货号为：12-0439-42。apc标记的cd34抗体：miltenyi公司，货号为：555824。fitc标记的cd45抗体：miltenyi公司，货号为：130-113-679。fitc标记的cd14抗体：biolegend公司，货号为：301804。apc标记的cd11b抗体：biolegend公司，货号为：301309。pe标记的cd163抗体：biolegend公司，货号为：326505。fitc标记的小鼠抗人igg抗体：ebioscience公司，货号为：11-4714-42。pe标记的小鼠抗人igg抗体：ebioscience公司，货号为：12-4714-42。apc标记的小鼠抗人igg抗体：ebioscience公司，货号为：17-4714-42。抗人cd163抗体：biolegend公司，货号为：333602抗人cd14抗体：biolegend公司，货号为：367101dylight488标记的二抗：thermo公司，货号为：r37120。细胞核染料dapi：sigma-aldrich公司，货号为：d9542脂多糖lps：sigma-aldrich公司，货号为：l2880-10mg。吉姆萨染液：sigma-aldrich公司，货号为：g4507-5g。rna抽提液：invitrogen公司：货号为：155960265×all-in-onertmastermix反转录试剂盒：公司，货号为：g490qpcrmastermix荧光定量pcr试剂盒：promega公司，货号：a6001实施例1、人多能干细胞向巨噬细胞分化本实施例中采用的人多能干细胞为两种，分别是h1细胞和cd34-ipsc细胞。1、将人多能干细胞接种于6孔板中(每孔2.5×105个细胞)，采用tesr-e8培养液，37℃培养至细胞汇合度为70％-80％。2、完成步骤1后，取所述六孔板，吸去培养上清，加入预热至37℃的pbs缓冲液洗涤2次。此时，h1细胞和cd34-ipsc细胞的形态图见图1(比例尺100微米)。3、完成步骤2后，取所述六孔板，每孔加入1ml细胞消化液accutase，37℃静置3-5min，然后加入适量rpmi1640基础培养液终止消化，离心收集细胞。4、将步骤3收集的细胞接种于培养皿(培养皿已采用marigel37℃包被2小时)中，接种密度为2.0×104个/cm2－4.0×104个/cm2，采用e8-y培养液，于37℃、5％co2培养箱中培养1天。5、完成步骤4后，取所述培养皿，弃培养上清，更换为新鲜的tesr-e8培养液，于37℃、5％co2培养箱中培养1天。6、完成步骤5后，取所述培养皿，弃培养上清，更换为m1培养液，于37℃、5％co2培养箱中培养1天。7、完成步骤6后，取所述培养皿，弃培养上清，更换为含有2μmgsk3抑制剂chir-99021的m1培养液，于37℃、5％co2培养箱中培养2天。8、完成步骤6后，取所述培养皿，弃培养上清，先加入适量0.25％trypsin消化至单细胞状态，然后加入含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养液终止消化，离心收集细胞。9、将步骤8收集的细胞接种于培养皿(培养皿已采用marigel37℃包被2h)中，接种密度为2.5×104个/cm2－5.0×104个/cm2，采用m2培养液，于37℃、5％co2培养箱中培养2天(每天更换新鲜的m2培养液)。10、完成步骤9后，取所述培养皿，加入tgfβ抑制剂sb431542，tgfβ抑制剂sb431542在培养体系中的浓度为10μm，于37℃、5％co2培养箱中培养3天，可以逐渐看到有集落状细胞开始出现，呈现悬浮状态，为细胞a。11、完成步骤10后，取所述培养皿，收集悬浮细胞，转移至m3培养基中，于37℃、5％co2培养箱中培养5天，隔天更换半数培养液。12、5天后，取所述培养皿，收集细胞，转移至撤除人白介素3的m3培养基中，于37℃、5％co2培养箱中继续培养3天，获得细胞b。上述培养过程中，观察人多能干细胞的形态变化(第0天为步骤6中加入培养液m1的时刻)。人多能干细胞向巨噬细胞的形态变化见图2(h1细胞，比例尺50微米)和图3(cd34-ipsc细胞，比例尺50微米)。结果表明，人多能干细胞的形态逐渐转变为巨噬细胞的形态，其细胞胞体内含有许多大小不一的空泡结构，长梭形形态，呈贴壁状态。实施例2、多能干细胞向巨噬分化过程中细胞的检测一、细胞a及细胞b的流式细胞检测1、取实施例1中步骤9得到的细胞a、步骤12得到的细胞b，采用含5％(v/v)胎牛血清的pbs缓冲液重悬细胞得到细胞a悬浮液(含1×105个细胞)、细胞b悬浮液(含1×105个细胞)。2、向步骤1的a细胞悬浮液中分别加入pe标记的cd43抗体(体积比1：50)和apc标记的cd34抗体(体积比1：50)，向步骤1的b细胞悬浮液中分别加入pe标记的cd43抗体(体积比1：50)、apc标记的cd34抗体(体积比1：50)、fitc标记的cd45抗体(体积比1：50)、fitc标记的cd14抗体(体积比1：50)、apc标记的cd11b抗体(体积比1：50)、pe标记的cd163抗体(体积比1：50)，室温避光孵育20分钟。然后用含5％(v/v)胎牛血清的pbs缓冲液洗涤2次，离心收集细胞。空白对照用对应的荧光通道的igg抗体。3、完成步骤2后，采用500μl含5％(v/v)胎牛血清的pbs缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测。采用h1细胞分化得到的细胞a及细胞b检测结果如图4和图5所示。结果表明，采用培养液m2分化得到的细胞a，在第8天有96％左右的细胞表达cd43，其中有约74％左右的cd34和cd43双阳性造血祖细胞，证明在8天内可以分化得到许多造血前体细胞。将所述细胞a继续在m3培养基中培养5天，在撤除人白介素3的m3培养基中继续培养3天后得到细胞b，通过图5流式检测结果显示，细胞b表达典型的巨噬细胞表面标志物cd14、cd163和cd11b，同时高表达血液细胞标志物cd45和cd43，不表达造血干细胞标志物cd34，证明分化得到的细胞b具有典型巨噬细胞表面标志物的特征。二、细胞b的免疫荧光检测1、取实施例1中步骤12得到的细胞b，用4％多聚甲醛室温固定10分钟，然后吸去4％(v/v)多聚甲醛，用pbs缓冲液洗涤3次。2、完成步骤1后，先加入含0.25％(v/v)tritonx-100的pbs缓冲液，室温静置20分钟；再加入含5％(v/v)bsa的pbs缓冲液室温封闭1h。3、完成步骤2后，分别加入(体积比1：100)抗人cd163抗体、抗人cd14抗体，室温孵育2小时，然后用pbst(含0.1％(v/v)吐温-20的pbs缓冲液)缓冲液洗涤3次。4、完成步骤3后，分别加入dylight488(体积比1：500)标记的二抗，室温孵育1h，然后用pbst缓冲液洗涤3次。5、完成步骤4后，加入1mg/ml(体积比1：1000)dapi，室温孵育20分钟，然后用pbst缓冲液洗涤3次。在荧光显微镜下观察细胞染色情况。荧光显微镜下采用h1细胞得到的细胞b的染色情况见图6(比例尺100微米)。结果表明，细胞b表达cd14和cd163巨噬细胞表面标志物，表明其为巨噬细胞。以上结果表明，培养液m3可以高效的将人多能干细胞诱导分化为巨噬细胞。三、细胞b的吉姆萨染色实验。1、将实施例1中步骤12得到的细胞b调整浓度至1×107个/ml，取10μl滴到载玻片上，用另一块载玻片45°放于液滴上刚好接触，然后将上方载玻片平滑地推向另一边，使之产生一层均匀的细胞液膜；2、将下方载玻片置于甲醛中固定5-7分钟；3、取出载玻片，空气干燥；4、以1:20比例用双蒸水稀释吉姆萨染液(染色效果跟稀释比和缓冲液有关)；5、根据情况，将载玻片染色15-60分钟；6、取出载玻片，用水轻轻润洗至染液褪去；7、空气干燥，显微镜下观察并拍照记录。结果如图7所示(比例尺50微米)，可见细胞体积较大，直径约20微米，单核，核呈圆形，胞质内含有许多大小不一空泡结构，为典型的巨噬细胞形态结构。四、巨噬细胞吞噬实验1、将实施例1中步骤12得到的细胞b按照1×105个/cm2的密度接种于细胞培养板内，过夜培养使其贴壁；2、第二天，按照比例白念珠菌：细胞＝5:1的浓度，将带荧光标记的白念珠菌(清华大学林欣实验室提供，参考文献：jnk1negativelycontrolsantifungalinnateimmunitybysuppressingcd23expression.naturemedicine2017,23(3):337-346.doi:10.1038/nm.4260.)接种于细胞之上，孵育2-4小时；用间充质干细胞做细胞阴性对照；3、2-4小时后，吸去培养液，用pbs轻轻润洗3遍，然后将细胞用枪头轻轻刮下，吹打为单细胞悬液，流式细胞检测吞噬比例。图8结果显示，细胞b可以将荧光标记的白念珠菌吞进其胞体内，流式检测孵育两小时后有76％左右的细胞b吞噬了gfp标记的白念珠菌，而阴性对照的间充质细胞不具有吞噬真菌的能力，证明分化所得的细胞b具有吞噬病原微生物的能力，符合巨噬细胞的功能特征。五、lps刺激巨噬细胞实验1、将实施例1中步骤10得到的细胞b按照2×105个/cm2的密度接种于细胞培养板内，过夜培养使其贴壁。2、第二天，加入10ng/ml的脂多糖(lps)刺激细胞12小时，阴性对照不加lps。3、完成步骤2后，吸走上清，用pbs润洗2遍后吸走pbs。4、完成步骤3后，加入1ml抽提细胞内总rna。5、完成步骤4后，利用5×all-in-onertmastermix反转录试剂盒进行，根据说明说操作，反转录合成第一链cdna。6、完成步骤5后，以上述cdna为模板，利用promega试剂盒进行q-pcr反应，体系如表1所示：表1荧光定量pcr反应体系(10μl)反应在荧光定量pcr仪cfx96(bio-rad)上进行，反应程序为：94℃5min；94℃30s；60℃30s，72℃30s，重复40个循环；72℃10min。本实验中检测所用到的qrt-pcr引物序列如表2所示，gapdh为内参基因。表2荧光定量pcr引物基因正向引物(5’-3’)反向引物(5’-3’)gapdhtgatgacatcaagaaggtggtgaagtccttggaggccatgtgggccattnfacctctctctaatcagccctctggaggacctgggagtagatgagil6acccccaataaatataggactggattctctttcgttcccggtggil1batgatggcttattacagtggcaagtcggagattcgtagctggail10ttccagtgtctcggagggatgctggccacagctttcaagaccl2cagccagatgcaatcaatgcccagccagatgcaatcaatgcc如图9所示，将实施例1中细胞b在加入lps刺激后，与阴性对照组相比，可以显著上调tnfα、il1b、il6、il10及ccl2等炎症相关细胞因子及趋化因子的表达，具有与体内巨噬细胞响应lps刺激相似的反应，证明细胞b可以在lps刺激后上调炎症相关因子响应炎症反应。以上结果表明，采用培养液m1、m2和m3可以高效的将人多能干细胞诱导分化为巨噬细胞。<110>清华大学<120>一种人类多能干细胞分化巨噬细胞的方法<130>cggnqaln196073<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>117<212>prt<213>artificialsequence<400>1metserprolyshishisserglnargalaarglyslysasnlysasn151015cysargarghisserleutyrvalasppheseraspvalglytrpasn202530asptrpilevalalaproproglytyrglnalaphetyrcyshisgly354045aspcyspropheproleualaasphisleuasnserthrasnhisala505560ilevalglnthrleuvalasnservalasnserserileprolysala65707580cyscysvalprothrgluleuseralailesermetleutyrleuasp859095glutyrasplysvalvalleulysasntyrglnglumetvalvalglu100105110glycysglycysarg115<210>2<211>191<212>prt<213>artificialsequence<400>2metasnpheleuleusertrpvalhistrpserleualaleuleuleu151015tyrleuhishisalalystrpserglnalaalaprometalaglugly202530glyglyglnasnhishisgluvalvallysphemetaspvaltyrgln354045argsertyrcyshisproilegluthrleuvalaspilepheglnglu505560tyrproaspgluileglutyrilephelysprosercysvalproleu65707580metargcysglyglycyscysasnaspgluglyleuglucysvalpro859095thrglugluserasnilethrmetglnilemetargilelysprohis100105110glnglyglnhisileglyglumetserpheleuglnhisasnlyscys115120125glucysargprolyslysaspargalaargglnglulyslysserval130135140argglylysglylysglyglnlysarglysarglyslysserargtyr145150155160lyssertrpservaltyrvalglyalaargcyscysleumetprotrp165170175serleuproglyprohisprocysglyprocyssergluargarg180185190<210>3<211>147<212>prt<213>artificialsequence<400>3metproalaleuprogluaspglyglyserglyalapheproprogly151015hisphelysaspprolysargleutyrcyslysasnglyglyphephe202530leuargilehisproaspglyargvalaspglyvalargglulysser354045aspprohisilelysleuglnleuglnalaglugluargglyvalval505560serilelysglyvalcysalaasnargtyrleualametlysgluasp65707580glyargleuleualaserlyscysvalthraspglucysphephephe859095gluargleugluserasnasntyrasnthrtyrargserarglystyr100105110thrsertrptyrvalalaleulysargthrglyglntyrlysleugly115120125serlysthrglyproglyglnlysalaileleupheleuprometser130135140alalysser145<210>4<211>133<212>prt<213>artificialsequence<400>4alaprometthrglnthrthrserleulysthrsertrpvalasncys151015serasnmetileaspgluileilethrhisleulysglnproproleu202530proleuleuasppheasnasnleuasnglygluaspglnaspileleu354045metgluasnasnleuargargproasnleuglualapheasnargala505560vallysserleuglnasnalaseralailegluserileleulysasn65707580leuleuprocysleuproleualathralaalaprothrarghispro859095ilehisilelysaspglyasptrpasnglupheargarglysleuthr100105110phetyrleulysthrleugluasnalaglnalaglnglnthrthrleu115120125serleualailephe130<210>5<211>159<212>prt<213>artificialsequence<400>5metglugluvalserglutyrcysserhismetileglyserglyhis151015leuglnserleuglnargleuileaspserglnmetgluthrsercys202530glnilethrphegluphevalaspglngluglnleulysaspproval354045cystyrleulyslysalapheleuleuvalglnaspilemetgluasp505560thrmetargpheargaspasnthrproasnalailealailevalgln65707580leuglngluleuserleuargleulyssercysphethrlysasptyr859095glugluhisasplysalacysvalargthrphetyrgluthrproleu100105110glnleuleuglulysvallysasnvalpheasngluthrlysasnleu115120125leuasplysasptrpasnilepheserlysasncysasnasnserphe130135140alaglucysserserglnglyhisgluargglnsergluglyser145150155当前第1页12