一种3D组织工程细胞环的制备方法与流程

本发明涉及细胞工程领域，具体是一种3d组织工程细胞环的制备方法。

背景技术：

传统的医学研究及细胞生物学研究多采用二维细胞培养模式，其所提供的培养平面是扁平的。然而在生理状况下，组织细胞是在三维空间中生长，细胞与细胞之间不仅相互接触，而且还要与细胞外基质等支撑结构相接触。二维细胞培养模式无法真正体现组织中的细胞外基质，因此在该模式中很多生理反应，如受体表达、转录表达、细胞移行及凋亡等，均被证实与实际器官或组织所发生的情况不同。而且，细胞从分裂、增殖、迁徙到凋亡，整个过程被精确调控，有赖于其内部固有的立体空间及时间上的组织原则。二维细胞培养模式离准确再现组织内细胞的功能还有很大差距。

在体内，细胞生长在一个3d的环境中，即被其他细胞、膜系统、纤维层、细胞外基质等重重包围。研究表明，在3d培养系统中生长的细胞会表现出更接近生理的表型、相互作用及反应，可以更精确的重现细胞行为。既往很多研究显示，利用三维培养得出的结论与动物实验更加类似，三维细胞培养能更准确地模拟正常的细胞形态，增殖，分化和迁移，因此三维细胞培养技术尤为重要。此外，体外3d细胞培养体系下进行的检测可作为体内动物模型验证之前的一种替代方式，大大节约体内实验的成本和周期。

目前三维培养技术主要分为需要支架的三维培养技术和不需要支架的三维细胞培养技术。细胞支架主要是在三维空间内构建供细胞附着和生长的多孔结构，细胞依附于支架进行三维生长和迁移，主要的支架材料有胶原和水凝胶等；不需要支架的三维培养技术主要是通过物理方法使贴壁细胞悬浮于培养基中以达到三维培养的目的，目前主要的技术有微载体、磁悬浮、悬滴板和磁性三维生物印刷等技术，这类方法操作较为复杂，前期投入较大，目前绝大多数三维培养均借助于支架材料。目前的悬滴培养法仅能培养粒径数百微米的微球，其几何尺寸距真实的3d组织结构还有较大差距。此外，凝胶或支架的空间占位影响细胞形成规则致密的三维结构，其降解产物也对细胞的生长分化产生影响，成本较高也是其不利因素，仍然不是理想的三维培养策略。以上方法大多还存在操作过程复杂，支架影响细胞生长分化，培养细胞体积偏小，后续操作不便等问题，离理想的3d细胞培养模型还存在较大的差距，而且目前的产品大多来自国外的公司，产品价格昂贵，限制了其在国内的广泛应用，阻碍了国内医药研究的发展。目前，国内还没有与之竞争的3d细胞培养方案和产品。

技术实现要素：

本发明就是为了解决上述技术问题，所提供了一种3d组织工程细胞环的制备方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种3d组织工程细胞环的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a.制备成环培养液：将质量分数为0.25%的甲基纤维素低温溶解于dmem高糖培基中，加入体积分数为10%的胎牛血清和1%的青链双抗；

b.将低温消毒灭菌（75%酒精浸泡或者环氧乙烷）的细胞环培养模具放入细胞培养板；

c.向培养孔中加入抗粘附涂层（stemcell,anti-adherencerinsingsolution），室温下孵育；

d.吸出抗粘附涂层，以室温的dmem培基润洗培养孔凹槽；

e.吸出dmem培基，模具准备完毕备用；

f.胰酶消化在传统二维平面培养下的细胞，收集培养瓶中的细胞，进行细胞计数；

g.低转速离心，去上清液，根据细胞数加入对应体积的成环培养液将细胞重悬，制备成单细胞悬液；

h.将重悬的细胞悬液加入到细胞环培养模具中；

i.细胞环培养模具外围加入成环培养液，将培养板放入培养箱，静置4-6小时后，补足细胞环培养模具外围培养液至溢过模具；

j.24小时后细胞聚集成环，继续培养48-72小时，形成紧密的细胞环，用镊子取出，用于其它检测和实验。

进一步的，一种3d组织工程细胞环的制备方法，包括以下步骤：

a.制备成环培养液：将质量分数为0.25%的甲基纤维素低温溶解于dmem高糖培基中，加入体积分数为10%的胎牛血清和1%的青链双抗；

b.将低温消毒灭菌的细胞环培养模具放入细胞培养板；

c.向培养孔中加入40-45微升抗粘附涂层，室温下孵育20-30分钟；

d.吸出抗粘附涂层，以室温的dmem培基润洗培养孔凹槽20-30分钟；

e.吸出dmem培基，模具准备完毕备用；

f.胰酶消化在传统二维平面培养下的细胞，收集培养瓶中的细胞，进行细胞计数；

g.800-1000转每分钟离心4-5分钟，去上清液，根据细胞数加入对应体积的成环培养液将细胞重悬，制备成单细胞悬液；

h.将重悬的细胞悬液加入到细胞环培养模具中，每个孔40-45微升；

i.细胞环培养模具外围加入500-600微升成环培养液，将培养板放入培养箱，静置4-6小时后，补足细胞环培养模具外围培养液至溢过模具，600-700微升每孔；

j.24小时后细胞聚集成环，继续培养48-72小时，形成紧密的细胞环，用镊子取出，用于其它检测和实验。

进一步的，一种3d组织工程细胞环的制备方法，包括以下步骤：

a.制备成环培养液：将质量分数为0.25%的甲基纤维素低温溶解于dmem高糖培基中，加入体积分数为10%的胎牛血清和1%的青链双抗；

b.将低温消毒灭菌的细胞环培养模具放入24孔培养板；

c.向培养孔中加入40微升抗粘附涂层，室温下孵育30分钟；

d.吸出抗粘附涂层，以室温的dmem培基润洗培养孔凹槽30分钟；

e.吸出dmem培基，模具准备完毕备用；

f.胰酶消化在传统二维平面培养下的细胞，收集培养瓶中的细胞，进行细胞计数；

g.以1000转每分钟离心4分钟，去上清液，根据细胞数加入对应体积的成环培养液将细胞重悬，按60万/40ul重悬，制备成单细胞悬液；

h.将重悬的细胞悬液加入到细胞环培养模具中，每个孔40微升；

i.细胞环培养模具外围加入500微升成环培养液，将培养板放入37°c，5%co2恒温培养箱，静置6小时后，补足细胞环培养模具外围培养液至溢过模具，600微升每孔；

j.24小时后细胞聚集成环，继续培养48-72小时，形成紧密的细胞环，用镊子取出，用于其它检测和实验。

进一步的，所述细胞为多种人源或其它种属来源的原代细胞或细胞株，包括但不限于如下细胞类型：成骨细胞，脂肪干细胞，骨髓间充质干细胞，平滑肌细胞，骨巨细胞瘤基质细胞，骨肉瘤细胞，肺癌细胞，鼻咽癌细胞，卵巢癌细胞，结肠癌细胞，胰岛b细胞，心肌细胞，血管平滑肌细胞，人皮肤成纤维细胞。

一种人骨肉瘤143b细胞环的制备方法，包括以下步骤：

a.配制成环培养液：0.25%甲基纤维素加入高糖dmem基础培基后，加入10%fbs，10ng/mlbfgf,10ng/mlpdgf，20ng/mltgfβ，10umy-27632；

b.将低温消毒灭菌的细胞环培养模具放入24孔培养板；

c.向培养孔中加入40微升抗粘附涂层，室温下孵育30分钟；

d.吸出抗粘附涂层，以室温的dmem培基润洗培养孔凹槽30分钟；

e.吸出dmem培基，模具准备完毕备用；

f.待143b骨肉瘤细胞和人表皮成纤维细胞生长至95%饱和度，以0.5%胰酶消化细胞成单细胞悬液，收集细胞均匀打散后进行细胞计数；

g.将以上两种细胞按细胞数1:1比例混合，1000转/分离心细胞悬液4分钟，弃去上清液；

h.取成环培养液将两者混合细胞按60万/40ul重悬；

i.将细胞重悬液按40ul每孔加入细胞环培养模具；

j.细胞环培养模具周围加入500ul成环培养液；

k.放入37°c，5%co2恒温培养液静置6小时；

l.细胞环培养模具周围加入600ul成环培养液，继续培养至细胞环形成。

一种人肺癌a549细胞环的制备方法，包括以下步骤：

a.配制成环培养液：0.25%甲基纤维素加入高糖dmem基础培基后，加入10%fbs，10ng/mlbfgf,10ng/mlpdgf，20ng/mltgfβ，10umy-27632；

b.将低温消毒灭菌的细胞环培养模具放入24孔培养板；

c.向培养孔中加入40微升抗粘附涂层，室温下孵育30分钟；

d.吸出抗粘附涂层，以室温的dmem培基润洗培养孔凹槽30分钟；

e.吸出dmem培基，模具准备完毕备用；

f.待人肺癌a549细胞和人表皮成纤维细胞生长至95%饱和度，以0.5%胰酶消化细胞成单细胞悬液，收集细胞均匀打散后进行细胞计数；

g.将以上两种细胞按细胞数1:1比例混合，1000转/分离心细胞悬液4分钟，弃去上清液；

h.取成环培养液将两者混合细胞按60万/40ul重悬；

i.将细胞重悬液按40ul每孔加入细胞环培养模具；

j.细胞环培养模具周围加入500ul成环培养液；

k.放入37°c，5%co2恒温培养液静置6小时；

l.细胞环培养模具周围加入600ul成环培养液，继续培养至细胞环形成。

一种人鼻咽癌s18细胞环的制备方法，包括以下步骤：

a.配制成环培养液：0.25%甲基纤维素加入高糖dmem基础培基后，加入10%fbs，10ng/mlbfgf,10ng/mlpdgf，20ng/mltgfβ，10umy-27632；

b.将低温消毒灭菌的细胞环培养模具放入24孔培养板；

c.向培养孔中加入40微升抗粘附涂层，室温下孵育30分钟；

d.吸出抗粘附涂层，以室温的dmem培基润洗培养孔凹槽30分钟；

e.吸出dmem培基，模具准备完毕备用；

f.待人鼻咽癌s18细胞和人表皮成纤维细胞生长至95%饱和度，以0.5%胰酶消化细胞成单细胞悬液，收集细胞均匀打散后进行细胞计数；

g.将以上两种细胞按细胞数1:1比例混合，1000转/分离心细胞悬液4分钟，弃去上清液；

h.取成环培养液将两者混合细胞按60万/40ul重悬；

i.将细胞重悬液按40ul每孔加入细胞环培养模具；

j.细胞环培养模具周围加入500ul成环培养液；

k.放入37°c，5%co2恒温培养液静置6小时；

l.细胞环培养模具周围加入600ul成环培养液，继续培养至细胞环形成。

一种人骨巨细胞瘤基质细胞环的制备方法，包括以下步骤：

a.配制成环培养液：0.25%甲基纤维素加入高糖dmem基础培基后，加入10%fbs，10ng/mlbfgf,10ng/mlpdgf，20ng/mltgfβ，10umy-27632；

b.将低温消毒灭菌的细胞环培养模具放入24孔培养板；

c.向培养孔中加入40微升抗粘附涂层，室温下孵育30分钟；

d.吸出抗粘附涂层，以室温的dmem培基润洗培养孔凹槽30分钟；

e.吸出dmem培基，模具准备完毕备用；

f.待骨巨细胞瘤细胞生长至95%饱和度，以0.5%胰酶消化细胞成单细胞悬液，收集细胞均匀打散后进行细胞计数；

g.1000转/分离心细胞悬液4分钟，弃去上清液；

h.取成环培养液将该细胞沉淀按60万/40ul重悬；

i.将细胞重悬液按40ul每孔加入细胞环培养模具；

j.细胞环培养模具周围加入500ul细胞环培养液；

k.放入37°c，5%co2恒温培养液静置6小时；

l.细胞环培养模具周围加入600ul细胞环培养液，继续培养至细胞环形成。

一种大鼠脂肪干细胞环的制备方法，包括以下步骤：

a.配制成环培养液：0.25%甲基纤维素加入高糖dmem基础培基后，加入10%fbs，10ng/mlbfgf,10ng/mlpdgf，20ng/mltgfβ，10umy-27632；

b.将低温消毒灭菌的细胞环培养模具，放入24孔培养板；

c.向培养孔中加入40微升抗粘附涂层，室温下孵育30分钟；

d.吸出抗粘附涂层，以室温的dmem培基润洗培养孔凹槽30分钟；

e.吸出dmem培基，模具准备完毕备用；

f.待大鼠脂肪干细胞生长至95%饱和度，以0.5%胰酶消化细胞成单细胞悬液，收集细胞均匀打散后进行细胞计数；

g.1000转/分离心细胞悬液4分钟，弃去上清液；

h.取成环培养液将该细胞沉淀按60万/40ul重悬；

i.将细胞重悬液按40ul每孔加入细胞环培养模具；

j.细胞环培养模具周围加入500ul细胞环培养液；

k.放入37°c，5%co2恒温培养液静置6小时；

l.细胞环培养模具周围加入600ul细胞环培养液，继续培养至细胞环形成。

本发明的细胞环培养模具的结构已经申请中国发明专利，专利号为201910126589.2。

本发明获得了如下的有益效果。

本发明方法通过3d组织工程细胞环培养模具，对该模具进行特殊的表面涂层处理，将悬浮液细胞加入该模具，经过一定时间后，培养的细胞可以自组装成为不需要外源支架的3d结构细胞环，是真正意义上的完全细胞来源没有任何外界添加材料及支架的3d细胞组织块，而且没有磁场对细胞生长的干扰，也比悬滴培养的微球体积更大、有更鲜明的3d立体结构，而且能像人体组织块一样可以使用镊子工具夹取转移，容易操作。本发明方法能不经过胰酶的消化，直接将培养好的3d细胞环从培养模具里面取出来，进行后续的检测和组织移植，可用于肿瘤建模和组织修复，最大程度的保存了细胞的活性，有利于提高移植细胞的活性和移植成功率。本发明方法制成的细胞环肉眼可见，内径达2mm，细胞外基质丰富，便于观察和后续实验操作。并且该细胞环是具有规则的环形结构的细胞体，能模拟体内细胞微环境，将2d细胞培养体系与组织器官的研究联系起来，有利于类器官的研究。本发明的三维培养细胞环在肿瘤治疗、药物筛选和检测、动物建模、组织修复等方面均可发挥重要的作用，对研究细胞生长、分化以及细胞间相互作用机制等方面有非常重要的意义。

附图说明

图1是本发明方法制备的骨肉瘤143b细胞环图；

图2是本发明方法制备的a549肺癌细胞环图；

图3是本发明方法制备的鼻咽癌s18细胞环图；

图4是本发明方法制备的骨肉瘤143b细胞环h&e染色图；

图5是本发明方法制备的人骨巨细胞瘤基质细胞环图；

图6是本发明方法制备的大鼠脂肪干细胞环图；

图7是本发明方法制备的细胞环用镊子取出后组装成三维立体管状结构图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1：人骨肉瘤143b细胞环（人肺癌a549细胞环、人鼻咽癌s18细胞环制备方法同骨肉瘤）

一种人骨肉瘤143b细胞环的制备方法，包括以下步骤：

a.配制成环培养液：0.25%甲基纤维素加入高糖dmem基础培基后，加入10%fbs，10ng/mlbfgf,10ng/mlpdgf，20ng/mltgfβ，10umy-27632；

b.将低温消毒灭菌的细胞环培养模具，放入24孔培养板；

c.向培养孔中加入40微升抗粘附涂层，室温下孵育30分钟；

d.吸出抗粘附涂层，以室温的dmem培基润洗培养孔凹槽30分钟；

e.吸出dmem培基，模具准备完毕备用；

f.待143b骨肉瘤和人表皮成纤维细胞生长至95%饱和度，以0.5%胰酶消化细胞成单细胞悬液，收集细胞均匀打散后进行细胞计数；

g.将以上两种细胞按细胞数1:1比例混合，1000转/分离心细胞悬液4分钟，弃去上清液；

h.取骨肉瘤细胞成环培养液将两者混合细胞按60万/40ul重悬；

i.将细胞重悬液按40ul每孔加入细胞环培养模具；

j.细胞环培养模具周围加入500ul骨肉瘤细胞成环培养液；

k.放入37°c，5%co2恒温培养液静置6小时；

l.细胞环培养模具周围加入600ul成环培养液，继续培养至细胞环形成。

实验结果见图1-4，其中，图1为骨肉瘤细胞环；图2为a549肺癌细胞环；图3为鼻咽癌s18细胞环；图4为骨肉瘤细胞环h&e染色。

实施例2：人骨巨细胞瘤基质细胞环（大鼠脂肪干细胞环制备方法同骨巨细胞瘤）

一种人骨巨细胞瘤基质细胞环的制备方法，包括以下步骤：

a.配制成环培养液：0.25%甲基纤维素加入高糖dmem基础培基后，加入10%fbs，10ng/mlbfgf,10ng/mlpdgf，20ng/mltgfβ，10umy-27632；

b.将低温消毒灭菌的细胞环培养模具，放入24孔培养板；

c.向培养孔中加入40微升抗粘附涂层，室温下孵育30分钟；

d.吸出抗粘附涂层，以室温的dmem培基润洗培养孔凹槽30分钟；

e.吸出dmem培基，模具准备完毕备用；

f.待143b骨巨细胞瘤细胞生长至95%饱和度，以0.5%胰酶消化细胞成单细胞悬液，收集细胞均匀打散后进行细胞计数；

g.1000转/分离心细胞悬液4分钟，弃去上清液；

h.取成环培养液将该细胞沉淀按60万/40ul重悬；

i.将细胞重悬液按40ul每孔加入细胞环培养模具；

j.细胞环培养模具周围加入500ul细胞环培养液；

k.放入37°c，5%co2恒温培养液静置6小时；

l.细胞环培养模具周围加入600ul细胞环培养液，继续培养至细胞环形成。

实验结果见图5-6，其中，图5为人骨巨细胞瘤基质细胞环；图6为大鼠脂肪干细胞环。

实施例1-2中制备的所有细胞环具有一定的强度和韧性，用镊子取出后可以组合成管，可制备更加立体的三维管状结构（参见图7）。

本发明通过一种特殊的培养模具和细胞培养液，针对不同细胞类型建立了不同制备具有三维立体结构的细胞环的方法。该环的外形、尺寸以及类似的成比例放大或缩小的细胞环均在本专利保护范围。