芬娜金针菇新菌株及其分子标记的引物和分子标记方法与流程

本发明涉及一种新菌株及其分子标记引物和分子标记方法，尤其涉及一种芬娜金针菇新菌株及其分子标记的引物和分子标记方法。
背景技术：
：目前，食用菌的产业发展迅猛，我国食用菌每年的产量达到3000万吨以上，占全球75％以上，从业人员超过2000万人，食用菌产业在种植业中排在除了粮、菜果、油之后的第五位，超过了棉、茶叶和蚕桑。在食用菌产业蓬勃发展的今天，越来越多的珍稀食用菌品种逐渐进入人们的视野，许多原有的珍稀品种逐渐被驯化，如竹荪、茶薪菇、离褶伞等。但是也有大批的野生食药用菌由于未能被人类认识，没有得到研究。在目前有的15万种大型真菌中，仅仅有80种左右的野生食药用菌被人类驯化，而且规模化栽培的品种更只有20多种。随着人们生活水平的逐步上升，对于生活品质的要求更高，而大型真菌由于其富含具有营养及功能作用的各种成分，包括真菌多糖、三萜类、甾醇等，对于人体健康具有非常良好的作用，日益受到人们的重视。金针菇(flammulinavelutipes)是目前人工广泛栽培的食用菌之一，也是一种经济价值很高的食药用真菌。金针菇含有多种营养成分，其中人体生长所需的8种氨基酸含量较高，尤以赖氨酸和精氨酸含量特别丰富，能促进儿童的健康成长和智力发育，因此常被称为“增智菇”。金针菇含有朴菇素，具有显著的抗癌功能，经常食用金针菇还可以预防高血压，治疗肝炎及肠胃溃疡等疾病。技术实现要素：针对以上不足，本发明提供一种芬娜金针菇新菌株及其分子标记的引物和分子标记方法。本发明提供一种芬娜金针菇新菌株，分离自辽宁省本溪市桓仁县老秃顶子山阔叶树枯木上，通过对子实体进行组织分离并纯化得到原始菌株，经形态学及分子生物学鉴定为芬娜金针菇flammulinafennae新菌株，将该菌株命名为芬娜金针菇flammulinafennaehmgim-a151357，已于2019年6月20日保藏至中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，中国武汉)，保藏编号为：cctccno：m2019478。发明人分离得到的该菌株菌丝活力旺盛，当前已经通过人工驯化栽培获得子实体，商品性状优良。并且对该菌株完成其全基因组的测序及组装，通过与食用菌基因组比对，属于芬娜金针菇(flammulinafennaebas)菌种，具体涉及来自真菌界(fungi)担子菌门(basidiomycota)伞菌纲(agaricomycetes)伞菌目(agaricales)膨瑚菌科(physalacriaceae)金针菇属(flammulina)。本发明的芬娜金针菇子实体为黄色，菌盖浅黄色，呈半球形，较大，不易开伞，表面有胶质的薄皮；菌柄细长，浅黄色至褐色，菌柄基部比菌柄顶部颜色要深；菌肉白色，较薄；菌褶近奶油色或浅黄色，凹生或延生。生长周期为60天-70天，出菇管理时间为10天-13天。菌丝体最适温度22-24℃，原基形成15-16℃，子实体生长最适温度为16-18℃。菌丝体在普通pda培养基上生长速度适中，菌丝稍浓密，初期为白色至灰白色，后期呈现出淡黄色，并产生粉孢子。与普通金针菇相比，本发明的芬娜金针菇具有更为丰富的钙含量，出菇耐受温度更高，有利于节能，并且菌盖不易开伞，商品性状优，纤维素含量低，食用时不易塞牙，口感更优。附图说明图1为实施例1的本发明的新菌株的its测序结果。图2为实施例2的差异性位点。图3为实施例2的引物对的pcr扩增电泳图谱。图4为实施例2的另一引物对的pcr扩增电泳图谱。具体实施方式本发明提供了一株通过野外采集分离得到的芬娜金针菇新菌株，通过分子生物学鉴定以及性状鉴别为新菌株，测定其全基因组数据并与市场上广泛使用的金针菇菌种基因进行比较分析，设计特异性引物完成其分子标记，实现自有菌株的保护，为商业化应用提供产权保障。一种芬娜金针菇新菌株，分离自辽宁省本溪市桓仁县老秃顶子山阔叶树枯木上，通过对子实体进行组织分离并纯化得到原始菌株，经形态学及分子生物学鉴定为芬娜金针菇flammulinafennae新菌株，将该菌株命名为芬娜金针菇flammulinafennaehmgim-a151357，已于2019年6月20日保藏至中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，中国武汉)，保藏编号为：cctccno：m2019478。对该菌株完成其全基因组的测序及组装，通过与市场上常见金针菇基因进行比对分析，筛选获得差异基因集，设计特异性引物及pcr扩增，将扩增产物电泳检测并测序。结果表明，本发明的两对核酸探针引物针对该芬娜金针菇菌株可以扩增出特异性条带，而对于普通金针菇则无条带，并且成功扩增出来的条带经送检测序后，与芬娜金针菇基因组比对，相似性达到98％以上，表明这两对核酸探针引物可以特异性扩增芬娜金针菇菌株，用以区别市场上流通的金针菇菌株。芬娜金针菇新菌株(芬娜金针菇flammulinafennaehmgim-a151357)的分子标记的引物，包括faa-f-1和faa-r-1，或faa-f-2和faa-r-3；其中，faa-f-1：5′-gccctccctttaccagtcttgcttccgat-3′faa-r-1：5′-ctccatcgggttgatgtccgcaaa-3′faa-f-2：5′-gccctccctttaccagtc-3′faa-r-3：5′-attccgcatcctcaacct-3′。芬娜金针菇新菌株(芬娜金针菇flammulinafennaehmgim-a151357)的分子标记方法，采用引物对faa-f-1和faa-r-1，或faa-f-2和faa-r-3进行pcr扩增，得到特异性扩增条带，鉴定为芬娜金针菇新菌株(芬娜金针菇flammulinafennaehmgim-a151357)。所述分子标记方法进一步包括采用引物对faa-f-1和faa-r-1，或faa-f-2和faa-r-3进行普通金针菇的pcr扩增，显示无扩增条带，表明芬娜金针菇新菌株(芬娜金针菇flammulinafennaehmgim-a151357)的鉴定特异性。所述分子标记方法进一步包括采用its1/its4为引物对进行对照扩增，扩增出条带表明pcr扩增体系的有效性。以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。实施例1分子生物学鉴定分离自辽宁省本溪市桓仁县老秃顶子山阔叶树枯木上的芬娜金针菇新菌株芬娜金针菇flammulinafennaehmgim-a151357，采用magen(美基)生物hipurefungaldnaminikitii真菌基因组dna抽提试剂盒提取菌丝体dna，以its1(tccgtaggtgaacctgcgg)、its4(tcctccgcttattgatatgc)为引物进行基因组its区域pcr试验，将扩增产物送至上海美吉生物测序，得到碱基数为760bp的序列，序列信息如图1所示。在ncbi网站使用blast程序将此序列比对分析，鉴定结果为flammulinafennae。实施例2人工栽培方法将纯化分离的芬娜金针菇菌种接种至装有原种培养料的13cm×25cm聚丙烯袋中，原种培养料成分为98％高粱粒，2％碳酸钙，24-25℃避光培养至菌丝长满菌袋后得到原种。将原种接种至栽培种培养料的聚丙烯出菇袋中，栽培种培养料成分为50％棉籽壳，38％木屑，10％麸皮，2％碳酸钙，置于24-25℃、空气相对湿度70％左右的培养室中避光培养至菌丝长满菌袋。然后开袋催蕾，并增加湿度至95％左右，待培养料表面出现水滴后，每天换风2次培养4天左右。然后降温至6℃、空气相对湿度85％左右、光照2h(每天)进行冷刺激，处理时间为4天左右。然后将温度升至18℃，空气相对湿度为85％左右，无光照，并控制二氧化碳浓度小于5％，等待幼菇长高至10cm以上、菌盖开始平展时即可采收。实施例3特异性引物通过将此芬娜金针菇菌株的编码蛋白质序列(codingsequence，简称cds序列，下同)与普通金针菇cds序列进行比对，确定了差异基因，通过筛选，确定该菌株的一个基因与普通金针菇基因差异较大，如表1所示。query/芬娜金针菇sbjct/普通金针菇identities/相似性evaluegenel3048lcl|gu169896.1-cds-adx07331.1-173.6841.46e-48具体差异位置如图2所示。据图2的差异位点，设计了2对特异性引物对，分别为引物对faa-f-1/faa-r-1，引物对faa-f-2/faa-r-3，具体的序列信息如下：引物faa-f-1：5′-gccctccctttaccagtcttgcttccgat-3′引物faa-r-1：5′-ctccatcgggttgatgtccgcaaa-3′引物faa-f-2：5′-gccctccctttaccagtc-3′引物faa-r-3：5′-attccgcatcctcaacct-3′采用上述引物对及pct体系进行鉴定，pcr反应体系为50μl，dna聚合酶混合液(premixtaqtm，rr003a)25μl，芬娜金针菇基因组dna模板5μl，引物各5μl，ddh2o10μl，对照以普通金针菇基因组dna为模板，反应程序表2所示。pcr反应结束后，将产物及dnamarker分别上样置于2％琼脂糖凝胶中，120v，电泳25min，然后取出凝胶，荧光下观察、拍照，如图3和图4所示。从图3和图4可以看出，芬娜金针菇和普通金针菇在以its1/its4为引物时，均可以扩增出条带，因此该引物对扩增的产物不能直接区分两种金针菇，但是特异性引物faa-f-1/faa-r-1、faa-f-2/faa-r-3能够通过pcr专一性地扩增出芬娜金针菇序列(分别为300-310bp及420-430bp)，pcr产物电泳图可以快速区分两种金针菇。因此，以上两对特异性核苷酸引物序列结合常规pcr、电泳方法可以快速准确鉴定此芬娜金针菇菌种，用以区分市场上的普通金针菇菌种。以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页1 2 3