一种菌核病抗性基因鉴定方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种菌核病抗性基因鉴定方法。

背景技术：

菌核病是由核盘菌（sclerotiniasclerorum）等真菌引起的植物病害，它可以侵染75科278属的408种植物，几乎可以危害全部双子叶植物和一些单子叶植物，主要危害的农作物有油菜、白菜、大豆、土豆、南瓜、花生、向日葵、芹菜、豌豆、胡萝卜、干豆、莴苣、黄瓜、菊芋和洋葱等。菌核病是一种破坏性极强的病害，在农业上每年造成巨大的损失。如在油菜生产中，菌核病每年全国发病面积在7000万亩以上，造成产量损失10%到20%，严重的情况可造成损失最高达80%。

菌核病的防治非常困难，现在采用的方法主要为化学防治或培育种植抗病品种。化学防治存在防效不高、病原难以根除、花期喷药困难以及农药残留、环境污染等诸多问题；常规育种具有难以找到有效的抗性材料以及育种速度非常缓慢等缺点，也很难有效解决抗病问题。随着分子生物学技术的发展，利用现代分子生物学技术发现和鉴定菌核病抗性基因，对抗菌核病作物品种的进行分子改良，快速培育抗菌核病品种，将是防治菌核病的重要策略。可见，菌核病抗性基因的鉴定是抗菌核病作物品种分子改良的重要基础。

然而，由于农作物生产周期长和普遍难以转化，现有的菌核病抗性基因的鉴定方法费时费力，而且对技术人员的专业化要求很高。以油菜为例，从载体构建到基因的转化，到转化株的筛选，然后直至抗病检测至少需要2年的时间。使得菌核病抗性基因的鉴定具有很大的局限性。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种可以快速、简便、低成本对菌核病抗性基因进行鉴定的方法。

发明人发现构建待测基因的表达载体，将表达载体转入农杆菌后转入烟草叶片中将待测基因快速转化到烟草，通过待测基因在烟草中的瞬时表达进行菌核病抗性基因的判定，能够实现菌核病抗性基因的筛选进程。目前尚未有相关的报道。因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种菌核病抗性基因鉴定方法，根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：

（1）在表达载体pcambia的上游kpni酶切位点处加入camv35s强启动子，下游bamhi酶切位点处加上camvnos终止子，构建载体pcambia-35s-nos，将待测基因x的片段连接入载体pcambia-35s-nos，构建得到待测基因x的重组载体pcambia-35s-x-nos；

（2）重组载体转化农杆菌的感受态细胞，在含有抗生素的培养基中培养得到重组菌悬液，转入空载质粒的空白菌株得到空载菌悬液作为空白对照；

（3）将步骤（2）中得到的重组菌悬液和空载菌悬液转入烟草叶片中，继续培养烟草植株；

（4）将核盘菌菌丝体接种在步骤（3）中转入菌悬液的烟草叶片上，暗培养后统计叶片发病情况，鉴定待测基因是否为抗性基因。

所述鉴定待测基因是否为抗性基因为当转入重组菌悬液的烟草叶片上病斑面积明显小于转入空白菌悬液的叶片时说明待测基因为菌核病抗性基因。

优选地，步骤（2）中所述的感受态细胞为农杆菌gv3101感受态细胞。

优选的，步骤（2）中所述的抗生素为庆大霉素、利福平和壮观霉素；所述抗生素的浓度均为50μg/ml，所述抗生素的含量占培养基总体积的千分之一。

优选的，步骤（2）中所述培养是当od600至0.6~0.8之后扩大培养至od600为1.5~2.0。

优选的，步骤（3）中所述的烟草叶片为顶端第二层和第三层叶片。

优选的，步骤（3）中所述的继续培养为温度23℃、湿度70~80%的遮光密闭培养箱中培养20~24h后返回光照培养箱光照培养。

优选的，步骤（4）中所述的暗培养为温度22℃、湿度70~80%的遮光密闭培养箱中培养20~24h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明构建待测基因的重组载体pcambia-35s-x-nos，重组载体转入农杆菌后将待测基因快速转化到烟草叶片中，通过待测基因在烟草中的瞬时表达进行菌核病抗性基因的判定，从而快速鉴定出待测基因是否是菌核病抗性基因；本发明所述的菌核病抗性基因鉴定方法可以有效缩短抗性鉴定时间，通过本申请所述的方法鉴定油菜菌核病抗性基因仅需要1.5个月左右的时间，明显的缩短鉴定时间，节约成本；本发明所提供的检测方法操作简单，不需要高度专业化的技术人员。

附图说明

图1是pcambia-35s-x-nos载体的t-dna结构示意图；图中，x为待测基因，35s为camv启动子，nos为终止子；

图2是分别注射农杆菌-bnsrg1和农杆菌-空白（wt）的烟草叶片接种菌核病后病斑面积对比图；

图3是分别注射农杆菌-bnsrg2、农杆菌-atsrg2和农杆菌-空白（wt）的烟草叶片接种菌核病后病斑面积对比图。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。

表达载体pcambia在市场上购得。pcambia-35s-nos由本实验室常规方法构建。农杆菌gv3101菌种及其感受态细胞可以通过商业途径购买得到。核盘菌(sclerotiniasclerorum(lib.)debary)的菌核采集于江苏大学试验田。

实施例1

在油菜（brassicanapus）的核盘菌（s.sclerotiorum）诱导表达研究中，发现了2个对核盘菌侵染显著响应的油菜基因，分别命名为bnsrg1（b.napussclerotiniaresponsegene1），核苷酸序列如seqidno.1所示，bnsrg2（b.napussclerotiniaresponsegene2），核苷酸序列如seqidno.2所示，另外从模式植物拟南芥（arabidopsisthaliana）中克隆了bnsrg2的同源基因atsrg2核苷酸序列如seqidno.3所示；本申请以bnsrg1、bnsrg2和atsrg2为例检测其是否为菌核病抗性基因。

使用primerpremier5引物设计软件，根据bnsrg1的核苷酸序列设计pcr引物，上游f引物核苷酸序列如seqidno.4所示，即为5'-ggtacctcttctcatttcagtccctca-3'，下游r引物核苷酸序列如seqidno.5所示，即为5'-ggatccggatatttagccattcattcg-3'；上游f和下游r引物分别含有kpni和bamhi酶切位点；使用pcr从油菜cdna文库中扩增bnsrg1基因全长，pcr体系为：50µl体系；cdna模板：2µl、ddh2o：31µl、f引物：1.5µl、r引物：1.5µl、kod-plus-neo:1µl、10×kod-plus-neobuffer：5µl、mgso4:3µl、dntp：5µl；pcr程序：94℃2min，98℃10s，55℃30s，68℃1min10s，68℃10min，12℃60min；琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，按照pmd^tm18-t说明书将回收到的目的片段连接t载体，遗传转化至大肠杆菌感受态细胞dh5α后于-70℃冰箱保存；提取质粒，质粒kpni/bamhi双酶切后连接到载体pcambia-35s-nos上，得到重组载体pcambia-35s-bnsrg1-nos。将pcambia-35s-bnsrg1-nos按照冻融法转入农杆菌gv3101感受态细胞，得到bnsrg1基因的过表达载体农杆菌-bnsrg1，-70℃冰箱长期保存备用。

重组载体pcambia-35s-x-nos（pca-35s-x-nos，其中x为待测基因）的具体制备方法为：在表达载体pcambia的上游kpni酶切位点处加入camv35s强启动子，其下游bamhi酶切位点处加上camvnos终止子，将其改造成载体pcambia-35s-nos；最后通过双酶切的方法将测试基因x连接到pcambia-35s-nos上，获得重组载体pca-35s-x-nos。

以相同的方法构建bnsrg2和atsrg2基因的重组载体：pcambia-35s-bnsrg2-nos和pcambia-35s-atsrg2-nos。并分别转入农杆菌gv3101感受态细胞中形成，农杆菌-bnsrg2和农杆菌-atsrg2。图1是pcambia-35s-x-nos载体的t-dna结构示意图；图中，x为待测基因：bnsrg1，bnsrg2和atsrg2。35s为花椰菜花叶病毒(camv）启动子，nos为终止子。

分别挑取农杆菌-bnsrg1bnsrg1、农杆菌-bnsrg2和农杆菌-atsrg2于5ml液体lb培养基a中培养16h-24h，液体lb培养基a成分为：另含有50μg/ml庆大霉素、50μg/ml利福平和50μg/ml壮观霉素各5μl的lb培养基。作为对照挑取农杆菌gv3101于5ml液体lb培养基b，液体lb培养基b中培养相同时间，其成分为：另含有50μg/ml庆大霉素和50μg/ml利福平各5μl的lb培养基；培养条件均为：28℃，200rpm，恒温震荡培养12h至od600为0.6~0.8后吸取1ml活化菌液扩大培养至50ml，28℃，200rpm，震荡培养18h至od600=1.5~2.0后分别将菌液转移至50ml离心管，4000rpm，室温离心15分钟收集菌悬液，加入ms培养基5ml，吹打重悬，重悬液转移至灭菌三角烧瓶，加入195ml的ms培养基，28℃，200rpm诱导3h后分别得到农杆菌-bnsrg1bnsrg1菌悬液、农杆菌-bnsrg2菌悬液、农杆菌-atsrg2菌悬液和农杆菌-空白菌悬液。

取本氏烟草（nicotianabenthamiana）在23℃，10h光照14h黑暗循环的光照培养箱里生长30天，生长到8叶期，叶表面光强度设置为280μmol·m^-2·s^-1；选取8叶期的叶片，用去掉针头的2ml医用一次性无菌注射器吸取菌悬液，分别将上述制备的农杆菌-bnsrg1bnsrg1菌悬液、农杆菌-bnsrg2菌悬液、农杆菌-atsrg2菌悬液和农杆菌-空白菌悬液注入烟草叶片中，本申请经过多次验证后发现烟草叶片的幼嫩程度即生长状况关系到所承受的待测基因的菌悬液含量以及菌悬液中待测基因是否能成功表达。当选择较嫩的烟草叶片时，菌悬液注入烟草叶片后叶片容易破损，会导致叶片萎蔫，影响后续接菌实验；而选择较老一点的叶片时，菌悬液注入烟草叶片后基因的表达不能达到显著水平，对后续实验也有影响，而选择生长状况良好的第二层、第三层叶片满足实验要求。本实施例中每株烟草植株选取四到五片叶片，优选顶端第二层、第三层叶片，在叶片下表面注入菌悬液至叶片布满菌悬液。将注射完成后的烟草植株置于温度为23℃、湿度为70~80%的遮光密闭培养箱中，培养20~24h后返回光照培养箱光照培养96h后接种核盘菌菌丝体；用φ5mm的打孔器沿着核盘菌菌丝边缘打孔，取布有菌丝体的pda菌丝块，以菌丝面紧贴注入菌悬液的烟草叶片，用无毒镊子轻压菌块；接种位置要避开叶脉，每个叶片在主叶脉两侧分别各接种一个菌丝块；接种完成后将烟草置于温度为22℃、湿度为70~80%的黑暗培养箱中放置20~24h，然后叶片发病情况。

用imagej软件来统计叶片病斑面积，图2是分别注射农杆菌-bnsrg1和农杆菌-空白（wt）的烟草叶片接种菌核病后病斑面积对比图；图3是分别注射农杆菌-bnsrg2、农杆菌-atsrg2和农杆菌-空白（wt）的烟草叶片接种菌核病后病斑面积对比图；图中，***（p<0.001）表示统计显著差异。如图2、3所示，当核盘菌侵染24h时，农杆菌-bnsrg1和农杆菌-atsrg2的烟草叶片病斑面积显著（p<0.001）小于农杆菌-空白，而农杆菌-bnsrg2的烟草叶片病斑面积与农杆菌-空白相比没有明显差别；说明转化bnsrg1、和atsrg2的烟草叶片明显增强菌核病抗性，这两种基因是菌核病抗性基因，而bnsrg2不是菌核病抗性基因。

上述的核盘菌菌丝体的培育为：将核盘菌菌核用75%乙醇浸泡消毒3分钟，无菌水冲洗3遍后，接种到固体pda培养基的中心位置；将培养皿避光置于20℃环境下60h，待菌丝即将铺满培养基时用φ5mm打孔器将菌丝体沿同一圆周面积的培养基外援打孔，获取菌丝块，倒置，转接到固体pda培养基，报纸包裹，20℃环境下生长24h，菌丝即将铺满培养基表面时最为适宜接种，通过两次活化来增强核盘菌的活力。

实施例2

为了进一步对bnsrg1、bnsrg2和atsrg2三个基因的菌核病抗性进行评价，分别将上述三个基因遗传转化至油菜中稳定表达后对转化株后代进行菌核病抗性基因鉴定。通过下胚轴转化法分别将实施例1制备的农杆菌-bnsrg1菌悬液、农杆菌-bnsrg2菌悬液和农杆菌-atsrg2菌悬液载体遗传转化至油菜中，培育出苗。转化方法为将油菜种子灭菌后播种到种子萌发培养基中培养萌发出下胚轴，分别加入实施例1制备的农杆菌-bnsrg1菌悬液、农杆菌-bnsrg2菌悬液、农杆菌-atsrg2菌悬液进行浸染，转移至相应抗性的筛选培养基中继代培养3-5次诱导长出绿色愈伤组织，转至生根培养基，最后土培出苗，进行pcr鉴定得到阳性转化株。将鉴定得到的阳性转化株移栽到大田，经过春化（越冬）后到第二年的5，6月份收取种子。选择油菜的阳性转化株的叶片进行接菌试验接种核盘菌菌丝体，观察叶片菌核病发病情况，判断该基因是否为菌核病抗性基因。结果表明bnsrg1和atsrg2是菌核病抗性基因，而bnsrg2不是菌核病抗性基因。这与实施例1中的鉴定菌核病抗性基因得到的结果相一致。由此可以证实通过本实施例1中的方法使待测基因在烟草中瞬时表达与通过常规方法稳定表达均可以进行菌核病抗性基因的准确筛选。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>江苏大学

<120>一种菌核病抗性基因鉴定方法

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