一株具有促骨髓间充质干细胞增殖作用的动物双歧杆菌及其应用的制作方法

本发明属于生物技术及食品、药品技术领域，具体涉及一株具有促骨髓间充质干细胞增殖作用的动物双歧杆菌及其应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

益生菌是能够对人体产生有益作用的微生物的总称。目前主要有乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌、酪酸梭菌等，越来越广泛的应用于食品、药品、农业、畜牧业、生物工程等。其中双歧杆菌是人肠道中最重要的菌群之一，也是衡量人健康长寿的重要指标之一，被称为人类的“健康卫士”。多种报道均证明双歧杆菌能够增强肠道粘膜屏障功能，防止致病菌侵入肠道；通过刺激肠道免疫系统，产生分泌型抗体siga，激活t细胞的非特异性免疫功能，产生多种细胞因子等增强人体免疫功能；同时，双歧杆菌还具有抗肿瘤、抗感染、延缓衰老的功能。定植于人体肠道的双歧杆菌可在体内合成维生素k、b1、b2、b12、叶酸等维生素，产生乙酸、甲酸、乳酸、乙醇，抑制腐败菌的生长，刺激肠道蠕动缓解便秘症状。关于益生菌对肠道粘膜保护作用的报道较多。专利cn201710039037中公开了一株乳杆菌d8可以显著提高小肠绒毛的长度和小肠隐窝的深度，降低肠炎症状，着重公开了通过体外乳杆菌-肠道类器官-固有层淋巴细胞共培养模型，发现乳杆菌d8可以促进肠道干细胞的增殖。多种报道称使用乳酸菌后小肠绒毛变长，隐窝加深，最有可能原因是乳酸菌促进了肠道干细胞的增殖，肠道干细胞位于隐窝基底部不断向隐窝顶部迁移，在迁移过程中肠道干细胞分化成不同的肠道粘膜细胞，使得小肠绒毛变长，隐窝加深。

骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，bmscs)是存在于骨髓中除造血干细胞之外的另一类干细胞，具有分化成骨、软骨、脂肪、神经等多种分化潜能的细胞亚群。该细胞广泛应用于白血病、心脑血管疾病、肝硬化、骨和肌肉退行性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆等的临床治疗。因此，bmscs的分离培养增殖在各种应用中均具有基础决定作用。对促进骨髓间充质干细胞的报道较多。其中专利cn201810624600公开了一种多肽能促进骨髓间充质干细胞的增殖；专利cn201811164544公开了α-雪松烯、β-雪松烯和异雪松酮可以有效促进人骨髓间充质干细胞的增殖，且不会影响其多向分化能力。关于中药及中药成分提取物具有促进骨髓间充质干细胞增殖作用的报道更多，卫荣报道了中药补肾活血方提取物能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖；刘耀辉报道了熊果酸可干预骨髓间充质干细胞的增殖；银楠楠报道了通窍活血汤可诱导骨髓间充质干细胞增殖及分化。然而，据发明人所知，目前尚未发现关于益生菌特别是动物双歧杆菌对骨髓间充质干细胞具有增殖作用的报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提供一株动物双歧杆菌，经试验验证，该菌株具有良好的促骨髓间充质干细胞增殖作用，同时该菌株还具有优异的生产性能和产酸能力，适于工业化大规模培养和生产，因此具有良好的实际应用之前景。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供一株动物双歧杆菌，该菌株命名为动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9，于2019年6月13日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，其保藏编号为cctccno:m2019454。

本发明的第二个方面，提供上述动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9的培养方法，所述方法包括将动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9置于培养基中进行厌氧培养，所述培养条件包括在30-40℃(优选为37℃)培养1-24h(优选为12-16h)。

本发明的第三个方面，提供上述动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9和/或上述培养方法制得的动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9培养物在制备促骨髓间充质干细胞增殖产品中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种促骨髓间充质干细胞增殖的产品，所述产品的活性成分包括上述动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9和/或上述培养方法制得的动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9培养物。

本发明的第五个方面，提供一种体外培养骨髓间充质干细胞的方法，所述方法包括给予上述动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9和/或上述培养方法制得的动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9培养物和/或上述产品。

本发明的有益技术效果：

本发明首次分离筛选获得一株具有良好促骨髓间充质干细胞增殖作用的动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9，其同时兼具良好的生产性能和产酸性能，上述诸多特性表明其是一株在骨髓间充质干细胞研究和治疗领域具有潜在应用前景的益生菌新菌株，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明动物双歧杆菌nfty9平板单菌落划线图。

图2为本发明动物双歧杆菌nfty9革兰氏染色镜检结果图(油镜观察)。

图3为本发明动物双歧杆菌nfty9生化实验结果图。

图4为本发明动物双歧杆菌nfty9同源性分析图。

图5为本发明动物双歧杆菌nfty9系统进化树图。

图6为本发明动物双歧杆菌nfty9与动物双歧杆菌c3-0008生物量的比较图。

图7为本发明动物双歧杆菌nfty9与动物双歧杆菌c3-0008产酸曲线比较图。

图8为本发明使用的骨髓间充质干细胞图。

图9为本发明动物双歧杆菌nfty9促进骨髓间充质干细胞增殖相关图；其中，图9(a)为空白对照组；图9(b)为nfty9发酵液稀释至2^-4时，对骨髓间充质干细胞促增殖作用图；图9(c)为nfty9发酵液稀释至2^-5时，对骨髓间充质干细胞促增殖作用图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，目前尚未发现关于益生菌特别是动物双歧杆菌对骨髓间充质干细胞具有增殖作用的报道。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一株动物双歧杆菌，该菌株命名为动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9，于2019年6月13日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，其保藏编号为cctccno:m2019454。

所述nfty9菌株的菌种生物学特性如下：菌落呈白色圆形单菌落，表面湿润光滑。革兰氏阳性厌氧菌，菌体有的呈一头大的棒球杆状、有的为两头粗大的“v”字型。能够利用棉子糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖产酸，对菊糖、水杨苷、甘露醇、纤维二糖和山梨醇的利用率弱；生长温度最适为37℃。同时，对该菌株进行16srrna测序，获得该菌株的16srdna序列如seqidno.1所示。对该菌株进行同源性分析并利用mega软件构建系统进化树，基于上述菌落形态、生理生化性状及基因测序比对鉴定，确定该菌株为动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)。

本发明的一个具体实施方式中，提供上述动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9的培养方法，所述方法包括将动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9置于培养基中进行厌氧培养，所述培养条件包括在30-40℃(优选为37℃)培养1-24h(优选为12-16h)。

本发明的一个具体实施方式中，所述培养基为适于乳酸菌生长繁殖的培养基，进一步优选为适于双歧杆菌生长繁殖的培养基，更进一步优选为tpy培养基。

本发明的一个具体实施方式中，提供上述动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9和/或上述培养方法制得的动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9培养物在制备促骨髓间充质干细胞增殖产品中的应用。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种促骨髓间充质干细胞增殖的产品，所述产品的活性成分包括上述动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9和/或上述培养方法制得的动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9培养物。

本发明的一个具体实施方式中，所述产品中还可以包含其它至少一种用于促进骨髓间充质干细胞增殖的物质。

本发明的一个具体实施方式中，所述产品为食品、保健品或药品。

本发明的一个具体实施方式中，所述产品还可以包含一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，其实施例可以为添加甜味剂的口服溶液。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种体外培养骨髓间充质干细胞的方法，所述方法包括给予上述动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9和/或上述动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)nfty9培养物和/或上述产品。通过在培养骨髓间充质干细胞时施加本发明上述制品，有利于骨髓间充质干细胞的增殖生长，为研究骨髓间充质干细胞增殖信号通路及基因表达交互作用，从而为进一步研究骨髓间充质干细胞相关性疾病提供原始材料并奠定基础。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：乳酸菌的分离培养

1材料

tpy培养基；2×taqpcrmastermix、dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；

2、方法

2.1双歧杆菌的分离

将5g婴儿粪便样品加入到45ml无菌生理盐水混匀，并用无菌生理盐水进行梯度稀释，选取适当的浓度，利用平板划线法在37℃厌氧环境下，tpy培养基上进行过夜培养。第二天取典型菌落纯化培养，单个菌落在tpy固体培养基上纯化3-4次，直至镜检菌形态单一为止。

2.2菌种的鉴定

取单个菌落涂片革兰氏染色镜检观察。接种tpy液体培养基37℃厌氧培养过夜，用dna提取试剂盒进行基因组dna的提取。pcr扩增目的片段，16srrna通用引物进行扩增。扩增后的产物交于生工生物工程股份有限公司测序。测序结果与genbank数据库进行序列比对，同源性分析。

2.3生化实验

将用接种针从平板上挑取纯化的单个菌落到生化管中，37℃厌氧培养48h。观察对纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖和乳糖的发酵情况。

2.4生物性能测定

2.4.1生物量测定

将分离并鉴定的双歧杆菌按2％的接种量分别接入tpy液体培养基中，37℃恒温培养24h，利用梯度稀释测定生物量。

2.4.2产酸能力测定

将分离并鉴定的双歧杆菌分别按2％的接种量分别接入tpy液体培养基中，37℃恒温培养每隔2h测定不同菌株发酵液ph，绘制的产酸速率曲线是不同发酵时间(h)对应发酵液ph值的变化。

3结果

3.1菌落形态

在tpy固体平板上单菌落划线37℃厌氧培养48h后，可见nfty9菌落呈白色圆形单菌落，表面湿润光滑。经革兰氏染色镜检发现，nfty9为革兰氏阳性菌，菌体有的呈一头大的棒球杆状、有的为两头粗大的“v”字型，为典型的双歧杆菌形态(见图1、图2)。

3.2测序结果

将pcr产物送生工生物工程股份有限公司测序后，在ncbi上blast结果显示，与动物双歧杆菌同源性99％以上(图3、图4)，因此，该菌株为动物双歧杆菌。

3.3生化鉴定结果(图5)

棉子糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖为阳性结果。菊糖、水杨苷、甘露醇、纤维二糖和山梨醇弱阳性。说明nfty9可以很好的利用棉子糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖。

3.4生物量测定

分离经鉴定为动物双歧杆菌的6株菌和实验室保存菌种c3-0008培养24h后，可以看出nfty9的生物量最高，达到1.6×10⁹cfu/ml。产酸最高，ph最低降至3.46。

表1动物双歧杆菌生物量测定

挑选出生物量相对较高的c3-0008和nfty9，每隔2h取样测定od值，每隔4h取样测定活菌数，比较两株菌的生产性能发现：nfty9在发酵到12-16h时，活菌数达到最高，此后随发酵时间的延长，活菌数略有下降。生产性能显著好于实验室原有菌种c3-0008(见图6)。

表2两株菌每4小时生物量的比较

3.5产酸能力的测定

由结果可知(见图7)，c3-0008在发酵14h，发酵液ph值呈线性下降趋势，14h-24小时基本趋于稳定在4.4左右。nfty9在发酵6-8h时，发酵液ph值直线下降至4左右，发酵至10-12小时，ph值基本趋于稳定在4以下。产酸能力较c3-0008强。

实施例2：骨髓间充质干细胞的分离培养

1材料

高糖dmem、1％双抗(青霉素/链霉素)：购自hyclone公司；pbs缓冲液：nacl8‰，kcl0.2‰，na2hpo4·12h2o3.58‰，kh2po40.27‰；胰酶：含0.25％胰酶和0.02％edta；胎牛血清：购自浙江天杭生物科技股份有限公司；昆明小白鼠：购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。

2方法

断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，用生理盐水将骨髓间充质干细胞冲洗下来，1500rpm离心10min，弃掉上清，用生理盐水冲洗细胞2遍，后用10％胎牛血清的高糖dmem吹打混匀后，铺到6孔板上置于37℃co2培养箱培养。24h后半换液，48h后全换液，细胞长满70％-80％时，传代，此时为1代细胞，往后依次传代为2代细胞。

3结果

由图8可以看出新分离的mscs呈小圆梭型，形态规整。mscs传代培养的细胞大小均匀，形态较一致，多为梭形，此时细胞不再以成克隆的方式生长，而是散在分布生长。mscs连续传2代，细胞形态无明显变化，无衰老征象，传代周期6-7d。表明mscs得到了进一步的纯化及扩增。

实施例3：益生菌在mscs上的增殖作用

1材料

cck8购自北京索莱宝科技有限公司；胰酶+edta、高糖dmem、购自hyclone公司；96孔板、6孔板购自star公司。

2方法

2.1细胞的传代

将分离的mscs细胞在6孔板上传至1代，用胰酶消化后传至96孔板上为2代细胞，培养72h后用于正式实验。

2.2益生菌的培养及发酵

nfty9、c3-0008双歧杆菌采用tpy液体培养基37℃厌氧培养16-18h，c2-0126(植物乳杆菌)、c2-0106(瑞士乳杆菌)、3tx4(植物乳杆菌)采用mrs液体培养基37℃培养16-18h，3000rpmm离心分离上清和沉淀，121℃灭菌20-30min，保藏于-20℃中备用。

2.2发酵液及菌体(灭活)在小鼠骨髓间充质干细胞上的增殖作用

将nfty9、c3-0008、实验室菌株c2-0126(植物乳杆菌)、c2-0106(瑞士乳杆菌)、3tx4(植物乳杆菌)菌液及菌体分别用细胞培养液将浓度倍比稀释至2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5、2^-6······倍，并加入到骨髓间充质干细胞长至50％的96孔细胞板上，每个浓度重复4个孔，置于37℃co2培养箱培养48h，后用cck8法检测细胞增殖情况。

3结果

3.1发酵液在小鼠骨髓间充质干细胞上的增殖作用

由结果可知，nfty9发酵液在稀释到2^-3-2^-10时，od450nm值显著高于空白对照组，说明细胞数量显著多于空白对照组，增殖59.49％-126.40％。c3-0008对mscs的增殖率为9.32％-74.54％，c2-0106对mscs的增殖率为3.65％-46.65％，3tx4的增殖率为0.55％-28.18％。c2-0126的增殖效果不明显。nfty9的增殖效果最好。图9显示nfty9增殖的细胞图。

表3发酵液对mscs增殖作用比较(od450nm)

注：相同大写字母p＞0.01，不同大写字母p＜0.01；

相同小写字母p＞0.05，不同小写字母p＜0.05。

表4发酵液对mscs的增殖率

3.2菌体对mscs的增殖实验

由结果可知，nfty9菌体对mscs的增殖率在111.83％-158.58％之间，c3-0008对mscs的增殖率在94.16％-157.79％之间，nfty9菌体的增殖效果较c3-0008稍好。其次增殖效果c2-0106优于3tx4。c2-0126增殖效果不明显。

表5菌体对mscs增殖作用比较(od450nm)

注：相同大写字母p＞0.01，不同大写字母p＜0.01；

相同小写字母p＞0.05，不同小写字母p＜0.05。

表6菌体对mscs增殖作用比较(od450nm)

4结论

nfty9的生物量较其他动物双歧杆菌显著性高，产酸能力也较其他动物双歧杆菌菌种高。nfty9对骨髓间充质干细胞的增殖作用均显著性的好于其他菌。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

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<110>泰安大凡神农制药有限公司

<120>一株具有促骨髓间充质干细胞增殖作用的动物双歧杆菌及其应用

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