一种间充质干细胞及其外泌体和其在治疗肛瘘中的应用的制作方法

本发明涉及干细胞
技术领域：
，尤其涉及一种间充质干细胞及其外泌体和其在治疗肛瘘中的应用。
背景技术：
：肛瘘是炎症性肠炎(ibd)的一种常见并发症，指直肠与肛周皮肤之间形成相通的管道，受遗传因素、免疫调节、肠道菌群等多重因素影响，导致瘘管长期不愈合。常规治疗创面大、易感染、易复发。干细胞治疗取得一定进展，愈合率明显提升，复发率降低，但由于细胞存活率不稳定导致疗效差异，因此有必要为注入细胞提供良好的生存环境，提高细胞存活率，确保治疗效果稳定。虽然使用干细胞治疗肛瘘已经在国内外均有报道，但是利用间充质干细胞外泌体及其制剂用于治疗肛瘘目前尚未见报道。技术实现要素：基于
背景技术：
存在的技术问题，本发明提出了一种间充质干细胞及其外泌体和其在治疗肛瘘中的应用。本发明的技术方案如下：一种间充质干细胞外泌体(exo-adscs)，其提取方法，包括以下步骤：取扩增第3代间充质干细胞培养上清，1000rpm离心4～6min，吸出上清液转移至新的离心管中，10000×g离心8～15min，吸出上清液转移至新的离心管中，超速离心120000×g离心150～200min，或者按照外泌体提取试剂盒说明得到外泌体沉淀，即可得到间充质干细胞外泌体；电子显微镜鉴定外泌体提取情况，westernblot鉴定外泌体表面标志蛋白。优选的，所述的间充质干细胞外泌体为应用自体脂肪来源的间充质干细胞外泌体。一种治疗肛瘘的混合制剂，其主要成分包括间充质干细胞外泌体及其间充质干细胞。优选的，所述的治疗肛瘘的混合制剂，包括以下有效成分：间充质干细胞(adscs)、间充质干细胞外泌体(exo-adscs)、自体富血小板血浆(prp)和合成抑菌多肽(amp)。优选的，所述的prp的制备方法，包括以下步骤：抽取患者本人20～50ml外周血加入2～10ml抗凝剂，转移至50ml离心管中，以300g/min离心20～30min，吸取上层血浆、中间白膜层和少量红细胞至新的50ml离心管中；然后以700～800g/min，离心10min，吸出上清至新的离心管备用，使用该上清液调整血小板浓度至500～1000×106个/ml，即为prp。一种治疗肛瘘的混合制剂的制备方法，包括以下步骤：a、取扩增3代的间充质干细胞，经胰酶替代物消化后，转移至50ml离心管以300g/min离心10min，去上清，再加入生理盐水重悬细胞悬液，以300g/min离心10min，重复2次；b、加入10ml生理盐水重悬细胞，吹打混匀，取样50μl左右的细胞悬液，用来计算细胞数量、活率，剩余细胞再次以300g/min离心10min；c、调整细胞密度至2～5×107个/ml，每ml细胞悬液加入1mlprp、100μl外泌体和100μl抑菌多肽，即得到治疗肛瘘的干细胞混合制剂。优选的，本发明的治疗肛瘘的混合制剂，使用前10～20min，加入凝血酶和钙离子溶液，进行激活形成prp凝胶，为干细胞生长提供支撑。进一步优选的，所述的钙离子溶液为葡萄糖酸钙溶液或者氯化钙溶液。本发明的有益之处在于：本发明提供了一种应用自体脂肪来源间充质干细胞混合制剂进行肛瘘治疗的方法。干细胞制剂中包含自体脂肪来源间充质干细胞(adscs)及其外泌体(exo-adscs)、自体富血小板血浆(prp)和合成抑菌多肽(amp)。干细胞5代以内，流式检测间充质干细胞特异性表面标志物90％以上，造血干细胞表面标志物10％以下，干细胞为主要功能成分，其免疫调节，自我更新，多向分化，分泌蛋白等特性在治疗中发挥着关键作用。其他成分能够有效的改善adscs的微环境，使其更好的发挥作用。其中，exo-adscs是干细胞分泌的关键物质，可通过试剂盒或超速离心获得，同样具有免疫抑制作用，抑制瘘管复发，同时维持干细胞微环境具有重要意义，且在该领域的应用尚未见报道。prp血小板富集2～5倍，可通过一步离心或者两步离心法或者商品化试剂盒得到，其中富含多种生长因子，通过激活剂作用可形成三维凝胶，为干细胞提供生物支架，同时能够促进干细胞生长和病灶部位血管生成，且具有一定的抑菌作用。合成多肽全化学合成，成分单一可控，便于标准化生产，其主要作用是针对肠道内多种菌群滋生的环境，避免干细胞生长的营养成分流失，为其提供更优越的生长环境，同时降低感染的发生。干细胞具有免疫调节功能，外泌体营造利于恢复的微环境，同时刺激干细胞释放各种生长因子，促进创面愈合。prp凝胶提供支持和营养成分，与干细胞协同作用，提高干细胞移植后成活率，使其更好的发挥作用。合成多肽成分单一，可控，降低感染发生。它们的联合使用大大提高肛瘘治愈率。附图说明图1：本发明实施例1的治疗肛瘘的混合制剂治疗的某一具体案例的mri检测结果；其中，(a)：术前mri检测瘘管部位(箭头标注)、(b)：术后2个月mri检测结果显示瘘管基本愈合、(c)：术后4个月mri检测结果显示瘘道已完全愈合。具体实施方式实施例1一种治疗肛瘘的混合制剂，包括以下有效成分：间充质干细胞(adscs)、间充质干细胞外泌体(exo-adscs)、自体富血小板血浆(prp)和合成抑菌多肽(amp)。所述的prp的制备方法，包括以下步骤：抽取患者本人35ml外周血加入8ml抗凝剂，转移至50ml离心管中，以300g/min离心25min，吸取上层血浆、中间白膜层和少量红细胞至新的50ml离心管中；然后以750g/min，离心10min，吸出上清至新的离心管备用，使用该上清液调整血小板浓度至800×106个/ml，即为prp。所述的间充质干细胞外泌体，其提取方法，包括以下步骤：取扩增第3代间充质干细胞培养上清，1000rpm离心5min，吸出上清液转移至新的离心管中，10000×g离心10min，吸出上清液转移至新的离心管中，超速离心120000×g离心180min，或者按照外泌体提取试剂盒说明得到外泌体沉淀，即可得到间充质干细胞外泌体；电子显微镜鉴定外泌体提取情况，westernblot鉴定外泌体表面标志蛋白。一种治疗肛瘘的混合制剂的制备方法，包括以下步骤：a、取扩增3代的间充质干细胞，经胰酶替代物消化后，转移至50ml离心管以300g/min离心10min，去上清，再加入生理盐水重悬细胞悬液，以300g/min离心10min，重复2次；b、加入10ml生理盐水重悬细胞，吹打混匀，取样50μl左右的细胞悬液，用来计算细胞数量、活率，剩余细胞再次以300g/min离心10min；c、调整细胞密度至2～5×107个/ml，每ml细胞悬液加入1mlprp、100μl外泌体和100μl抑菌多肽，即得到治疗肛瘘的干细胞混合制剂。实施例2一种治疗肛瘘的混合制剂，包括以下有效成分：间充质干细胞(adscs)、间充质干细胞外泌体(exo-adscs)、自体富血小板血浆(prp)和合成抑菌多肽(amp)。所述的prp的制备方法，包括以下步骤：抽取患者本人50ml外周血加入2ml抗凝剂，转移至50ml离心管中，以300g/min离心30min，吸取上层血浆、中间白膜层和少量红细胞至新的50ml离心管中；然后以700g/min，离心10min，吸出上清至新的离心管备用，使用该上清液调整血小板浓度至1000×106个/ml，即为prp。所述的间充质干细胞外泌体，其提取方法，包括以下步骤：取扩增第3代间充质干细胞培养上清，1000rpm离心6min，吸出上清液转移至新的离心管中，10000×g离心8min，吸出上清液转移至新的离心管中，超速离心120000×g离心200min，或者按照外泌体提取试剂盒说明得到外泌体沉淀，即可得到间充质干细胞外泌体；电子显微镜鉴定外泌体提取情况，westernblot鉴定外泌体表面标志蛋白。一种治疗肛瘘的混合制剂的制备方法，包括以下步骤：a、取扩增3代的间充质干细胞，经胰酶替代物消化后，转移至50ml离心管以300g/min离心10min，去上清，再加入生理盐水重悬细胞悬液，以300g/min离心10min，重复2次；b、加入10ml生理盐水重悬细胞，吹打混匀，取样50μl左右的细胞悬液，用来计算细胞数量、活率，剩余细胞再次以300g/min离心10min；c、调整细胞密度至2～5×107个/ml，每ml细胞悬液加入1mlprp、100μl外泌体和100μl抑菌多肽，即得到治疗肛瘘的干细胞混合制剂。实施例3一种治疗肛瘘的混合制剂，包括以下有效成分：间充质干细胞(adscs)、间充质干细胞外泌体(exo-adscs)、自体富血小板血浆(prp)和合成抑菌多肽(amp)。所述的prp的制备方法，包括以下步骤：抽取患者本人20ml外周血加入10ml抗凝剂，转移至50ml离心管中，以300g/min离心20min，吸取上层血浆、中间白膜层和少量红细胞至新的50ml离心管中；然后以800g/min，离心10min，吸出上清至新的离心管备用，使用该上清液调整血小板浓度至500×106个/ml，即为prp。所述的间充质干细胞外泌体，其提取方法，包括以下步骤：取扩增第3代间充质干细胞培养上清，1000rpm离心4min，吸出上清液转移至新的离心管中，10000×g离心15min，吸出上清液转移至新的离心管中，超速离心120000×g离心150min，或者按照外泌体提取试剂盒说明得到外泌体沉淀，即可得到间充质干细胞外泌体；电子显微镜鉴定外泌体提取情况，westernblot鉴定外泌体表面标志蛋白。一种治疗肛瘘的混合制剂的制备方法，包括以下步骤：a、取扩增3代的间充质干细胞，经胰酶替代物消化后，转移至50ml离心管以300g/min离心10min，去上清，再加入生理盐水重悬细胞悬液，以300g/min离心10min，重复2次；b、加入10ml生理盐水重悬细胞，吹打混匀，取样50μl左右的细胞悬液，用来计算细胞数量、活率，剩余细胞再次以300g/min离心10min；c、调整细胞密度至2～5×107个/ml，每ml细胞悬液加入1mlprp、100μl外泌体和100μl抑菌多肽，即得到治疗肛瘘的干细胞混合制剂。对比例1将实施例1中的自体富血小板血浆(prp)去除，其余配比和制备方法不变。以下为具体测试：选取120名复杂性肛瘘患者(对照组、实施例1和对比例1各40例，其中对照组患者不使用本发明的治疗肛瘘的混合制剂)，这些患者为采用其他手段治疗效果不佳或无明显改善者，其他治疗应至少发生在一周之前，瘘管处无引流、挂线等。实施例1和对比例1的处理方法为：瘘管行清创处理，生理盐水冲洗瘘管，吸取制备的加入凝血酶和葡萄糖酸钙溶液的干细胞混合制剂，10～20min之内将混合制剂1/2～1/3均匀注入瘘管壁，剩余部分填充至瘘管腔内部，单次治疗细胞用量为1～10×106个细胞每cm瘘管，必要时可重复多次，每两次间隔不小于一周。每周记录患者恢复情况，至少连续观察和回访24个月。1、评价指标克罗恩病活性指数(cdai)评分，vas疼痛评级，骨盆腔核磁共振，肠镜，肛门指检等。记录瘘管愈合时间、复发率，以及尿潴留、尿失禁等可能出现的副作用。复杂性肛瘘疗效评定参照1994年国家中医药管理局发布的《中医病症诊断疗效标准》：1.临床治愈，创面完全愈合，各症状均消失；2.显效，创面完全愈合，流脓，肿痛症状消失，仅有肛周潮湿、瘙痒症状。3.有效，创面未愈合，但流脓、肿痛、瘙痒等症状改善。4.无效，症状、体征均无改善。5.近期治愈，随诊3个月，原发部位无复发。2、案例统计具体方法见表1：克罗恩病活性指数(cdai)评分表。表1：cdai评分表备注：cdai评分没有上限；＜150分：临床缓解；150～220：轻度活动；220～450：中度活动；＞450：重度活动。表2：本发明的cdai评分对比统计表。分组例数术前术后1个月术后2个月术后3个月对照组40298.67±30.17273.11±32.13243.78±30.15168.89±24.46实施例140297.18±34.84259.37±36.42197.82±40.75116.82±24.37对比例140297.13±33.15268.85±34.97227.56±33.84148.36±25.72由以上测试结果可以知道，术后2个月后观察结果显示二者有显著性差异，治疗组效果优于对照组和对比例1。表3：vas疼痛评级统计表；分组例数术前术后第一天术后一周术后一个月对照组405.67±14.44±0.783.22±1.192.56±1.03实施例1405.73±0.823.36±0.461.82±0.371.18±0.76对比例1405.75±0.894.28±0.592.85±1.022.17±0.82由以上测试结果可以知道，术后2个月后观察结果显示二者有显著性差异，治疗组效果优于对照组和对比例1。表4：术后恢复情况统计表；由以上测试结果可以知道，术后2个月后观察结果显示二者有显著性差异，治疗组效果优于对照组。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12