一种畜禽粪污降解复合菌剂及其应用的制作方法

本发明属于农业微生物领域，公开了一种畜禽粪污降解复合菌剂及其应用。

背景技术：

目前，全国畜禽粪污年产生量约38亿吨。大规模的畜禽粪污，是巨大有机质和养分资源，但如处理不好，将会给环境和居民生活带来严重负面影响。2010年《全国第一次污染源普查公报》显示，畜禽养殖业排放的化学需氧量达到1268.26万吨，占农业源排放总量的96％；总氮和总磷排放量为102.48万吨和16.04万吨，分别占农业源排放总量的38％和56％。目前畜禽粪污处理与资源化利用主要有三种模式，即能源化利用、肥料化利用和工业化处理，其中能源化利用和肥料化利用是主要方向。近年来，我国畜禽养殖废弃物处理和资源化利用工作取得了一些成效，但全面实现畜禽粪污能源化、肥料化利用还面临不少实际困难。目前，将畜禽粪污通过好氧发酵制成有机肥为目前资源化利用畜禽粪污的主要方式之一，但畜禽粪便成分复杂，含蛋白质、脂肪类、有机酸、纤维素、半纤维素以及无机盐等成分组成，目前依靠单一菌种或简单组合的复合菌群降解不充分且速度慢。因此，开发具有高效降解畜禽养殖废弃物功能的微生物复合菌群是目前研究的重点。

复合微生物是由两种及以上的微生物共同组成的群落。复合微生物菌剂相较于单一微生物菌剂更具有优势，能适应复杂环境，功效更强和更全。在实践生产上使用复合菌，能够促进畜禽养殖废弃物的降解，提高企业经济效益和生态环境效益。

技术实现要素：

技术问题本发明目的在于进一步提高畜禽养殖废弃物堆肥效率，开发研制出一种复合菌剂，为畜禽养殖废弃物肥料化产业提供菌群资源及技术支撑。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种微生物组合，其特征在于由保藏号为保藏号为cgmccno.18134的疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)njau-f4-11，保藏号为cgmccno.18019的芽孢杆菌(bacillussp.)njau-n45、保藏号为cgmccno.16737的芽孢杆菌(bacillussp.)njau-nd8和保藏号为cgmccno.14935的嗜热脂肪土芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)b5组成。

发明人筛选在55℃生长的高温菌株，通过断棒理论设计菌群组合32个，连同单菌共38个处理，测定单菌或组合菌降解木质素、纤维素、淀粉与蛋白质的能力，测定各筛选菌株之间的相互关系，将彼此间无拮抗作用且协同降解大分子有机物能力的菌株进行复合，获得优良的复合菌群，即含有梳棉状嗜热丝孢菌njau-f-4-11，芽孢杆菌njau-n45、芽孢杆菌njau-nd8和芽孢杆菌b5的复合菌群。

本发明所述的微生物组合在制备畜禽粪污降解复合菌剂中的应用。

一种畜禽粪污降解复合菌剂，由浓度不低于10⁹个/ml的所述的疏棉状嗜热丝孢菌njau-f4-11菌液与浓度均不低于10⁹cfu/ml的所述的芽孢杆菌njau-n45、所述的芽孢杆菌njau-nd8和所述的芽孢杆菌b5的菌液等体积比混合而成；其中各菌液的浓度相同。

所述的微生物复合菌剂，其生理学特征是：

(1)菌种有效活菌数高，采用液态接种体，浓度都在10⁹个/ml(真菌)或cfu/ml(细菌)以上；

(2)耐高温，能够在55℃高温下生长；

(3)耐盐，能够在含盐15％的培养基中生产；

(4)3株细菌被鉴定为芽孢杆菌属细菌，真菌被鉴定为丝孢菌属真菌，对作物无害，对人和动物无致病性；

(5)外切-β-1、4-葡聚糖酶活力达到13.662u，内切-β-1、4-葡聚糖酶活力达到18.408u，β-葡萄糖苷酶的酶活力达到42.395u，中性木聚糖酶活力达到635.283u，滤纸酶活力达到0.665u，中性蛋白酶活力达到672.070u，α-淀粉酶活力达到0.135u，β-淀粉酶活力达到0.222u，脲酶活力达到30.146u。

所述的畜禽粪污降解复合菌剂的制备方法，包含：将真菌njau-f-4-11接种到pda液体培养基中，在55℃、170rpm条件下培养2天；将菌株芽孢杆菌njau-n45、芽孢杆菌njau-nd8和b5分别接种到lb培养基中，在55℃、170rpm下培养2天；待培养结束后，4℃离心收集菌体，菌体洗涤后，用蒸馏水调节浓度，使细菌浓度在10⁹cfu/ml以上，真菌浓度在10⁹个/ml以上，且使各菌液的浓度都相同；然后按照体积比例1:1:1:1混匀，得到所述的畜禽粪污降解复合菌剂。

其中，细菌通过od值计算浓度、真菌用血球计数板计孢子数量。

称取一定量的畜禽粪便置于250ml三角瓶中，吸取总量相等的各菌液加入三角瓶中，并混合均匀，放入55℃培养箱中培养，15天后，烘干样品称重，以不接菌种时的畜禽粪便作为对照，通过失重法计算畜禽粪便的降解率。

本发明所述的畜禽粪污降解复合菌剂在降解畜禽粪污中的应用。

本发明所述的畜禽粪污降解复合菌剂在以畜禽粪污和秸秆为原料制备有机肥中的应用。

采用本发明所述的畜禽粪污降解复合菌剂生产有机肥的方法，包括以下步骤：

(1)原料混合：将玉米秸秆切碎与新鲜羊粪按照碳氮比＝25：1混合均匀，初始含水率调节至65～70％，接种本发明所述的畜禽粪污降解复合菌剂，接种量为7～10ml/kg，接种后均匀混合堆体材料，再砌成条垛状，堆体基料长宽1～1.2米，高1.5～1.8米，长度不限；

(2)堆肥发酵：有机肥发酵基料按条垛式堆放于发酵棚内后，采用人工翻堆发酵，堆心温度达70℃以上时开始翻堆，2天翻堆1次，共发酵20-22天；

(3)后熟发酵：堆肥发酵结束后后熟堆放6～7天得有机肥。

有益效果

本发明提供一种微生物复合菌剂，用于高效转化畜禽养殖废弃物为有机肥。此微生物复合菌剂含有4种高效降解畜禽粪便的单菌，由1种真菌和3种细菌组成。这些微生物在降解畜禽粪便的过程中的分泌酶具有互补功能且协同作用明显，使畜禽粪便在高温条件下快速充分降解，从而提高养殖粪污转化为有机肥的生产效率，提高企业经济效益和生态环境效益。

使用该复合菌剂对鸡粪进行降解，半个月后鸡粪的降解率达到27％以上，而两菌组合最高降解率只有18％，单菌最高降解率只有11.77％，因此，复合菌的降解效果达到了最优单菌的2倍。

使用该复合菌剂对猪粪进行降解，半个月后猪粪的降解率达到27.85％，而两菌组合最高降解率只有23.4％，单菌最高降解率只有20％，可见复合菌剂对猪粪的降解效果比双菌组合和单菌均要好。

使用该复合菌剂对羊粪进行降解，半个月后羊粪的降解率达到43.03％，而两菌组合最高降解率只有34.12％，单菌最高降解率只有27.66％，可见复合菌剂对羊粪的降解效果比双菌组合和单菌要好。

将筛选出的菌株及复合菌群应用到江苏盐城乾宝牧业有限公司工厂化羊粪腐熟堆肥。羊粪加组合菌处理经过26d堆置，腐熟程度和速度显著优于添加单菌处理和不添加处理。

附图说明

图1为不同菌群组合对鸡粪降解的影响；

图2为不同菌群组合对猪粪降解的影响；

图3为不同菌群组合对羊粪降解的影响；

图4以秸秆和羊粪混合物为堆肥原料的不同处理其余理化性状的变化；

生物材料保藏信息

njau-f4-11，分类命名疏棉状嗜热丝孢菌thermomyceslanuginosus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年6月24日，保藏编号为cgmccno.18134。

njau-n45，分类命名芽孢杆菌bacillussp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年6月24日，保藏编号为cgmccno.18019。

njau-nd8，分类命名芽孢杆菌bacillussp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年11月12日，保藏编号为cgmccno.16737。

b5，分类命名为嗜热脂肪土芽孢杆菌bacillusstearothermophilus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为cgmccno.14935。

具体实施方式

选择南京农业大学资源与环境科学学院分离筛选出的8株高效降解畜禽粪污细菌和真菌，包括4株细菌和4株真菌。4种真菌为njau-f3-2/njau-f4-11/njau-f2-13/njau-f3-5，进一步分别编号为a，b，c和d；4种细菌为njau-n20/b5/njau-nd8/njau-nd45，进一步分别编号为1，2，3和4。

将真菌接种到pda液体培养基中，在55℃、170rpm条件下培养2天；将细菌接种到lb培养基中，在55℃、170rpm下培养2天。待各菌长好后，4℃离心收集菌体，菌体洗涤后，用蒸馏水调节浓度，细菌用无菌水调od值、真菌用血球计数板计孢子数量，使各菌液的浓度都在10⁹个/ml(真菌)或cfu/ml(细菌)，根据断棒理论和随机区组设计设置1个菌、2个菌、4个菌、8个菌的组合，组合菌为中各单菌总数相加与单一菌处理所含孢子或菌落的总数一致。

单菌组合有a,b,c,d,1,2,3,4；两个菌组合有ab,a3,a4,ad,b1,b2,bc,c2,c3,cd,d1,d4,12,14,23,34；四个菌的组合有abd1,ad12,abcd,a123,ac23,acd3,bd24,b134,b234,bc14,cd24,c134；8个菌的组合为abcd1234。

实施例1单菌和复合菌产木质纤维降解酶、淀粉和蛋白质水解酶能力

单菌和组合菌均用酶活试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定与降解木质素、纤维素、淀粉和蛋白质相关的酶活。

(1)β-葡萄糖苷酶(β-gc)活力测定

β-葡萄糖苷酶分解对-硝基苯-β-d-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-葡萄糖苷酶活力。

β-gc(nmol/min/ml)＝(△a+0.0027)÷0.00543×v反总÷v样÷t＝61.39×(△a+0.0027)

(2)外切-β-1，4-葡聚糖酶(c1)活力测定采用3,5-二硝基水杨酸法测定外切-β-1，4-葡聚糖酶催化微晶纤维素降解产生的还原糖的含量。

c1(ug/min/ml)＝1000×(△a+0.0673)÷6.4078×v反总÷v样÷t＝14.305×(△a+0.0673)

(3)内切-β-1，4-葡聚糖酶(cx)活力测定采用3,5-二硝基水杨酸法测定内切-β-1，4-葡聚糖酶催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。

cx(ug/min/ml)＝1000×(△a+0.0673)÷6.4078×v反总÷v样÷t＝14.305×(△a+0.0673)

(4)滤纸酶(fpa)活力测定滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物，在540nm处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比，可测定计算滤纸酶的活力。

fpa(u/ml)＝(△a+0.0255)÷0.2805×v反总÷v样÷t＝0.416×(△a+0.0255)

(5)中性木聚糖酶(nex)活力测定

nex在中性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，在沸水浴条件下进一步与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在540nm处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在540nm吸光值增加速率，可计算nex活力。

nex(nmol/min/ml)＝(△a－0.00058)÷1.6904÷150÷t×106＝657×(△a－0.00058)

(6)α-淀粉酶(α-al)和β-淀粉酶(β-al)活力测定

还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。根据上诉特性，钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。

α-淀粉酶(mg/min/ml)＝(△a+0.1778)÷3.7215×v反总÷v样÷t＝0.1075×(△a+0.1778)总淀粉酶(mg/min/ml)＝5×(△a+0.1778)÷3.7215×v反总÷v样÷t＝0.5375×(△a0+0.1778)

β-淀粉酶(mg/min/ml)＝总淀粉酶活性－α-淀粉酶活性

(7)中性蛋白酶(np)活力测定中性条件下，np催化酪蛋白水解酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝，在680nm有特征吸收峰。

np(nmol/min/ml)＝c标准品×△a÷△a标准品×v反总÷v1÷t＝125×△a÷△a标准品

(8)脲酶(ue)活力测定

采用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的nh3-n。

ue(ug/min/ml)＝(△a－0.0373)÷0.0915×10×v反总÷v样÷t＝(△a－0.0373)×27.32

注：v反总：反应体系总体积；v样：加入反应体系中样本体积；v1加入反应体系中粗酶液体积；t：反应时间；△a：测定组与对照组的吸光值差；△a0：总淀粉酶测定组与对照组的吸光值差；c标准品：0.25μmol/ml标准酪氨酸溶液

结果与分析

不同高温菌株单菌及组合菌在55℃下的酶活如表1所示。在所有的菌种组合中，组合菌多样性越高，对木质素、纤维素、淀粉与蛋白质的降解能力越强，并且要强于其组成单菌酶活。在所有的组合菌处理中，b+2+3+4(njau-f4-11+b5+njau-nd8+njau-n45)组合的酶活普遍高于任意两个菌的组合、其他四个菌的组合和八个菌的组合，并且高于组合成复合菌的所有单菌。表明在所有的菌种组合中，含有njau-f4-11+b5+njau-nd8+njau-n45的复合菌对淀粉、中性蛋白质、木质素、纤维素、尿素的水解能力效果最优。

表1不同高温菌株单菌及组合菌在55℃下的酶活

注:β-gc表示β-葡萄糖苷酶,c1表示外切-β-1,4葡聚糖酶,cx表示内切-β-1,4葡聚糖酶,fpa表示滤纸酶,nex表示中性木聚糖酶,α-al表示α-淀粉酶,β-al表示β-淀粉酶,np表示中性蛋白酶,ue表示脲酶.

实施例2单菌和复合菌对鸡粪的降解效果

称取一定量的鸡粪置于250ml三角瓶中，吸取总量相等的各菌液加入三角瓶中，并混合均匀，放入55度培养箱中培养，15天后，烘干样品称重，以不接菌种时的鸡粪作为对照，通过失重法计算鸡粪降解率。

结果与分析

不同菌群组合对鸡粪的降解影响如图1所示。在所有单菌处理中，2号菌(b5)对鸡粪的降解率最高，为17.66％。在两菌组合中，2号菌和3号菌的组合(b5+njau-nd8)降解率最高，为24.12％。在4菌组合中，真菌b与2号菌、3号菌和4号菌的组合(njau-f4-11+njau-nd8+njau-n45+b5)降解率最高为，37.05％。4个菌的最优组合对鸡粪的降解率明显大于两菌及单菌处理。另外，8个菌的组合降解率为35.32％，空白组降解2.11％。

根据室内鸡粪降解结果，由含有njau-f4-11+njau-nd8+njau-n45+b5的复合菌对鸡粪的降解效果最优。

实施例3单菌和复合菌对猪粪的降解效果

将鸡粪换成猪粪，其余操作步骤与实施例2相同。

结果与分析

不同菌群组合对猪粪的降解影响如图2所示。在所有单菌处理中，2号菌(b5)对猪粪的降解率最高，为11.37％。在两菌组合中，真菌b和2号菌的组合(njau-f4-11+b5)降解率最高，为23.80％。在4菌组合中，真菌b与2号菌、3号菌和4号菌的组合(njau-f4-11+njau-nd8+njau-n45+b5)降解率最高为，34.11％。4个菌的最优组合对鸡粪的降解率明显大于两菌及单菌处理。另外，8个菌的组合降解率为30.28％，空白组降解3.57％。

根据室内猪粪降解结果，由含有njau-f4-11+njau-nd8+njau-n45+b5的复合菌群对猪粪的降解效果最优。

实施例4单菌和复合菌对羊粪的降解效果

将鸡粪换成羊粪，其余操作步骤与案例2相同。

实施例结果与分析

不同菌群组合对羊粪的降解影响如图3所示。在所有单菌处理中，2号菌(b5)对羊粪的降解率最高，为27.66％。在两菌组合中，2号菌和3号菌的组合(b5+njau-nd8)降解率最高，为34.12％。在4菌组合中，真菌b与2号菌、3号菌和4号菌的组合(njau-f4-11+njau-nd8+njau-n45+b5)降解率最高为，43.03％。4个菌的最优组合对鸡粪的降解率明显大于两菌及单菌处理。另外，8个菌的组合降解率为41.32％，空白组降解7.09％。

根据室内羊粪降解结果，由含有njau-f4-11+njau-nd8+njau-n45+b5的复合菌群对羊粪的降解效果最优。

实施例5功能菌在秸秆羊粪混合原料堆肥中的应用

将筛选出的最优单菌b5和njau-f4-11+njau-nd8+njau-n45+b5复合菌剂于江苏盐城乾宝牧业有限公司肥料厂，接种与纯秸秆与羊粪混合原料进行堆肥，试验共设计3个处理：羊粪+秸秆+组合菌，羊粪+秸秆+单菌和羊粪+秸秆，分别标记为y3，y2和y1。

试验流程

1、原料准备：于室外堆场将玉米秸秆切碎用铲车将其与新鲜羊粪按照堆体c/n值25：1配比混合均匀，混合后堆料初始含水量约68％左右。

2、配料：将高效单菌及组合菌群按照1％比例加入堆肥处理中，此时堆肥含水量为68％左右，彼此间相差不大；

3、布料：用铲车将混合料转运至发酵仓进行条式发酵，布料完成后，采集样品两份，一份自然风干，一份鲜样保存于-80℃冰箱内；(采样方法：采用五点采样法，与堆肥四个方向和中间位置采集等量样品混合均匀)

4、翻堆：每隔2天翻堆一次，每2次翻堆结束后，采集两份样品；

5、记录：每天早晚记录堆体温度及室温，温度记录为早上11:00和下午17:00；

6、堆肥结束：堆肥进行20天后，最后一次采集样品，共采集样品6次后，停止翻堆，使堆肥进入后熟发酵阶段；

7、后熟处理：后熟堆放6天后，第7次采集样品后，发酵结束。

8、检测：按照ny525-2012标准检测堆肥样品，鲜样检测含水量、ph等指标；风干样用于检测有机质、n、p、k等指标；

结果与分析

以秸秆和羊粪混合物为堆肥原料的不同处理养分含量变化如表2和图4所示。相比于不加菌和加单菌处理，添加复合菌堆体y3在堆肥过程中，升温最快，高温期最高温度可达到75.5℃；添加复合菌堆体y3在堆肥过程中含水量下降最快，在堆肥结束时含水量为33.08％，相比于不加菌处理，在堆肥结束时下降了7.99％；三个堆体的ph变化趋势大致相同，在堆肥结束时，不加菌和加单菌处理堆体ph都大于8.5，添加复合菌堆体y3的ph为8.41，小于8.5，符合国家标准ny525-2012；y3堆体发芽指数在堆肥结束时为75.8％，大于单菌和不加菌处理，腐熟效果最好，有机质含量在堆肥结束时为45.17％，大于45％，符合国家标准ny525-2012；相比于不加菌和加单菌处理，添加复合菌堆体y3在堆肥结束时肥料中氮磷钾指标均为最高，分别为1.64％、1.54％和3.24％，且氮磷钾之和为6.42％，相比于不加菌处理，增加了0.35％，且大于5％，符合国家标准ny525-2012。

根据实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5，说明含有复合菌群(njau-f4-11+njau-nd8+njau-n45+b5)的菌剂对畜禽粪污的腐熟效果较好，能促进畜禽废弃物的降解，提高企业经济效益和生态环境效益。

表2以秸秆和羊粪混合物为堆肥原料的不同处理养分含量变化