小球藻内生菌的编码基因及其扩增用特异性引物的制作方法

本发明涉及一种球藻培养用菌种，特别涉及一种小球藻内生菌的编码基因及其扩增用特异性引物，属于生物技术领域。

背景技术：

植物内生菌是一种新型的，可持续发展的微生物资源，具有广泛的应用前景。距kloepper第一次提出“植物内生菌”的概念到目前为止，国内外关于植物内生菌的研究已有一百多年的历史，但由于其未表现出明显的外在特征和相应作用，导致该微生物类群长期被人们所忽视。直至二十世纪末，stierle等在短叶红豆杉组织内部分离筛选得到一株可产紫杉醇的植物内生真菌，该项研究才得以重视和深入开展，并进而成为国内外研究热点。研究者根据不同的研究目的从各个角度探索植物内生菌的意义，极大地促进了植物内生菌多样性的研究，丰富了其内涵，为后续研究提供了宝贵的参考意见。

小球藻中含有丰富的蛋白质、食物纤维、叶绿素等营养素，可以促进和维持人体健康，目前已作为保健品出现在市场上。同时现如今微藻已经被研究者公认为是优质的生物柴油原料之一，藻类的产油速率也要明显高于目前市场上常用的油料作物。因此微藻作为第三代生物燃料原料的开发利用也日益增长。小球藻最早被利用的性质是其高含量的蛋白，蛋白质含量可达64.60％，可广泛应用于疾病辅助治疗、食品添加剂、保健美容等领域。因而提高小球藻生长指标是开发应用小球藻的关键。

已有研究表明，许多微生物都能存活于植物组织内，并与植物建立良好的共生关系，且大多数都能促进植物的生长。植物内生菌可通过产生植物生长激素类物质来发挥其促生作用，这些植物生长调节激素主要包括植物生长素、赤霉素、玉米素以及细胞激动素等，能直接促进植物的生长。蔡学清等研究发现内生菌bs-2对辣椒苗具有明显的促生作用，经该菌株处理后，宿主植物体的植物生长调节激素如iaa、ga3等含量增加，从而促进辣椒苗的生长，提高辣椒的产量。易有金等利用内生枯草芽孢杆菌b-001对烟草幼苗进行温室盆栽试验，在内源激素检测过程中发现烟草中赤霉素、玉米素核苷和吲哚乙酸的含量增加，促进了烟草幼苗的生长。研究发现，采用细菌与微藻共培养不仅可以使藻细胞生长量提高30％-300％，还能显著增加小球藻的生长指标，比如提高藻粉含量，提高藻细胞叶绿素a,b和类胡萝卜素等色素含量，增加产油量，大幅降低传统培养的成本。在此背景下，寻找新的微生物资源用于改良菌藻共培养技术具有巨大前景。植物体是一个复杂的微生态系统，健康植物体内含有大量的内生菌，这些植物内生菌是能够定殖在植物体内，与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物，它们可以促进寄主植物的生长，使植物保持良好的生长状态，提高植物自身的抗病能力。探索内生菌对其原始宿主小球藻的促生作用，对小球藻规模化生产意义重大。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种小球藻内生菌的编码基因。

本发明的另一个目的是提供上述小球藻内生菌的扩增用特异性引物。

本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：

一种编码所述小球藻内生菌的基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。该小球藻内生菌是细杆菌属细菌(microbacteriumsaccharophilum)的菌株s395-2，该菌株于2018年7月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为cgmccno.16182，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述的小球藻内生菌在促进小球藻生长方面的应用。

扩增所述小球藻内生菌的基因采用的特异性引物，所述的特异性引物为：

7f1540r：5’cagagtttgatcctggctaggaggtgatccagccgca3’，其核苷酸序列如seqidno.2所示，

27f1492r：5’agtttgatcmtggctcagggttaccttgttacgactt3’，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明以小球藻(chlorellasp.)为研究对象，从小球藻中分离纯化获得优势内生菌，进行分类鉴定后，通过人工构建小球藻和小球藻内生菌的共生体系，研究了菌藻共生体系中内生菌对小球藻的促生长效果，同时探索开发了植物内生菌作为促进微藻生长和改善微藻生化品质的新微生物资源的可行性。

发明人从实验室培养的小球藻液中分离纯化得到内生菌s395-2，外观为黄色，圆形菌落，质地粘稠湿润，菌落分布较为独立。通过染色与分子鉴定，其属于细杆菌属假单胞菌，g⁺菌。菌藻细胞浓度比为10：1时，内生菌s395-2可以有效促进小球藻的生长效率，不同梯度下小球藻干重为a>空白组>b>c(a为菌藻细胞浓度比10：1，b为菌藻细胞浓度比1：1，c为菌藻细胞浓度比1：10)。在培养至第6天时，小球藻内生菌开始明显促进小球藻生长，第10天时，生长速率开始减慢，在培养至第12天时叶绿素a和类胡萝卜素总含量对比空白对照组达最大差值，a组菌藻共培养体系的色素总含量比对照组增加了33.3％，b，c组对小球藻促生长效果不明显，说明促生长效果与菌藻比例有一定的相关性。

共培养体系中，小球藻内生菌s395-2与小球藻存在明显的互作效应，在一定限度内，小球藻内生菌浓度越高，促生长效果越明显；浓度较低时，有个别出现生长速率降低，但都在误差范围内，无明显抑制作用。在加大共培养体积后可以更加显著提高小球藻的生物量和叶绿素a、类胡萝卜素含量，提高小球藻的生长速率。小球藻内生菌s395-2能够作为促进微藻生长和改善微藻生长品质的新微生物资源。

附图说明

图1是内生菌s395-2革兰氏染色镜检图；

图2是内生菌s395-2凝胶电泳图；

图3是小球藻内生菌s395-2的16srdna序列系统进化树；

图4是小球藻内生菌细胞数与od值的标准曲线；

图5是小球藻细胞数与od值的标准曲线；

图6是不同梯度下小球藻干重图；

图7是菌藻共培养生物量测定图；

图8是不同梯度下小球藻生物量变化曲线；

图9是培养液中叶绿素a含量变化曲线；

图10是培养液中类胡萝卜素含量变化曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例小球藻内生菌的分离纯化及鉴定

1实验材料

实验样品取自实验室小球藻液，藻液于智能光照培养箱中培养，光照强度2000lux，温度37±1℃。

细菌培养基实验采用lb培养基主要组分见表1：

表11lb培养基主要试剂表

待溶剂溶解后(固体培养基加入琼脂15.0g)，蒸馏水定容至1l,用1mol/lnaoh将ph调至7.6左右，250ml锥形瓶封装，高压下灭菌20min，备用。

2实验方法

2.1小球藻内生菌的筛选、分离和纯化

1)倒平板

将事先灭菌的固体lb培养基加热溶化，每个培养皿中倒入约25mllb培养液后冷却凝固待用。

2)从小球藻中提取出内生菌(无菌操作)

a取一瓶长势较好的小球藻摇匀，用移液枪吸取藻液至45ml离心管(共8管)进行离心(4000rpm离心10min)。

b将上清液倒掉，每4管合成一管，用无菌水清洗沉淀物再离心(重复三次)，排除藻液体中的细菌。

c三次后取出沉淀物(加少量无菌水)分别进行轻、中、重三种程度的研磨(研锅研棒事先灭菌)。

d取20ul研磨物(轻度研磨)倒入已凝固的lb培养皿中，用三角涂布棒涂均匀，做好标记(中、重研磨物处理同上)。每种研磨程度设置三个平行组。

e放入28±1℃黑暗培养箱培养24-48h。

补充：对原小球藻液进行划线，起对比和排除杂菌的作用。

3)平板划线

a培养24-48h后(根据菌种长势状况)，用接种灭菌环取培养基中长势较好菌落进行划线，不同研磨程度的小球藻内生菌各划线3次。

b放入28±1℃黑暗培养箱中倒置培养24-48h。

4)挑取单菌落

良好的结果一般出现在c区，从形态特征明显的，典型的单菌落中挑取少量菌体至lb固体培养基中，经培养后即为初步分离的小球藻内生菌纯种。

对其进行下一步的鉴定。

2.2菌株的保藏

本次实验采用甘油保藏：

a将分离的纯种菌种在lb液体培养基中摇瓶培养至对数生长期(肉眼见培养基体系内浑浊即可)。

b将甘油稀释至浓度为50％(等体积蒸馏水加等体积甘油，甘油需要慢慢吸)。

c将稀释的甘油，2ml离心管，枪头等实验用品于121℃灭菌20min。

d无菌条件下将小球藻内生菌菌液与50％浓度甘油1：1等体积混合于离心管中，甘油终浓度为25％。

e做好标注，于-76℃冰箱保存。

2.3内生细菌的鉴定

2.3.1内生细菌形态的观察

经培养后的纯种内生菌株，肉眼观察其形态，大小，颜色等，并拍照记录。

2.3.2革兰氏染色观察

在干净的载玻片中央滴一滴无菌水，挑取少量纯种小球藻内生菌与水滴混合，涂成薄的菌膜，涂片在空气中干燥后，酒精灯上过火三次，待冷却后滴加染料。经初染—媒染—脱色—复染后镜检观察，拍照记录。

2.3.3小球藻内生菌16srdna分子鉴定

将保藏的菌种活化传代1-2代，增强菌种活性，纯化产物后进行测序，利用引物7f1540r5’-cagagtttgatcctggctaggaggtgatccagccgca-3’(核苷酸序列为seqidno.2)和27f1492r5’-agtttgatcmtggctcagggttaccttgttacgactt-3’(核苷酸序列为seqidno.3)进行pcr扩增(pcr反应体系见表2)，再进行pcr反应和循环后[96℃1min→(96℃10sec→50℃5sec→60℃4min)x25个循环→4℃保温]，进行凝胶电泳，1％琼脂糖电泳，150v、100ma20min电泳观察，对产物进行测序。

表2pcr标准反应体系

2.4结果和分析

2.4.3小球藻内生菌分离纯化和形态学鉴定

小球藻内生菌形态学鉴定从菌落形态学上分析，lb培养基上有白色和黄色两种菌种，最开始大部分都是白色菌株，后期黄色菌株逐渐增多，成为优势生长菌。对比小球藻原藻液涂布情况，这两种细菌都是小球藻内生菌。白色菌落编号s395-1(在本发明中不做讨论),黄色菌落编号为s395-2。经多次划线纯化后，可观察到的结果见表3。

表3内生菌的形态学观察记录表

革兰氏染色后经显微镜观察(见图1)内生菌s395-2呈紫色粗箭头状，是革兰氏阳性菌。

2.4.4内生细菌s395-1和s395-2的16srdna序列测定与系统进化树分析

内生菌s395-2的凝胶电泳图见图2。

s395-2测序结果该细菌序列长度约为1471bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

将s395-2细菌的序列在核糖体数据库(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)进行比对，同时构建系统进化树(见图3)。结果表明：s395-2菌株与microbacteriumsp.的16srdna序列同源性达99％，可鉴定为细杆菌属。

实施例小球藻内生菌对小球藻促生长应用

1实验试剂

(1)菌种：小球藻内生菌藻液：小球藻藻液

(2)培养基：lb液体培养基

(3)bg11配方见表4(1000ml为例)

250ml锥形瓶分装，密封，在121℃台式压力灭菌锅中灭菌，冷却备用。

表4bg11液体培养基配方(1l)

用1m的naoh或hcl溶液调节体系ph到7.1。

2实验方法

2.1测定小球藻内生菌细胞数与od值的标准曲线

(1)菌种的培养：无菌操作移取1环小球藻内生菌单菌落，接入液体lb培养基中，静置过夜。(2)分装培养液：无菌操作。(3)校正零点：用未接入菌液的培养液选用波长为600nm来校正零点。(4)接种：菌液接种量为10％左右。(5)测零时的od值：测定刚接入种子液后的od值。(6)震荡培养。(7)生长量测定：每隔1.5h测定od值和细胞数。(8)清洗。(9)绘制小球藻内生菌细胞数与od值的标准曲线。同理测定小球藻细胞数与od值的标准曲线。

2.2小球藻与内生菌共培养

将内生细菌接种于lb液体培养基，置于恒温摇床中37℃，230rpm黑暗培养，测定od600nm＝0.6左右，根据生长曲线，菌株生长处于对数期，此时菌液浓度约为1.26×10⁸cells/ml。取2管45ml菌液于室温4000rpm离心15min，沉淀用无菌水洗涤3次，再离心10min收集菌体细胞，用45mlbg11液体培养基悬浮备用。接种不同浓度比例的菌藻共培养体系，分别是菌藻(s395-2与小球藻)细胞浓度比10：1，1：1，1：10三种浓度梯度。此为菌藻共培养试验组，同时设纯藻培养为对照组，每组试验设置3个平行。菌藻培养液于智能光照培养箱中培养，光照强度2000lux，温度37±1℃，每天早上8:00，中午12：00，晚上6：00分别摇动一次。

2.3小球藻生物量的测定

利用干重法测定小球藻的生物量。实验共设置4组培养液，无菌操作分别用移液枪移取每一瓶锥形瓶的培养液3ml,做好标记，进行离心，8000rpm，10min。倒出上清液，60℃真空干燥，称重。

2.4小球藻叶绿素a和类胡萝卜素提取及含量测定

利用超声波提取法：

(1)每一瓶锥形瓶中取4ml培养液，加入乙醇提取剂4ml，再放入超声波清洗器中，超声30min后放入离心机8000rpm离心10min，取上清液分别在470nm、645nm、663nm处测量其吸光度并记录。

(2)根据叶绿素a计算公式计算叶绿素a的含ca＝0.0127a663-0.00269a645，计算类胡萝卜素浓度cb＝0.0229a645-0.00468a663，类胡萝卜素浓度＝(1000a470-3.27ca-104cb)/229。

3结果和分析

本次实验主要研究s395-2小球藻内生菌对小球藻的促生长效果。

3.1小球藻内生菌生长曲线

小球藻内生菌细胞数与od值的标准曲线如图4所示，小球藻内生菌细胞数与od值基本呈正比。

3.2小球藻生长曲线

小球藻细胞数与od值的标准曲线如图5所示，小球藻细胞数与od值基本呈正比。

3.3小球藻生物量测定

取培养液3ml，测定小球藻在不同浓度下的干重变化，a为菌藻细胞浓度比10：1，b为菌藻细胞浓度比1：1，c为菌藻细胞浓度比1：10。从表5中可以分析出小球藻干重对比为a>空白组>b>c。而空白组与b，c组差异不大，在误差范围内，既无明显促生作用，也无明显抑制作用。不同梯度下小球藻干重图见图6，不同梯度下小球藻干重变化见表5，菌共培养生物量测定图见图7，不同梯度下小球藻生物量变化曲线见图8。

表5不同梯度下小球藻干重变化

根据实验结果可知，当菌藻浓度比为10：1时可以增加小球藻的生物量，菌藻浓度比为1：1或1:10时促生长效果与空白组差异不大，在误差范围内，第14天时，空白组与a，b组干重含量基本一致，无抑制作用。

3.4小球藻内生菌对小球藻叶绿素a和类胡萝卜素含量的影响

比较菌藻共培养组和纯藻培养对照组培养液中叶绿素a和类胡萝卜含量的变化情况，结果见图9、图10。从第2—14天，培养液中叶绿素a和类胡萝卜2种色素含量逐渐增加，这与藻细胞的持续增长一致。菌藻共培养组培养液菌藻比例为10：1中叶绿素a和类胡萝卜素含量略高于对照组，总体上二者差异不显著，在培养至第6天时，小球藻内生菌开始明显促进小球藻生长，第10天时，生长速率开始减慢，其中在培养至第12天时为含量最大相差值，a组菌藻共培养体系的色素总含量比对照组增加了33.3％，差异极显著。实验结果表明当小球藻内生菌与藻液浓度为10：1时可以明显增加藻中叶绿素的含量，菌藻浓度比为1：1或1:10时促生长效果较弱，基本与空白组一样。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110>嘉兴学院

<120>小球藻内生菌的编码基因及其扩增用特异性引物

<130>jxxy-ssq002

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1471

<212>dna

<213>小球藻内生菌基因(microbacteriumsaccharophilum)

<400>1

tggctcaggatgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacggtgaaagagag60

cttgctctctggatcagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagcaacctgccccggactc120

tgggataacagctggaaacagctgctaataccggatacgagctgcgaaggcatcttcagc180

agctggaaagaatttcggtccgggatgggctcgcggcctatcagctagttggtgaggtaa240

tggctcaccaaggcgtcgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacactgggact300

gagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaa360

gcctgatgcagcaacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctcttttagc420

agggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaaaaagcgccggctaactacgtgccagca480

gccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagagctcgta540

ggcggtttgtcgcgtctgctgtgaaaacccgaggctcaacctcgggcctgcagtgggtac600

gggcagactagagtgcggtaggggagattggaattcctggtgtagcggtggaatgcgcag660

atatcaggaggaacaccgatggcgaaggcagatctctgggccgtaactgacgctgaggag720

cgaaagggtggggagcaaacaggcttagataccctggtagtccaccccgtaaacgttggg780

aactagttgtggggtccattccacggattccgtgacgcagctaacgcattaagttccccg840

cctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcg900

gcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatatac960

gagaacgggccagaaatggtcaactctttggacactcgtaaacaggtggtgcatggttgt1020

cgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgttcta1080

tgttgccagcacgtaatggtgggaactcatgggatactgccggggtcaactcggaggaag1140

gtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcttgggcttcacgcatgctacaatg1200

gccggtacaaagggctgcaataccgcaaggtggagcgaatcccaaaaagccggtcccagt1260

tcggattgaggtctgcaactcgacctcatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcag1320

caacgctgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcaagtcatgaaagt1380

cggtaacacctgaagccggtggcccaacccttgtggagggagccgtcgaaggtgggatcg1440

gtaattaggactaagtcgtaacaaggtagcc1471

<210>2

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(7f1540r)

<400>2

cagagtttgatcctggctaggaggtgatccagccgca37

<210>3

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(27f1492r)

<400>3

agtttgatcmtggctcagggttaccttgttacgactt37