一种与鸡绿壳蛋蛋壳颜色深浅相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与鸡绿壳蛋蛋壳颜色深浅相关的snp分子标记及其应用。

背景技术：

我国地方鸡遗传资源丰富，产绿壳蛋的鸡包括东乡绿壳蛋鸡、长顺绿壳蛋鸡等，绿壳蛋的颜色是一个质量性状，受基因slco1b3上游一段eav-hp序列插入的影响，为显性基因，当基因型为oo或oo时蛋壳颜色为绿色，生产中常通过基因检测纯合型的基因选育纯种绿壳。

随着人们生活水平的提高，地方特色蛋鸡的市场份额越来越多，绿壳蛋鸡作为我国地方特色蛋鸡发展越来越好。绿壳蛋的售价较高，可以为养殖者带来较高的经济效益。在育种过程中受消费导向的影响，绿壳蛋的选育倾向于深绿色。然而目前对绿壳蛋蛋壳颜色的深浅尚无有效选育方法，仍旧多采用人工选育，在继代选育过程中通过育种人员的主观判断选择，采用先留后选的原则，遗传进展缓慢、世代间隔长、成本较高，不同育种人员的选择标准不一致，从而影响选育的准确性。随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择方法(markerassistedselection,mas)被越来越多地应用于育种环节中加快了遗传进展。诸多研究表明，蛋壳颜色是一个中高遗传力性状，如果进行稳定选择则会获得良好进展。利用分子标记技术将会对该性状进行准确选择，从而改善绿壳蛋鸡蛋壳颜色的选育方法，加快选育进程，促进我国特色地方蛋鸡的发展。

技术实现要素：

为了解决目前绿壳蛋性状选育过程中存在的问题，发明人进行了大量研究，意外地发现国际鸡参考基因组grcg6aprimaryassembly版本第1号染色体上物理位置第64135653核苷酸处的c>g突变与鸡绿壳蛋蛋壳颜色深浅相关，从而完成本发明。

本发明第一方面提供一种与鸡绿壳蛋蛋壳颜色深浅相关的snp分子标记，所述snp分子标记的snp位点位于国际鸡参考基因组grcg6aprimaryassembly版本第1号染色体第64135653位，且该处碱基是c或g。

本发明第二方面提供一种与鸡绿壳蛋蛋壳颜色深浅相关的snp分子标记，所述snp分子标记的snp位点位于鸡pik3c2g基因第238898位，且该处碱基是c或g。

本发明第三方面提供一种与鸡绿壳蛋蛋壳颜色深浅相关的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记的核苷酸序列如seqidno.3所示，且其第140位碱基是c或g。

本发明第四方面提供检测本发明第一方面、第二方面或第三方面所述的snp分子标记的试剂在制备用于鉴定鸡绿壳蛋蛋壳颜色深浅的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述分子标记的引物组合。

在本发明的一些实施方案中，所述引物组合由具有seqidno.1所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno.2所示核苷酸序列的下游引物组成。

本发明的第五方面提供一种用于鉴定鸡绿壳蛋蛋壳颜色深浅的试剂盒，包括能够检测本发明第一方面、第二方面或第三方面所述的snp分子标记的试剂。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述分子标记的引物组合。

在本发明的一些实施方案中，所述引物组合由具有seqidno.1所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno.2所示核苷酸序列的下游引物组成。

本发明的第六方面提供一种选育能够产深色绿壳蛋的鸡种或品系的方法，包括以下步骤：

(1)获取待测鸡种或品系个体的基因组dna；

(2)检测所述基因组dna中本发明第一方面或第二方面或第三方面所述snp分子标记的基因型，

选择gg基因型个体，淘汰cc和cg基因型个体。

在本发明的一些实施方案中，步骤(2)中利用引物组合检测所述snp分子标记的基因型。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括具有seqidno.1所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno.2所示核苷酸序列的下游引物组成。

在本发明中，gg基因型蛋壳颜色以l、a、b色度系统表示时，a值和b值更小，表现为更绿、更蓝；而cc和cg基因型蛋壳颜色a值和b值更大。

在本发明的一些实施方案中，当绿壳蛋蛋壳颜色的a值和/或b值小于参考值，表明该鸡蛋为深色绿壳蛋或蛋壳颜色更深。在本发明的一些优选实施方案中，相应参数的参考值是指特定鸡种或品系大量样本绿壳蛋蛋壳颜色的对应参数的平均值或中位值，在本发明的一些更优选实施方案中，所述大量样本是指具有统计学意义数量的样本。在本发明的另一些更优选实施方案中，所述大量样本是指50只、100只、200只、500只、1000只、10000只或更多。在本发明的一些具体实施方案中，所述大量样本是指1075只。

本发明的有益效果

本发明相对于现有的绿壳蛋蛋壳颜色选育技术具有如下的优势和效果：

(1)利用本发明提供的snp分子标记进行分子标记辅助选择时，能够有效地使绿壳蛋蛋壳颜色变得更绿；

(2)本发明同时提供了该snp分子标记的序列以及鉴定的引物，通过该分子标记和引物，可利用sanger测序法建立快速高效准确的分子标记辅助育育种技术，使绿壳蛋蛋壳颜色变得更绿，可在早期进行选育，降低饲养成本，提高生产效益；

(3)本发明提供的snp分子标记对绿壳蛋蛋壳颜色的表型效应均在5％以上，最高的效应为15.91％，利用该snp分子标记可有效提高绿壳蛋蛋壳颜色的遗传进展，达到快速选育目的。

附图说明

图1示出了由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的f2代资源群体关于绿壳蛋蛋壳颜色的全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy,gwas)曼哈顿图；其中横坐标代表鸡的染色体编号；纵坐标代表-logp值，黑色水平线代表以8.43×10^-7为显著性表达水平阈值。

图2示出了以snp分子标记rs312347405的基因型加入协变量模型进行的条件分析。

图3示出了不同基因型的绿壳蛋在不同周龄下的蛋壳颜色值。

图4示出了不同基因型的测序图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店可购买到的。

下述实施例1中，利用由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的f2代资源群体母鸡，其中1075只产绿壳蛋，利用美能达cm-2300d分光测色剂进行蛋壳颜色的测定。主要对32周龄蛋壳颜色表型值进行测定，以l、a、b色度系统表示；a为红、绿色品，+a为红色方向，－a为绿色方向；b为黄、蓝色品，+b为黄色方向，－b为蓝色方向。试验观测a值和b值的变化。试验在江苏省家禽科学研究所邵伯试验基地进行，所有母鸡整个饲养时期环境、营养条件均一致。

实施例1全基因组关联分析

(1)采集f2代群体母鸡翅静脉血，利用标准的酚-氯仿法进行基因组dna提取。通过标准的程序进行dna质量检测、浓度测定等，最终选择以od260/280比值在1.8-2.0之间为合格以备后续试验。统一将浓度稀释为50ng/ul用于基因分型。

(2)利用affymetrix公司的鸡600k高密度基因芯片进行基因分型，参照芯片说明书进行基因分型和质量控制，主要包括：利用aptv1.16.0进行分型前的质量控制；plinkv1.90进行质量控制，剔除callrate小于0.97，偏离哈代温伯格平衡≤10^-6的snp标记；beaglev4.0选择r²>0.5的snps进行填充。质控剩余了435867个snps和1075个样本用于后续分析。

(3)全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy,gwas)方法：进行gwas分析之前为了消除假阳性，计算多维度主成分分析，以前5个主成分作为协变量加入到模型中。利用r脚本“simplem”方法计算各snps位点独立检验估计，得到了59308个indepsnps。利用bonferroni进行校正，得到基因组显著水平为8.43×10^-7。利用gemmav0.94软件中多变量混合线性模型对l、a和b同时进行gwas分析，模型为：其中y^*代表n个样本d个表型值的矩阵；w代表协方差矩阵(在本实施例中代表前5个主成分)；α^*代表对应系数包括截距的向量；x标记的基因型的n个样本的向量；β^*代表标记的替代效应；z代表的随机效应相关矩阵，zd代表第d个性状的随机效应关联矩阵；μ^*代表随机效应；ε^*代表误差效应；i代表单位矩阵。

gwas分析的结果如图1所示，最显著的snp分子标记为位于1号染色体的rs312347405，p＝1.61×10-126；由于显著关联区域可能是由连锁造成，以rs312347405的基因型作为协变量加入到gwas分析模型中进行条件分析，如图2所示，经条件分析后，原先显著的点均不显著。

(4)不同基因型的绿壳蛋蛋壳颜色表型值由图3所示：gg基因型的蛋壳颜色表型值表现为a值和b值更小，总体表现为颜色更绿、更蓝。因此在继代选育过程中选留gg基因型的个体，淘汰cc和cg型的个体。

实施例2绿壳蛋蛋壳颜色深浅等位基因检测方法的建立

(1)对与绿壳蛋蛋壳颜色显著相关的snp标记位点的目的片段引物扩增基因pik3c2g基因中一段237bp的核苷酸片段，序列扩增的上下游引物为：

上游引物green-f：ctgatttctctggctcctgg(seqidno.1)

下游引物green-r：tgcttctggagattgctgtg(seqidno.2)

(2)pcr扩增：

本实施例中试剂是南京诺维赞公司获得，引物合成及测序由上海生工公司完成。

以东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡杂交产生的产绿壳蛋的个体进行选育3个世代后的l3品系基因组dna为模板，使用引物green-f和green-r进行pcr扩增。

扩增体系如下：

pcr反应程序如下：

(3)序列测序与鉴定

pcr扩增的产物green_seq在上海生工公司进行sanger测序，基因片段进行正反两个反应。将所得序列与鸡的参考基因组grcg6aprimaryassembly进行比对，得出对应的snp标记位点突变。

pcr扩增产物green_seq如下所示(seqidno.3)：

注：序列中标注的s为突变位点，用加粗并标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，序列的首尾加粗显示为引物序列。

(4)对测序得到的序列利用chromas软件进行碱基比对，在140位碱基是c或g，判定不同个体的基因型，如图4所示。

实施例3分子标记snprs312347405c>g突变的效应分析

本发明提供的一个改善绿壳蛋蛋壳颜色的snp分子标记，对32周龄a值和b值的效应分别为14.98％和38.14％，对其余各时期蛋壳颜色的效应值也均在5％以上。利用所述snp标记进行分子标记进行辅助选择，能够显著加深绿壳蛋蛋壳颜色，加快绿壳蛋鸡蛋壳颜色选育进程。

表1snp标记对各周龄绿壳蛋蛋壳颜色的效应分析

％

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>江苏省家禽科学研究所

<120>一种与鸡绿壳蛋蛋壳颜色深浅相关的snp分子标记及其应用

<130>xy-2019-1-w-076

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctgatttctctggctcctgg20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgcttctggagattgctgtg20

<210>3

<211>237

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>3

ctgatttctctggctcctggcactgcattaagtaaatttttttctttgtaaaaatcaccc60

tgttttctcttgtacaatattttttaatgtgcctctctgatcatttgtcttttctgcctc120

tcctttttccccaatgcagstatatctagtccaggtggtgcaaacctgcagtttggtcac180

ttttgtggagaaatcatttgaccagttctcagaacttcacagcaatctccagaagca237