一株灰色链霉菌HL-50及其复合菌剂与应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株灰色链霉菌hl-50及其复合菌剂与应用。

背景技术：

在水产动物养殖时，由于清塘不彻底、水质管理不好、预防不到位等原因会引起各种寄生虫和细菌，从而导致直接或间接给整个水产养殖业带来了巨大的损失。为了维持养殖的效益，抗菌杀虫药成了水产养殖的刚需产品。但传统的药品为了单纯追求立竿见影的效果，会出现重金属超标、药物用量不稳定等情况，从而破坏水质的稳定、损伤水产动物的健康并降低其免疫力，严重的还会直接导致死亡事件的发生，最终降低了生产效益，也给消费者带来了安全隐患，并且过多使用传统的杀虫剂会使水产动物产生抗药性，进而导致药物失效。在这种形势下，微生态制剂和被作为保持水产养殖健康、稳定发展的重要手段。微生物制剂不仅可以具有良好的驱虫和杀菌效果，还可以分解消耗饲料残渣、水生动物尸体、排泄物等，净化水质，增加水体溶氧，减少有害物质积累。因此，从环境中筛选杀菌驱虫效果好，并进而可以制备天然、健康、对水产动物安全的杀菌驱虫药的菌种变得非常重要。

精油是从植物的花、叶、茎、根或果实中，通过水蒸气蒸馏法、挤压法、冷浸法或溶剂提取法提炼萃取的挥发性芳香物质。精油对热和光照敏感，因此需要贮存于深色容器和阴凉处，并且精油因为其自身具有的特殊香气以及可溶于有机溶剂的特点，现在多用于保养品以及芳香疗法中，但植物精油功能多种多样，除具有传统的调香、舒缓与振奋精神的作用外，还具有抗菌、防痉挛、促生长、促进细胞新陈代谢及细胞再生功能、增强免疫力、抗氧化等功效。而植物精油正因为上述的这些功能及其安全、高效、稳定的特点，也逐渐成为优质安全的水产饲料添加剂或水产药品。而在精油中有一种桉树精油，其色泽很浅，感官不浓稠，气味冲但不持久，最终会影响精油的使用效果。但在澳大利亚分布着一种小叶桉(多苞桉)，其生长在非常干旱的沙土地环境中，会比一般的蓝桉含有更多的桉树脑成分且提取率较高，用多苞桉生产的精油不仅含量高、品质好，是珍贵的医用级原料，还可以广泛地用于抗菌和驱虫领域。

因此，开发一种天然、高效，既对水产动物具有很好抗菌驱虫作用，又不对动物产生抗药性和伤害的复合菌剂是非常有必要的。

技术实现要素：

为了克服现有技术上的缺陷和不足，本发明提供了一株灰色链霉菌hl-50及其复合菌剂与应用。本发明筛选的灰色链霉菌(streptomycesgriseus)hl-50既能达到杀菌驱虫效果，又不会影响水生动物健康，还可以与多苞桉桉树精油相配合制备成驱虫效果更好的复合菌剂。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株灰色链霉菌hl-50，其分类名为灰色链霉菌streptomycesgriseus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18424。

进一步的，所述灰色链霉菌hl-50的菌落呈圆形，浅土黄色，面积较小并中间有突起，菌落表面微绒状、不透明；气生菌丝生长丰盛，呈乳白色。

进一步的，所述灰色链霉菌hl-50的适宜生长温度是24℃～35℃，适宜生长ph值是6～8。

本发明还提供了含有上述的灰色链霉菌hl-50的复合菌剂。

进一步的，所述复合菌剂包括：菌含量不少于5×10⁸cfu/g的灰色链霉菌hl-50和多苞桉桉树精油。

进一步的，所述多苞桉桉树精油由多苞桉桉树叶制得，包含以下组分：1，8-桉叶脑、b-甲基异丙基苯、柠檬烯、α-蒎烯、松油烯-4-醇、别香橙烯、α-松油醇、p-甲基异丙基苯、双丙酮醇、β-蒎烯、β-月桂烯、α-水芹烯、α-萜烯、γ-萜烯、粘醛、香芹酮、水芹醛、4-喈烯、蓝桉烯和b-桉叶油醇。

进一步的，所述多苞桉桉树精油通过以下制备方法制得：多苞桉桉树叶清洗烘干、粉碎；通过水蒸气蒸馏釜、冷凝器和油水分层器获得多苞桉桉树精油原油；再经过减压精馏塔去除杂质油后获得多苞桉桉树精油。

本发明还提供了所述的含有灰色链霉菌hl-50的复合菌剂在用于制备淡水鱼类的虫剂中的应用。

进一步的，所述复合菌剂的应用方法如下：所述复合菌剂的应用方法如下：将复合菌剂按照0.5～1.5kg/吨饲料的用量均匀混合在淡水鱼类的食用饲料中，连续投喂4-7天。

进一步的，所述淡水鱼类包括：草鱼、鲫鱼、鲢鱼、加州鲈鱼、鲦鱼、鲶鱼、鳟鱼、罗非鱼、青鱼和鳙鱼。

进一步的，所述驱虫剂能够杀死下列寄生虫：孢子虫、车轮虫、指环虫、锚头鳋、三代虫、多子小瓜虫、斜管虫、绦虫和隐鞭虫。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

(1)本发明所述的灰色链霉菌(streptomycesgriseus)hl-50对淡水鱼类具有很好的驱离寄生虫和杀菌的作用，且该菌性状稳定、培养简单、培养条件不苛刻、适用条件较广以及不会造成环境污染。

(2)本发明所述复合菌剂中的多苞桉桉树精油的原料为澳大利亚多苞桉桉树叶，成分天然，无毒副作用，不会影响淡水鱼类的摄食及生长，也不会影响淡水鱼类的养殖水质，且制备的多苞桉桉树精油油品质量好，具有很好的驱虫效果。

(3)本发明将所述灰色链霉菌hl-50和多苞桉桉树精油制备成复合菌剂，该复合菌剂不仅能够有效地驱离淡水鱼类感染的指环虫、三代虫、车轮虫、斜管虫、孢子虫、小瓜虫、纤毛虫等多种寄生虫，还可以内服，调节鱼类体内菌群的平衡和健康；该复合菌剂在驱虫的同时，还可以有效抑制淡水鱼类养殖水体中有害菌群的繁殖，减少细菌感染，进而提高鱼类的生长，并且该菌剂使用安全、不产生任何毒副作用，制备简单、对环境友好，使用范围广泛，驱虫效果很好，可以节约养殖成本，因此具有广阔的应用前景。

附图说明

图1本发明分离得到的灰色链霉菌hl-50在高氏合成一号琼脂培养基上的菌落照片。

图2为本发明所述的多苞桉桉树精油的制备工艺流程图。

图3为本发明所述的多苞桉桉树精油的具体成分表。

图4为本发明含有灰色链霉菌hl-50的复合菌剂用于淡水鱼中孢子虫、车轮虫和指环虫的实验结果，图4a为鲫鱼腮部观察到寄生虫，图4b为使用本发明的复合菌剂7天后鲫鱼腮部恢复正常，寄生虫消失。

图5为本发明含有灰色链霉菌hl-50的复合菌剂用于淡水鱼中锚头鳋的实验结果，图5a为草鱼腮部观察到锚头鳋，图5b为使用本发明的复合菌剂7天后草鱼腮部恢复正常。

图6为本发明含有灰色链霉菌hl-50的复合菌剂用于淡水鱼中三代虫的实验结果，图6a为显微镜观察到的三代虫，图6b为使用本发明的复合菌剂7天后三代虫消失。

图7为本发明含有灰色链霉菌hl-50的复合菌剂用于黄颡鱼中多子小瓜虫的实验结果，图7a为感染多子小瓜虫的黄颡鱼体表有白点，图7b为镜检检测到的多子小瓜虫；图7c为使用本发明的复合菌剂后体表白点消失。

图8为本发明含有灰色链霉菌hl-50的复合菌剂用于草鱼中斜管虫的实验结果，图8a为感染斜管虫的鳃部红肿，黏液多；图8b为镜检到的斜管虫；图8c表明使用本发明的复合菌剂后斜管虫消失。

图9为本发明含有灰色链霉菌hl-50的复合菌剂用于草鱼中中华鰠的实验结果，图9a为草鱼感染中华鰠的烂腮；图9b为镜检到的草鱼鳃部中华鰠；图9c表明使用本发明的复合菌剂后草鱼鳃部恢复正常。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

1、灰色链霉菌(streptomycesgriseus)hl-50的筛选

以土壤为样品，将土壤和无菌水混匀混匀制成土壤的10^-1稀释液，然后分别制取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释液。分别取10^-3、10^-4、10^-5稀释液涂布于高氏合成一号琼脂培养基上，在30℃恒温培养7d，选取明显的菌落进行多次纯化后得到单菌落，命名为hl-50，置于高氏合成一号琼脂斜面培养基中保存。所述高氏合成一号琼脂培养基的配方为：kno31g，可溶性淀粉20g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso40.01g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph7.2。

如图1所示，所述菌株hl-50在高氏合成一号琼脂培养基的菌落生物学特性为：菌落呈圆形，面积较小、中间稍有突起，浅土黄色，菌落表面微绒状、不透明，气生菌丝生长丰盛，呈乳白色。该菌株生长温度为16℃～40℃，适宜生长温度是24℃～35℃，生长ph值是4～9，适宜ph是6～8。

2、灰色链霉菌hl-50的16srrna序列测定

提取所述菌株hl-50的基因组dna，并以此为模板，使用16srrna通用引物进行pcr扩增，获得16srrna扩增序列后测序，所得核苷酸序列如seqidno：1所示，将该序列进行blast比对，结果显示菌株hl-50与genbank基因库中灰色链霉菌streptomycesgriseus同源性最高，因此判定菌株hl-50为灰色链霉菌。

将筛选到的灰色链霉菌hl-50进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年8月27日；灰色链霉菌streptomycesgriseus的保藏编号为cgmccno.18424。

实施例2

1、多苞桉桉树精油的制备

本发明中所述的复合菌剂中多苞桉桉树精油的制备工艺流程如图2所示，首先将澳大利亚多苞桉桉树叶放入水洗塔清洗后，放到烘干机中烘干，再于粉碎机中粉碎后分别进入水蒸气蒸馏釜、冷凝器和油水分层器中分离油相和水相，其中水相进入乙醚萃取器分离出废水，含有乙醚的液体进入乙醚回收塔中回收乙醚，将回收的乙醚和油相液体添加到固体床吸附干燥器进一步去除油相中的水分，最后将油相液体加入到减压精馏塔中精馏以此去除杂质油后便得到多苞桉桉树精油。

本实施例中制备出的多苞桉桉树精油保存在密封、不透光的容器中并避光放置。随后对多苞桉桉树精油进行色谱分析，检测出的具体成分如图3所示。由两张图可以看出在多苞桉桉树精油中相对含量最多的成分为1，8-桉树脑(83.8％)，该成分也是本发明多苞桉桉树精油中最主要的有效成分，具有明显的抗菌和驱虫的效果，其他的成分有β-甲基异丙基苯(3.43％)、柠檬烯(2.5％)、α-蒎烯(18％)、别香橙烯(1.08％)、松油烯-4-醇(0.88％)、α-松油醇(0.58％)、蓝桉烯(0.54％)、p-甲基异丙基苯(0.51％)等。

2、复合菌剂的制备

将上述制备的多苞桉桉树精油与菌含量不少于5×10⁸cfu/g灰色链霉菌hl-50均匀混匀后制成所述复合菌剂。该复合菌剂在使用时，以0.5-1.5kg/吨饲料的用量混合在淡水鱼类的食用饲料中，按正常的饲养管理来进行投喂，连续投喂4-7天。

实施例3

将实施例2中制备的复合菌剂进行驱虫实验，试验地点选择在江苏射阳，养殖面积80亩，养殖模式见下表：

养殖模式

在鱼腮部检查发现寄生虫后，采用复合菌剂1kg拌1吨饲料，按正常的饲养管理来进行，连续投喂7日，每天投喂3次。7日后，再次检查鱼腮部寄生虫的情况。如图4所示，饲喂初期，鲫鱼腮部感染孢子虫、车轮虫和指环虫；饲喂7天后，鲫鱼的腮部没有孢子虫感染，显微镜下也没有车轮虫和指环虫，说明复合菌剂对淡水鱼类具有明显的驱虫效果。

实施例4

试验地点选择在江苏射阳，养殖面积100亩，养殖模式见下表：

养殖模式

在鱼腮部检查发现锚头鳋后，采用复合菌剂1kg拌1吨饲料，按正常的饲养管理来进行，连续投喂7日，每天投喂3次。7日后，再次检查鱼腮部寄生虫的情况。如图5所示，饲喂初期，草鱼腮部感染锚头鳋；饲喂7天后，检查到草鱼腮部的锚头鳋脱落，可以说明复合菌剂对淡水鱼类具有明显的驱虫效果。

实施例5

试验地点选择在湖北黄梅，养殖面积25亩，养殖模式见下表：

养殖模式

在鱼腮部检查发现三代虫后，采用复合菌剂1kg拌1吨饲料，按正常的饲养管理来进行，连续投喂7日，每天投喂3次。7日后，再次检查鱼腮部寄生虫的情况。如图6所示，饲喂初期，草鱼腮部感染三代虫；饲喂7天后，检查到草鱼腮部的三代虫脱落，可以说明复合菌剂对淡水鱼类具有明显的驱虫效果。

实施例6

试验地点选择在浙江湖州，养殖黄颡鱼，5月份黄颡鱼体表有白色点状物，显微镜检测发现为多子小瓜虫。采用将实施例2中制备的复合菌剂1kg拌1吨饲料，按正常的饲养管理来进行，连续投喂7日，每天投喂3次。7日后，再次检查体表寄生虫的情况。如图7所示，饲喂初期，黄颡鱼体表感染多子小瓜虫；饲喂7天后，体表多子小瓜虫脱落，白点消失，说明复合菌剂对黄颡鱼具有明显的驱虫效果。

实施例7

试验地点选择在湖南岳阳，养殖加州鲈鱼，发现鲈鱼尾部有伤口，显微镜检查，发现车轮虫。采用实施例2中制备的复合菌剂1kg拌1吨饲料，按正常的饲养管理来进行，连续投喂7日，每天投喂3次。7日后，再次检查鱼尾部寄生虫的情况。饲喂初期，加州鲈鱼尾部感染车轮虫；饲喂7天后，检查到鲈鱼尾部上的车轮虫发生脱落，可以说明对加州鲈鱼具有明显的驱虫效果。

实施例8

试验地点选择在江苏射阳，养殖草鱼，草鱼有零星死亡，检查发现鳃部有红肿，黏液增多，从伤口处检测到大量的斜管虫。采用实施例2中制备的复合菌剂1kg拌1吨饲料，按正常的饲养管理来进行，连续投喂7日，每天投喂3次。7日后，再次检查鱼鳃部寄生虫的情况。如图8所示，饲喂初期，草鱼鳃部感染斜管虫；饲喂7天后，检查到斜管虫脱落，可以说明复合菌剂对淡水鱼类具有明显的驱虫效果。

实施例9

试验地点选择在湖南安乡县射阳，养殖面积20亩，养殖模式见下表：

养殖模式

在鱼腮部发现溃烂后检查发现中华鰠，采用实施例2中制备的复合菌剂1kg拌1吨饲料，按正常的饲养管理来进行，连续投喂7日，每天投喂3次。7日后，再次检查鱼腮部寄生虫的情况。如图9所示，饲喂初期，草鱼腮部感染中华鰠；饲喂7天后，检查到草鱼腮部的中华鰠脱落，鳃部恢复正常，可以说明对淡水鱼类具有明显的驱虫效果。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110>山东龙昌动物保健品有限公司

<120>一株灰色链霉菌hl-50及其复合菌剂与应用

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