一种培养表达重组人表皮生长因子的工程菌的方法与流程

文档序号:19418761发布日期:2019-12-14 01:12阅读:506来源:国知局

本发明属于生物工程领域,更具体地,本发明涉及通过采用基因工程方法生产重组人表皮生长因子的方法。



背景技术:

人表皮生长因子(hegf)是由53个氨基酸组成的小分子多肽,分子量约为6000道尔顿,等电点约为4.2-4.6。分子内有三对二硫键,对酸、碱、热等理化因素均较稳定。

hegf具有广泛的生物学效应,能极强地促进各种表皮组织生长,在医学上已用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗。hegf还能促进正常表皮细胞的新陈代谢,添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。

20世纪80年代前,hegf的来源主要是通过组织和体液提取,由于hegf的含量极低,造成提取成本高且产品纯度低,使hegf的应用受到了限制。80年代以后,随着基因工程技术的发展,人们通过基因重组技术,利用大肠杆菌、酵母菌等生产hegf获得了成功,为工业化生产重组人表皮生长因子打下了基础。

目前大规模生产hegf大多采用重组工程菌的方法,中国专利cn1854294a公开了分泌表达重组人表皮生长因子的大肠杆菌表达系统,其中将设计的phoaspl10基因与hegf的串联基因,构建表达质粒pbl10egf(该质粒含有入噬菌体的pl启动子),进而以大肠杆菌bl21(de3)作为宿主细胞而构建了工程菌株be-2,该菌株分泌表达rhegf至384mg/l。又如中国专利cn102952817a公开了一种温度诱导生产重组人表达生长因子的方法,该发明将pl启动子、ompa信号肽、hegf基因串联构建分泌表达质粒,将质粒转化原核生产菌株,优化菌株培养条件,温度诱导生产hegf产量达到452mg/l。

但是,如何缩短培养时间,并且提高重组人表皮生长因子的表达量,仍是本领域急需解决的技术问题。



技术实现要素:

为了解决上述技术问题,本发明提供了一种培养表达重组人表皮生长因子的工程菌的方法,所述方法包括下述步骤:

(1)一级种子培养,将甘油冻存的工程菌接种至包含卡那霉素的lb液体培养基中,培养,得到一级种子培养液;

(2)二级种子培养,将步骤(1)中得到的所述一级种子培养液接种至包含卡那霉素的lb液体培养基中,培养,得到二级种子培养液;

(3)将步骤(2)中得到的所述二级种子培养液接种至发酵罐中,培养,然后诱导,得到发酵罐上清液;和

(4)从步骤(3)中得到的所述发酵罐上清液中分离和纯化重组人表皮生长因子。

在一个方面中,其中在步骤(1)中,所述培养的条件为在35℃至37℃的温度下,在180rpm至230rpm下震荡6小时至8小时,并且所述一级种子培养液的od600为2至3。

在一个方面中,其中在步骤(2)中,所述一级种子培养液的接种量为0.1vol.%至0.5vol.%,所述培养的条件为在25℃至30℃的温度下,在180rpm至230rpm下震荡10小时至16小时,并且所述二级种子培养液的od600为3.5至4。

在一个方面中,其中在步骤(3)中,所述二级种子培养液的接种量为5vol.%至10vol.%,所述发酵罐中培养基的成分如下:

葡萄糖,1g/l至20g/l、蛋白胨,20g/l、酵母粉,10g/l、kh2po4,3.5g/l、k2hpo4,5g/l,(nh4)2hpo4,3.5g/l、nacl,1g/l、mgso4·7h2o,1g/l、泡敌,0.3ml/l、微量元素溶液,3ml/l、卡那霉素,50mg/l;并且其中所述微量元素溶液的成分如下:

feso4·7h2o,0.167g/l、znso4·7h2o,0.0193g/l、cocl2·6h2o,0.12g/l、na2moo4·2h2o,0.012g/l、cacl2·2h2o,0.006g/l、cuso4·5h2o,1.9g/l、h3bo3,0.5g/l、hcl(37%,w:v),37ml/l,并且

所述培养的条件为在35℃至37℃的温度下,在200rpm至500rpm下发酵3小时至5小时,然后,当od600达到8至10时,以3.8ml/l/小时至4.5ml/l/小时的速度添加补充培养基,并且当od600达到15至20时,添加0.1mm至0.3mm的iptg诱导,以11ml/l/小时至13ml/l/小时的速度添加补充培养基,2小时至4小时之后,添加0.05%至0.15%的甘氨酸,继续诱导8小时至12小时,放罐。

在一个方面中,放罐时od600为50至70。

在一个方面中,其中所述补充的培养基的成分为400g/l的葡萄糖、20g/l的mgso4·7h2o。

在一个方面中,其中用氨水将ph调节为6.6至7.2,优选6.8。

在一个方面中,其中在第0小时至第1小时,在200rpm下搅拌,在第1小时至第2小时,在300rpm下搅拌,在第3小时至第4小时,在400rpm下搅拌,在第4小时至第5小时,在500rpm下搅拌,此后维持500rpm。

在一个方面中,所述重组人表皮生长因子的氨基酸序列为nsdsecplshdgyclhdgvcmyiealdkyacncvvgyigercqyrdlkwwelr(seqidno.1)。

在一个方面中,编码重组人表皮生长因子的核酸序列为aattccgactctgaatgcccgctgtctcacgacggttactgcctgcacgatggtgtttgcatgtatatcgaagctctggacaaatacgcgtgcaactgtgttgttggttacatcggtgaacgttgccagtaccgtgacctgaaatggtgggaactgcgt(seqidno.2)。

通过本发明的方法,缩短了工程菌的发酵时间,提高了hegf的产量。

具体实施方式

根据本发明的实施方式,通过将甘油冻存的工程菌经过一级种子培养和二级种子培养,提高了工程菌的活力,由此缩短了后续发酵所需的时间。

对于本发明中使用的重组工程菌,将大肠杆菌外膜蛋白a引导序列mkktaiaiavalagfatvaqa(seqidno.3)的基因编码序列融合到人egf基因序列的5’端,送南京金斯瑞科技有限公司优化合成并在两端添加ncoi和xhoi酶切位点。将优化合成的基因片段双酶切装入pet28a表达载体,转化到bl21(de3)菌株得到重组工程菌,命名为he1。

在本发明中使用的材料,除非另外指出,否则都是本领域常见的,并且可在商业上购买得到的材料。

在本发明中,工程菌为上述得到的he1。

在本发明中,使用的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-thiogalactoside,iptg)由amresco公司生产,货号为0995c466。

在本发明中,使用的泡敌的全称为聚氧丙烯聚氧乙烯有规二醇,或三醇醚,是发酵中常用的消泡剂。具体而言,使用的泡敌由江苏斯德瑞克化工有限公司生产,货号为gpe。

在本发明中,使用的蛋白胨由oxoid公司生产,货号为lp0042。

在本发明中,使用的酵母粉由oxoid公司生产,货号为ip0021。

在本发明中,使用的甘氨酸由amresco公司生产,货号为0167。

在一个实施方式中,工程菌的接种量为0.1vol.%至0.3vol.%。在一个实施方式中,lb液体培养基中使用的卡那霉素的含量为25ug/ml至50ug/ml。

接种量是指所加入的工程菌、一级种子培养液或二级种子培养液的体积和接种后培养液的体积的比例,以vol.%表示。

在一级种子培养中,得到的一级种子培养液的od600值为约2至3,优选为约2.2至2.8,最优选为约2.5。

在二级种子培养中,得到的二级种子培养液的od600值为约3.5至4,优选为约3.6至3.9,最优选为约3.8。

通过将甘油冻存的工程菌进行上述一级种子培养和二级种子培养,能够更快地达到较高的菌体密度,从而缩短了发酵时间。

在一个实施方式中,使用紫外分光光度计,在600nm处检测吸光度,测量一级种子培养液和二级种子培养液的od600值。

在一个实施方式中,将二级种子培养液接种至发酵罐中,在37℃,200rpm下搅拌,用氨水将ph调节至6.8,随着菌体的生长逐渐提高转速,例如,在第0小时至第1小时,转速为200rpm,第1小时至第2小时,转速为300rpm,第3小时至第4小时,转速为400rpm,第4小时至第5小时,转速为500rpm,此后维持500rpm。

在一个实施方式中,在添加iptg诱导之前,将添加补充培养基的速度设定为3.8ml/l/小时至4.5ml/l/小时,并且在添加iptg诱导之后,将添加补充培养基的速度设定为11ml/l/h,是因为诱导前菌体较少,所需的营养成分少。如果补充培养基的中含有的葡萄糖过多,生成的乙酸将影响菌体生长,也会抑制蛋白的表达。以上述添加补充培养基的速度,发酵液中的葡萄糖浓度基本小于1g/l,不会生成较多的乙酸。

在添加iptg诱导时,发酵罐中培养液的od600为15至20,优选16至19,最优选为18。

在本发明中,从发酵罐上清液中分离和纯化重组人表皮生长因子的方法是本领域公知的。比如,可采用苯基琼脂糖凝胶6ff(高分辨率)、qsepharosehighperformance阴离子交换、superdex30prepgrade凝胶过滤三步法纯化;或采用将ph调节至重组人表皮生长因子的等电点4.6之后,加硫酸铵至35%饱和度,将所得沉淀离心回收并且溶解,然后用sephadexg50superfine纯化等。

在一个实施方式中,通过使用本发明的方法,培养工程菌之后,发酵罐上清液中重组人表皮生长因子的浓度为95mg/l至158mg/l,优选135mg/l至158mg/l,最优选158mg/l。

采用酶联免疫吸附测定(elisa)的方法检测重组人表皮生长因子的浓度。酶联免疫吸附测定的主要步骤如下:

1、包被

用包被液将人表皮生长因子抗体稀释至10ug/ml,每孔100ul,将elisa平板在4℃下静置过夜。

2、洗涤

丢弃elisa平板中的包被液,用pbst进行洗涤3至5次。

3、封闭

将体积100ul的封闭液添加至elisa平板的每个孔,置于37℃下温育1小时。

4、洗涤

使用步骤2的方法洗涤elisa平板,最后拍干等待加入样品。

5、加入样品

将样品用样品稀释液稀释,添加至相应的孔中,每孔100ul,37℃下温育1小时。

6、洗涤

与步骤4相同。

7、加相应的hrp-标记的抗体

加相应的商品化hrp-标记的抗体,一般也用样品稀释液稀释,稀释至0.2ug/ml。将稀释好的hrp-标记的抗体加入各孔,每孔100ul,37℃下温育1小时。

8、洗涤

与步骤4相同,洗涤6次。

9、显色

将a液和b液1:1混合,现配现用,各孔加混合的tmb底物液100μl,室温避光反应10分钟。

10、终止

每孔加终止液(2mol/l硫酸溶液)终止反应,立即在酶标仪上读数。

上述步骤中使用的材料如下:

1、包被液的配置(ph9.6的碳酸盐缓冲液)

无水na2co31.59g

nahco32.93g

软水100ml

完全溶解至4℃

2、封闭液

含有0.5%bsa的包被液

完全溶解至4℃

3、pbst的配方

4、样品稀释液

含有0.5%bsa、0.01%吐温20的pbs,4℃保存

5、终止液2mol/l硫酸溶液

6、显色液:

a液:na2hpo4·12h2o3.682g

柠檬酸1.021g

过氧化脲0.06g

用软水定容至100ml,4℃避光

b液:柠檬酸1.05g

edta0.0146g

tmb0.02g

用软水定容至100ml,4℃避光。

下面结合具体的实施例进一步详细描述本发明。但是,应理解,这些实施例仅用于阐释本发明而不期望限制本发明的范围。

实施例1

一级种子培养,取100ul甘油冻存的工程菌接种至50ml含50ug/ml卡那霉素的lb液体培养基中,在35℃,220rpm下振荡7小时(一级种子培养时间),测得od600(一级种子od600)为2,停止培养,得到一级种子培养液。

二级种子培养,将一级种子培养液以0.2vol.%的接种量接种至500ml含50ug/ml卡那霉素的lb液体培养基中,在25℃,220rpm下振荡12小时(二级种子培养时间),测得od600(二级种子od600)为3.5,停止培养,得到二级种子培养液。

将二级种子培养液按5vol.%的接种量(二级种子培养液的接种量)接种至含12l培养基的20l发酵罐中,在37℃,200rpm下搅拌,用氨水将ph调节至6.8。随着时间的推移,在0小时至1小时,转速为200rpm,1小时至2小时,转速为300rpm,3小时至4小时,转速为400rpm,4小时至5小时,转速为500rpm,此后维持500rpm。在发酵期间添加成分为400g/l的葡萄糖、20g/l的mgso4·7h2o的补充培养基。诱导前的添加速度为3.8ml/l/小时,诱导后为11ml/l/小时。当发酵液的od600达到15时(开始诱导时的od600),加入终浓度为0.1mm的iptg开始诱导,诱导2小时后加入终浓度为按重量计0.05%的甘氨酸,诱导10小时,放罐。测量发酵罐上清液中hegf的浓度为120mg/l。

发酵罐中培养基的成分如下:

葡萄糖,5g/l、蛋白胨,20g/l、酵母粉,10g/l、kh2po4,3.5g/l、k2hpo4,5g/l,(nh4)2hpo4,3.5g/l、nacl,1g/l、mgso4·7h2o,1g/l、泡敌,0.3ml/l、微量元素溶液,3ml/l、卡那霉素,50mg/l;并且其中所述微量元素溶液的成分如下:

feso4·7h2o,0.167g/l、znso4·7h2o,0.0193g/l、cocl2·6h2o,0.12g/l、na2moo4·2h2o,0.012g/l、cacl2·2h2o,0.006g/l、cuso4·5h2o,1.9g/l、h3bo3,0.5g/l、hcl(37%,w:v),37ml/l。

实施例2

根据上述实施例1相同的方式进行实施例2,只是将一级种子培养液的od600改为3,并且将二级种子培养液的od600改为4。该实施例的结果,以及一级种子培养时间和二级种子培养时间见下面表1。

实施例3

根据上述实施例1相同的方式进行实施例3,只是将一级种子培养液的od600改为2.5,并且将二级种子培养液的od600改为3.75。该实施例的结果,以及一级种子培养时间和二级种子培养时间见下面表1。

实施例4

根据上述实施例1相同的方式进行实施例4,只是将二级种子培养液的接种量改变为10vol.%。该实施例的结果,见下面表1。

实施例5

根据上述实施例1相同的方式进行实施例5,只是将二级种子培养液的接种量改变为6.5vol.%。该实施例的结果,见下面表1。

实施例6

根据上述实施例1相同的方式进行实施例6,只是当发酵液的od600达到20时,开始诱导。该实施例的结果,见下面表1。

实施例7

根据上述实施例1相同的方式进行实施例7,只是当发酵液的od600达到18时,开始诱导。该实施例的结果,见下面表1。

实施例8

根据上述实施例1相同的方式进行实施例8,只是加入0.3mm的iptg。该实施例的结果,见下面表1。

实施例9

根据上述实施例1相同的方式进行实施例9,只是加入0.2mm的iptg。该实施例的结果,见下面表1。

实施例10

根据上述实施例1相同的方式进行实施例10,只是加入0.15%的甘氨酸。该实施例的结果,见下面表1。

实施例11

根据上述实施例1相同的方式进行实施例11,只是加入0.1%的甘氨酸。该实施例的结果,见下面表1。

比较例1

根据上述实施例1相同的方式进行比较例1,只是将一级种子培养液的od600改为1,并且将二级种子培养液的od600改为3。该实施例的结果,以及一级种子培养时间和二级种子培养时间见下面表1。

比较例2

根据上述实施例1相同的方式进行比较例2,只是将一级种子培养液的od600改为4,并且将二级种子培养液的od600改为5。该实施例的结果,以及一级种子培养时间和二级种子培养时间见下面表1。

比较例3

根据上述实施例1相同的方式进行比较例3,只是将一级种子培养液的od600改为8,并且将二级种子培养液的od600改为10。该实施例的结果,以及一级种子培养时间和二级种子培养时间见下面表1。

比较例4

根据上述实施例1相同的方式进行比较例4,只是将二级种子培养液的接种量改变为12vol.%。该实施例的结果,见下面表1。

比较例5

根据上述实施例1相同的方式进行比较例5,只是将二级种子培养液的接种量改变为4vol.%。该实施例的结果,见下面表1。

比较例6

根据上述实施例1相同的方式进行比较例6,只是当发酵液的od600达到25时,开始诱导。该实施例的结果,见下面表1。

比较例7

根据上述实施例1相同的方式进行比较例7,只是当发酵液的od600达到10时,开始诱导。该实施例的结果,见下面表1。

比较例8

根据上述实施例1相同的方式进行比较例8,只是加入0.05mm的iptg。该实施例的结果,见下面表1。

比较例9

根据上述实施例1相同的方式进行比较例9,只是加入0.4mm的iptg。该实施例的结果,见下面表1。

比较例10

根据上述实施例1相同的方式进行比较例10,只是加入0.025%的甘氨酸。该实施例的结果,见下面表1。

比较例11

根据上述实施例1相同的方式进行比较例11,只是加入0.2%的甘氨酸。该实施例的结果,见下面表1。

表1

通过上述实施例1至11和比较例1至11,可见,当一级种子培养液的od600在2-3的范围内,并且二级种子培养液的od600在3.5-4的范围内时,以5vol.%至10vol.%的接种量接种,并且添加的iptg的浓度在0.1mm至0.3mm的范围内,甘氨酸在0.05%至0.15%的范围内时,发酵罐上清液中实现了较高的hegf浓度。

此外,在上述实施例1至11中,所需的发酵时间为10至18小时,而在比较例1至11中,所需的发酵时间为12至22小时。尤其,通过将实施例8和比较例4进行比较可发现,虽然它们最终发酵罐上清液中hegf的浓度都为118mg/l,但是,实施例8仅仅需要14小时,而比较例4则需要18小时。因此,本申请大大缩短了工程菌的发酵时间,提高了hegf的产量。

虽然具体描述了若干实施方式,但是本领域技术人员显然知道可以修改所公开的实施方式。因此,上述实施方式是非限制性的。请求保护的范围以所附的权利要求书为准。

序列表

<110>杭州纽龙生物科技有限公司

<120>一种培养表达重组人表皮生长因子的工程菌的方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>53

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

asnseraspserglucysproleuserhisaspglytyrcysleuhis

151015

aspglyvalcysmettyrileglualaleuasplystyralacysasn

202530

cysvalvalglytyrileglygluargcysglntyrargaspleulys

354045

trptrpgluleuarg

50

<210>2

<211>159

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aattccgactctgaatgcccgctgtctcacgacggttactgcctgcacgatggtgtttgc60

atgtatatcgaagctctggacaaatacgcgtgcaactgtgttgttggttacatcggtgaa120

cgttgccagtaccgtgacctgaaatggtgggaactgcgt159

<210>3

<211>21

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

metlyslysthralailealailealavalalaleualaglypheala

151015

thrvalalaglnala

20

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