木聚糖硫酸化衍生物在促进益生菌体外增殖中的应用的制作方法

本发明属于功能糖衍生及应用技术领域，具体涉及一种木糖醇硫酸化衍生物在促进益生菌体外增殖中的应用。

背景技术：

木聚糖是植物半纤维素的主要成分，是一种复杂的多聚五碳糖。它是自然界中含量仅次于纤维素的多糖，木聚糖本身具有许多独特的生理活性和生物功能，比如：具有促进有丝分裂及免疫调节等功能，目前对于木聚糖的化学修饰以研究其生物活性也已经成为热点，比如羟基化、羧基化，但是硫酸化修饰的木聚糖因具有多种生物活性成为更为关注的热点之一。硫酸化方法的原理为：多糖与相应的硫酸化试剂在一定的条件下反应，使得多糖残基上的某些羟基接上硫酸基团，以氯磺酸试剂为例，多糖的硫酸化反应是在路易碱溶液中由so3h⁺取代多糖羟基中的h⁺，经过中和得到硫酸酯盐。硫酸取代度的大小影响着硫酸多糖的活性，但并不是取代度越高，硫酸根越多活性越强，分子中硫酸根过多会产生抗凝血等副作用。

木聚糖具有其甜度低、热量少、不易吸收、可发酵、不增加血糖血脂、润肠通便等特性，由于其多种优点所在，现有技术中制备了聚合度低的低聚木糖，发现低聚木糖可明显促进肠道益生菌的繁殖(也就是现有已经商品化的益生元，其中低聚木糖就是其中的益生元之一)，并且目前低聚糖也仅仅用于双歧杆菌的专用益生元，针对聚合度比较高的木糖而言，却仍然不具备促进肠道益生菌的功能，也不具备促进双歧杆菌繁殖的作用；另外，现有技术中经过化学修饰的木聚糖具有较好生物活性，比如硫酸化的木聚糖在抗炎活性、抗病毒活性、抗癌活性、抗凝活性等方面进行的研究，但有关木聚糖硫酸化衍生物对益生菌的体外增殖作用至今未见国内外文献报道。

本发明对木聚糖进行硫酸化修饰，研究了不同浓度硫酸化木聚糖对益生菌(德氏乳杆菌保加利亚亚种和短乳杆菌)的体外增殖作用。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种木糖醇硫酸化衍生物在促进益生菌体外增殖中的应用，木聚糖硫酸化衍生物添加到培养益生菌的培养基中，可明显提高其繁殖能力，说明具有明显促进益生菌体外增殖作用。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种木聚糖硫酸化衍生物在促进益生菌体外增殖中的应用，将所述木聚糖硫酸化衍生物按质量百分比1.5％-2％添加到培养益生菌的基础培养基中，可促进益生菌体外增殖。

优选的是，所述益生菌为短乳杆菌或德式乳杆菌。

优选的是，所述基础培养基为msr培养基。

优选的是，所述木聚糖硫酸化衍生物是由木聚糖经硫酸化制备而成，具体包括以下步骤：

步骤1：将木聚糖溶于n,n-二甲基甲酰胺中，室温超声分散均匀，得到混合物一；

步骤2：向所得混合物一中缓慢加入氨基磺酸反应1-5h，即得木聚糖硫酸化衍生物。

优选的是，所述木聚糖和所述n,n-二甲基甲酰胺按质量体积比3：80-85；所述氨基磺酸按所述木聚糖总量的1-5倍添加。

优选的是，步骤1中的超声条件为：功率60-100w，超声20-30min。

优选的是，步骤2中的反应条件具体为：所述混合物一用恒温磁力搅拌器搅拌并加热到70℃后，加入所述氨基磺酸，再升温至80℃进行反应1-5h后，迅速移至冰水条件下终止反应，冷却至室温，用氢氧化钠溶液中和，之后依次进行醇沉、离心、透析、冷冻干燥。

优选的是，醇沉条件：4℃条件下醇沉24h；离心条件：4500r/min离心15min；透析条件：离心后收集沉淀，复溶所述沉淀，再流水透析48h。

优选的是，所述木聚糖的硫酸化取代度为0.314。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明所述的木聚糖由于其为一种复杂的多聚五碳糖，可以作为菌种的生长碳源，它不易被机体肠道吸收的特点，可以顺利通过小肠和胃而不被降解利用，可以直接进入大肠内被肠道菌群利用，使肠道菌种大量生长繁殖。通过加入n,n-二甲基甲酰胺以及氨基磺酸，进行硫酸酯化，形成硫酸化的木聚糖，经硫酸化的木聚糖具有较好的取代度，并且没有副产物产生，制备方法简单，易操作。本申请制备硫酸化木聚糖衍生物，通过体外益生菌增殖实验，发现随着其浓度的升高益生菌呈现增加的趋势，但是在添加量2％时的增殖效果是最佳的，改变了现有技术中木聚糖不易被吸收利用难以进行开发的技术问题，并且还使得高聚合度的木聚糖也能用于益生元研究提供了基础，还扩充了益生元中有益菌种的种类，具有广泛的推广意义和应用价值。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为所述木聚糖硫酸化修饰前后红外光谱分析图；

图2不同硫酸化温度对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响；

图3不同硫酸化时间对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响；

图4不同木聚糖与氨基磺酸的比例对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响；

图5不同微波功率对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响；

图6为所述不同浓度硫酸化木聚糖对短乳杆菌体外增殖的影响；

图7为所述不同浓度硫酸化木聚糖对德式乳杆菌保加利亚亚种体外增殖的影响；

图8为所述2％硫酸化木聚糖对短乳杆菌生长速率的影响；

图9为所述2％硫酸化木聚糖对德氏乳杆菌保加利亚亚种生长速率的影响。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

硫酸化木聚糖衍生物的制备。

采用氨基磺酸-n,n-二甲基甲酰胺法进行制备硫酸化木聚糖。称取6g木聚糖样品溶于160mln,n-二甲基甲酰胺中，在功率70w，室温的条件下超声30min。用恒温磁力搅拌器搅拌加热到70℃后，缓慢地加入12g氨基磺酸，升温到80℃，在此条件下搅拌反应1h，之后迅速移入冰水中终止反应，冷却至室温，用20％naoh溶液至中和。向反应液中加入其3倍无水乙醇，于4℃醇沉24h，4500r/min离心15min，保留沉淀，复溶沉淀，流水透析48h，冷冻干燥，得到硫酸化木聚糖。

实施例2

用红外光谱检测实施例1制备的硫酸化木聚糖。

分别称取2mg的硫酸化木聚糖和木聚糖加入150mg干燥的kbr于玛瑙研钵中，在白炽灯下干燥研磨，压片制成均匀透明、无颗粒感的薄片，在傅里叶红外分析仪中进行红外光谱分析，范围为4000-400cm^-1，得到红外光谱扫描图。

如图1所示，硫酸化木聚糖在3400cm^-1左右有一个宽峰，由o-h的伸缩振动引起的，在2890cm^-1左右的吸收峰是c-h的伸缩振动引起的。这两处吸收峰与木聚糖的特征峰相似，均为多糖的特征吸收峰。除了多糖的特征峰之外，硫酸化木聚糖在1394cm^-1出现吸收峰，为不对称s＝o伸缩振动吸收峰，在1089cm^-1的吸收峰是因为c-o的收缩振动，这些特征性的吸收峰证明了糖链上已经引入了硫酸基团，硫酸化修饰成功。

实施例3

实施例1中制备的硫酸化木聚糖取代度的测定

硫酸化木聚糖中硫酸根的含量采用bacl2-明胶比浊法测定。

(1)溶液配制：

1mol/lhcl:量取20.83ml质量分数为36％-38％浓盐酸定容至250ml。

0.5％明胶：称取1.25g明胶溶于水中，在60-70℃溶解，冷却定容至250ml，4℃静置过夜备用。

0.5％氯化钡-明胶：称取0.5g氯化钡，用100ml质量分数为0.5％明胶定容，4℃保存备用。

三氯乙酸：制备质量分数为8％的水溶液。

制备0.1mg/ml的k2so4标准液。

(2)标准曲线的制备

分别精准吸取硫酸盐标准溶液：0.0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，1.2ml，1.6ml于试管，各试管以去离子水补至1.6ml；加入1.4ml质量分数为8％三氯乙酸、1.4ml质量分数为0.5％的氯化钡-明胶溶液，混合均匀，室温下静置15min，于360nm测吸收度；以硫酸根的质量(mg)为横坐标，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。

(3)样品中硫酸根含量的测定

取6mg多糖溶解于6ml浓度为1mol/l的hcl中，100℃水解6h，蒸发皿蒸发，无水乙醇促挥发，溶剂蒸发完后补加去离子水2ml。吸取0.4ml多糖水解液补加蒸馏水补到1.6ml，加三氯乙酸(8％水溶液)1.4ml，bacl2-明胶溶液1.4ml，混合(同时做3组平行组)，静置15min，再于360nm波长条件下测定吸光度值a1。

对照组：对照组操作同上，用1.4ml的明胶溶液代替bacl2-明胶溶液。360nm波长测定吸光度值a2。

所求吸光度a0＝a1-a2，a1-a2目的是消除水解液中所含自外吸收物质的影响。由所测得的吸光度值根据硫酸根标准曲线可计算出硫酸钾的质量。

(4)硫酸化取代度的计算

取代度计算公式：ds＝(1.62×s)/(32-1.02×s)。其中s—样品中硫的质量分数(％)。

采用bacl2-明胶比浊法，获得标准曲线方程为y＝1.3379x+0.0037，r²＝0.9934

根据硫酸根标准曲线和硫酸基取代度公式的计算结果，得到硫酸基取代度为0.341，硫酸根含量为6.72％。

实施例4

1、不同硫酸化温度对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响

设置温度60、70、80、90、100℃，研究不同的硫酸化反应温度对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响。

结果如图2所示，在80℃时其取代度最高，达0.341。随着温度的升高，取代度逐渐降低。因此，硫酸化修饰木聚糖多糖的硫酸化温度为80℃。

2、不同硫酸化时间对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响

设置反应时间1、2、3、4、5h，研究研究不同的硫酸化反应时间对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响。

结果如图3所示，硫酸化时间对取代度的影响不大，随着反应时间的进行，取代度略有减小，故最适反应时间为1h。

3、不同木聚糖与氨基磺酸的比例对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响

设置木聚糖与氨基磺酸的比例1:1、1:2、1:3、1:4、1:5(g/g)，研究不同的氨基磺酸用量对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响。

结果如图4所示，比例在1:2时有最高峰，超过1:2时取代度略有降低。因此，硫酸化修饰木聚糖多糖的木聚糖与氨基磺酸的最佳比例为1:2。

4、不同微波功率对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响

设置60、70、80、90、100w，研究研究不同的微波功率对木聚糖多糖硫酸化取代度的影响。

结果如图5所示，微波功率为70w时出现最高峰，超过70w后取代度有所降低。因此，硫酸化修饰木聚糖多糖的最佳微波功率为70w。

实施例5

1、不同浓度硫酸化木聚糖多糖对益生菌增殖的影响

msr培养基：大豆蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，柠檬酸二胺2g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.3g，吐温-801ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5.0g，加热溶解后补加蒸馏水至1000ml，调节ph6.5。121℃下高温灭菌20min。

分别加入10ml含不同浓度(0.5，1.0，1.5，2.0，3.0％，w/v)硫酸化木聚糖多糖的mrs基础培养基，以不同浓度的木聚糖(以木聚糖作为碳源的基础培养基)为阴性对照，同时以含有不同浓度低聚果糖(fos)为阳性对照，115℃，灭菌30min。然后分别接入100μl已多次活化的德氏乳杆菌(gim1.155)和短乳杆菌(gim1.773)悬液，在37℃条件下厌氧培养48h后，取样测定各培养液在600nm波长下的od值和培养基的ph值；每个试验重复3个平行。

如图6和图7所示，结果显示：样品中的od600值随着硫酸化木聚糖的浓度的增加而增加，说明菌种在待测样品中的数量随浓度升高呈增加趋势，对菌体有促进的效果,具体的：

如图7所示，德式乳杆菌保加利亚亚种在0.5-1.5％区间，随着浓度的增大od值也在不断的增大，在浓度为1.5-3％区间od值变化较小，在2％达到最大值后od值不再上升，因此2％浓度是德式乳杆菌保加利亚亚种最适浓度；

如图6所示，短乳杆菌在浓度为1.5％时培养液的od值达到了最高峰，随后在2％培养液浓度变化较小，随着浓度的增加od值变化不明显，表明多糖添加量并不是越高其效果越好，可能是因为糖浓度太高导致培养液的渗透压增大，进而导致菌体脱水死亡，反而抑制了菌体的生长。综合考虑，根据培养液的od值，选择浓度为1.5％的多糖作为培养的最佳浓度。

2、硫酸化木聚糖多糖对益生菌生长速率的影响

根据不同浓度的硫酸化木聚糖对益生菌的活性的影响的结果，从德式乳杆菌保加利亚亚种和短乳杆菌两种益生菌生长的od600和ph指标可以得出：在多糖浓度分别为2％和1.5％时增殖情况最佳，因此，按2％或1.5％的浓度添加硫酸化木聚糖、木聚糖和fos分别制作液体培养基，具体步骤为：取4个50ml锥形瓶，分为2组，每组加入配制两种培养基，即mrs培养基和添加2％或1.5％硫酸化木聚糖的mrs培养基，于115℃灭菌30min。分别是加入50ml含fos培养基、第一组加入浓度为1％的500ul短乳杆菌悬液、第二组加入浓度为1％的500ul的德式乳杆菌保加利亚亚种菌悬液，在37℃厌氧条件下培养48h；然后分别以0h、4h、10h、20h、32h、44h、48h取4ml培养液，以培养时间为横坐标，od600和ph值为纵坐标，测定指标，绘制益生菌的生长曲线。

如图8所示，结果显示：在培养时间10-20h时，od600和ph值变化都比较大，说明短乳杆菌此阶段的增殖情况与产酸情况变化较大，此时处于生长旺盛时期；而在44h之后，od600和ph值分别都趋于基本持平，达到平衡，说明此事短乳杆菌进入生长稳定期。

如图9所示，结果显示：在培养时间10-20h时，od600和ph值变化都比较大，说明德式乳杆菌保加利亚亚种此阶段的增殖情况与产酸情况变化较大，此时处于生长旺盛时期；而在44h之后，od600和ph值分别都趋于基本持平，达到平衡，说明此时德式乳杆菌保加利亚亚种进入生长稳定期。

以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。