一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用与流程

本发明属于微生物发酵领域，具体地说，是关于一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
：紫罗兰酮是一种高级香料，是调香中不可或缺的重要的原香料，用途广，需求量大。紫罗兰酮的分子式为c13h20o，根据双键位置的不同，可将紫罗兰酮划分为α体，β体和γ体3种同分异构体，而自然界中多以α体，β体这两种异构的混合形式存在，其中β-紫罗兰酮是用于高档级精细日用化妆品的调香剂和增香剂，也是医药工业上合成维生素a的重要原料。在食品行业中，紫罗兰酮常用作高档食品、饮料的增香剂，是中国gb2760-2011规定允许使用的食用香料，主要用以配制龙眼、树莓、黑莓、樱桃、柑橘等香精，全球年需求量达近万吨。由于国内目前的生产工艺限制，缺口超过1000吨，特别是医药级的，基本全靠进口。产品的市场潜力大，也急需高效的高产方法。目前生产β-紫罗兰酮(β-ionone)的方法主要有化学合成。化学合成法是以柠檬醛和丙酮为原料，经缩合、环化、分离提纯得到的。国外由于原材料的缺乏，主要侧重利用石油化工产品为原料进行合成。而我国的山苍子油年产量已达2000吨，而从山苍子油中可直接提取获得柠檬醛，故我国主要改用该方法进行β-紫罗兰酮的工业合成。但该方法具有总回收率低(仅为40％～45％)、工艺较为复杂、合成周期较长等缺点。相对来讲，生物发酵法生产β-紫罗兰酮在一定程度上克服了化学合成法的缺点，具有生产工艺简单、成本低、产品质量好等优点。β-紫罗兰酮生物体内合成是以β-类胡萝卜素为前体，在类胡萝卜素裂解双加氧酶的催化下合成的。目前发现许多微生物都具有生产类胡萝卜素的能力，而且由解脂耶氏酵母出发构建的工程菌株已经实现了β-类胡萝卜素的高产[cn201210525553.x，cn201410243227.9]。然而，关于β-紫罗兰酮生物异源合成的报道非常少。congqiangzhang等人在大肠杆菌(非gras菌株)中通过引入外源mva途径和表达优化，最终在发酵罐水平获得了500mg/l的β-紫罗兰酮.[congqiangzhangetal.a“plug-n-play”modularmetabolicsystemfortheproductionofapocarotenoids.biotechnolbioeng.2018jan；115(1):174-183.doi:10.1002/bit.26462]；jeffreyj.czajka等人在解脂耶氏酵母中通过引入β-紫罗兰酮合成途径和代谢优化，最终在发酵罐水平获得了380mg/l的β-紫罗兰酮。由于代谢调控机理及宿主本身的限制，β-紫罗兰酮的目前的产量距商业化应用还有一定的距离。解脂耶氏酵母是一种一般安全(generallyrecognizedassafe，gras)的微生物，主要分布在富含脂肪和蛋白质的环境中，因其在脂类和萜类合成上的优势而引起越来越多的研究兴趣。目前，由解脂耶氏酵母工程菌生产的dha和epa两种功能性脂类产品已在杜邦公司实现了商业化生产[wo2012027689]。还有更多的产品正走向工业生产规模的水平，如萜类化合物胡萝卜素的产量已经达4.5g/l的水平[cn201410243227.9]，而且帝斯曼公司也开始利用解脂耶氏酵母进行冷杉醇的合成[wo2016094178]。证明了解脂耶氏酵母在异源表达萜类化合物上有一定的优势，有望开发用于多种萜类香料的合成。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法。该方法是通过强化mva途经和引入磷酸转酮酶途径以提高胞浆中乙酰辅酶a的供应量及其萜类化合物合成通路的代谢流从而成功构建得到高产β-紫罗兰酮基因工程菌。本发明的另一目的在于提供通过上述构建方法获得的高产β-紫罗兰酮基因工程菌。本发明的再一目的在于提供上述高产β-紫罗兰酮基因工程菌的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供的一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：1)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子和所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子；2)构建酵母mva途径相关基因表达模块，所述相关基因表达模块包括解脂耶氏酵母mva途径9个相关基因、所述mva途径9个相关基因上游的启动子和所述mva途径9个相关基因下游的终止子；3)构建磷酸转酮酶途径表达模块，所述磷酸转酮酶途径表达模块包括磷酸转酮酶途径相关的基因、所述磷酸转酮酶途径相关的基因上游的启动子和所述磷酸转酮酶途径相关的基因下游的终止子；4)构建crispr/cas9操作载体，包括导向染色体整合位点的sgrna转录模块、cas9蛋白表达模块和筛选标记；5)将步骤1)所述基因表达模块、步骤2)所述酵母mva途径相关基因表达模块或步骤3)磷酸转酮酶途径表达模块分步与步骤4)相应的所述crispr/cas9操作载体共转化至201810695855.9中构建的产β-紫罗兰酮基因工程菌中，经多轮基因工程操作，获得高产β-紫罗兰酮基因工程菌。根据本发明，步骤1)中所述的基因表达模块还包括如：ku70基因整合位点上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。根据本发明，步骤1)中所述的构建基因表达模块包括以下步骤：1.1通过pcr扩增获得所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段，所述ku70基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；1.2将所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段、所述ku70基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒片段分别通过gibsonassembly组装法进行组装获得基因表达模块。根据本发明的优选实施例，步骤1)中所述β-紫罗兰酮生产相关的基因为carb，carrp，ccd1。根据本发明的优选实施例，所述carb和carrp来源于卷枝毛霉菌，ccd1来源于矮牵牛。根据本发明的优选实施例，步骤1)中所述启动子选自tef1p，exp1p，gpd2p。根据本发明的优选实施例，所述启动子来源于解脂耶氏酵母。根据本发明的优选实施例，步骤1)所述终止子选自xpr2t，lip2t，mig1t。根据本发明的优选实施例，所述终止子来源于解脂耶氏酵母。根据本发明，步骤2)中所述的酵母mva途径相关基因表达模块还包括如：ku80、d17、lip1、pox3、pox5基因整合位点上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。根据本发明，步骤2)中所述的构建酵母mva途径相关基因表达模块包括以下步骤：2.1通过pcr扩增获得所述酵母mva途径相关的9个基因、所述酵母mva途径相关的9个基因上游的启动子片段、所述酵母mva途径相关的9个基因下游的终止子片段，所述ku80、d17、lip1、pox3、pox5基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；2.2将所述酵母mva途径相关的9个基因、所述酵母mva途径相关的9个基因上游的启动子片段、所述酵母mva途径相关的9个基因下游的终止子片段，所述ku80、d17、lip1、pox3、pox5基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒分别通过gibsonassembly组装法进行组装获得酵母mva途径相关基因表达模块。步骤2)中所述酵母mva途径相关的9个基因为ggs1，thmg1，erg8，erg10，erg12，erg13，erg19，erg20，idi。根据本发明的优选实施例，所述ggs1，thmg1，erg8，erg10，erg12，erg13，erg19，erg20，idi来源于解脂耶氏酵母。根据本发明的优选实施例，步骤2)中所述启动子选自tef1p，exp1p，gpd2p。根据本发明的优选实施例，所述启动子来源于解脂耶氏酵母。根据本发明的优选实施例，步骤2)所述终止子选自xpr2t，lip2t，erg8t，erg10t，erg12t，erg13t，erg19t，erg20t，idit。根据本发明的优选实施例，所述终止子来源于解脂耶氏酵母。根据本发明，步骤3)中所述的磷酸转酮酶途径表达模块还包括如：xpr2基因整合位点上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。根据本发明，步骤3)中所述的构建磷酸转酮酶途径表达模块包括以下步骤：3.1通过pcr扩增获得所述磷酸转酮酶途径相关的基因、所述磷酸转酮酶途径相关的基因上游的启动子片段、所述磷酸转酮酶途径相关的基因下游的终止子片段，所述xpr2基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；3.2将所述磷酸转酮酶途径相关的基因、所述磷酸转酮酶途径相关的基因上游的启动子片段、所述磷酸转酮酶途径相关的基因下游的终止子片段，所述xpr2基因整合位点上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒分别通过gibsonassembly组装法进行组装获得磷酸转酮酶途径表达模块。步骤3)中所述的磷酸转酮酶途径相关的基因为pk(磷酸转酮酶基因)和pta(磷酸转乙酰酶基因)。根据本发明的优选实施例，所述pk来源于两岐双岐杆菌，pta来源于枯草芽孢杆菌。根据本发明的优选实施例，步骤3)中所述启动子选自tef1p，gpd2p。根据本发明的优选实施例，所述启动子来源于解脂耶氏酵母。根据本发明的优选实施例，步骤3)所述终止子选自xpr2t，mig1t。根据本发明的优选实施例，所述终止子来源于解脂耶氏酵母。根据本发明的优选实施例，所述可丢失的筛选标记基因表达盒包括筛选标记基因表达盒和筛选标记丢失模块；根据本发明的优选实施例，所述筛选标记基因为ura3。根据本发明的优选实施例，所述筛选标记基因来源于解脂耶氏酵母。根据本发明的优选实施例，所述筛选标记丢失模块为hisg-hisg。根据本发明的优选实施例，所述筛选标记丢失模块来源为pnky51质粒(addgene编号：14839)。根据本发明，步骤4)中所述的构建crispr/cas9操作载体包括以下步骤：通过在线设计染色体整合位点的sgrna靶序列，将sgrna靶序列引入到引物中，通过pcr的方法，将sgrna靶序列引入到crispr/cas9操作载体上。根据本发明的优选实施例，步骤4)中所述载体以pcas1yl为出发载体。根据本发明的优选实施例，所述sgrna靶序列设计网站为：http://e-crisp-test.dkfz.de/e-crisp/designcrispr.html。根据本发明的优选实施例，所述染色体整合位点可以为染色体上的非必需基因位点，优选ku70、ku80、d17、lip1、pox3、pox5、xpr2位点。优选的，所述的ku70位点的sgrna靶序列为aactcttcataaggccttggagg，seqidno：1；所述的ku80位点的sgrna靶序列为tcctagccagaacaaccttcagg，seqidno：2；所述的d17位点的sgrna靶序列为tccgtaatataggtgacgacagg，seqidno：3；所述的lip1位点的sgrna靶序列为gctcggcaaccaggaatggaagg，seqidno：4；所述的pox3位点的sgrna靶序列为cccttgtaccggtagctaatagg，seqidno：5；所述的pox5位点的sgrna靶序列为cctctgacttcaccctatccagg，seqidno：6；所述的xpr2位点的sgrna靶序列为gctggactctctggtcgacgagg，seqidno：7；其中，下划线部分为pam位点。优选的，所述的sgrna序列如201810695855.9中序列表的seqidno：1所示。一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌，通过上述构建方法构建得到。优选的，所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌，名称为解脂耶罗维亚酵母(yarrowialipolytica)ylbi3118，其保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期：2019年07月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno：18286。根据本发明，通过上述构建方法构建得到的高产β-紫罗兰酮基因工程菌在常规发酵条件下都可以生产得到β-紫罗兰酮。优选的，本发明选用ypdm作为培养基，在发酵罐中采用连续补料的批次发酵方法，并控制较高溶氧。具体包括如下步骤：将高产β-紫罗兰酮基因工程菌的过夜培养种子液接种至初始培养基ypdm，初始od600值控制为0.2，初始体积为1.2l，有机相为正十二烷(10％v/v)，温度为20℃，转速为400rpm，ph控制为5.5；当溶氧下降到20～22％时，以20ml/hour流加250ml的10×ypdm，当溶氧下降至12～18％(优选为15％)，通过溶氧转速联动控制溶氧的稳定，流加结束后以0.1ml/min的速度补加600g/l葡萄糖，发酵培养16～18d(优选为17d)。所述的高产β-紫罗兰酮基因工程菌在发酵生产β-紫罗兰酮中的应用，尤其可应用于利用多种碳源为底物发酵生产β-紫罗兰酮。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明以解脂耶氏酵母为底盘细胞，将β-紫罗兰酮表达模块(约14.5kb)线性化后转入解脂耶氏酵母体内并整合到设计的染色体整合位点位置，具有简单快速高效的优点，2～3周即可获得大片段整合工程菌株，明显缩短工程菌构建周期。并在此工程菌株的基础上，将mva途径中9个相关基因整合至其染色体相关位点，以增强甲羟戊酸代谢途径代谢强度，进一步增强β-紫罗兰酮产量；(2)本发明以(1)中所获工程菌为基础，将磷酸转酮酶途径(pk-pta途径)整合至xpr2位点，该途径可以在细胞质将通过两步反应将f6p转化为乙酰辅酶a，提高碳原子利用率和乙酰辅酶a产量，以提高胞质中乙酰辅酶a的供应量，进一步提高β-紫罗兰酮产量；最终获得高产β-紫罗兰酮的基因工程菌株。按照本发明的方法获得的基因工程菌的β-紫罗兰酮的摇瓶发酵产量可达到约358mg/l，3l发酵罐产量可达到约0.98g/l，接近商业化生产水平，具有良好的工业应用前景。(3)本发明可利用简单培养基发酵生产香料β-紫罗兰酮，可实现多基因一次性高效转化与整合，可明显缩短工程菌构建时间，所得工程菌可利用葡萄糖、甘油等简单碳源进行香料β-紫罗兰酮的发酵生产，有较好的应用前景。附图说明图1是β-紫罗兰酮在解脂耶氏酵母体内的合成途径示意图。图2是整合在ku70位点的β-紫罗兰酮基因表达模块的组装顺序示意图，其中，huh表示hisg-ura3-hisg。图3是酵母mva途径相关基因表达模块的组装顺序示意图，其中，a为整合在ku80位点的ggs1整合片段组装顺序示意图，b为整合在d17位点的thmg1整合片段组装顺序示意图，c为整合在lip1位点的erg10-erg13整合片段组装顺序示意图，d为整合在pox3位点的idi-erg20整合片段组装顺序示意图，e图为整合在pox5位点的erg8-erg12-erg19整合片段组装顺序示意图；huh表示hisg-ura3-hisg。图4是整合在xpr2位点的磷酸转酮酶途径表达模块示意图，该模块共有一个整合片段，huh表示hisg-ura3-hisg。图5是crispr/cas9操作载体pcas1yl-ku70的示意图，可根据实际需求通过引物设计替换为ku80、d17、lip1、pox3、pox5、xpr2。图6是整合了mva途径相关基因和磷酸转酮酶途径相关基因的工程菌的pcr鉴定结果图，其中，图中标注为1、2、3、4、5、6分别代表6个不同单克隆子，各基因部分序列扩增结果如图6中标注。图7是β-紫罗兰酮工程菌摇瓶及发酵罐发酵的产量图；其中，a为β-紫罗兰酮基因工程菌以不同碳源为底物摇瓶发酵产量结果；b图为β-紫罗兰酮基因工程菌以不同氮源为底物摇瓶发酵产量结果；c为3l发酵罐发酵的产量结果；mg/l表示每l发酵液中的β-紫罗兰酮含量；mg/gdcw表示每g细胞干重(dcw)中的β-紫罗兰酮含量。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。β-紫罗兰酮在解脂耶氏酵母体内的合成途径示意图，如图1所示。实施例1实验方案及引物设计本实施例的实验方案设计如下：在专利“201810695855.9、一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用”中公开的产β-紫罗兰酮基因工程菌的基础上，以ura3基因作为筛选标记，选择酵母染色体非必需基因位点作为整合位点，通过整合过表达与甲羟戊酸(mva)途径相关的9个基因以及再整合一个β-紫罗兰酮表达盒，并同时引入能在胞浆中通过两步反应将果糖-6-磷酸转化生成乙酰辅酶a的磷酸转酮酶途径，以提高原工程菌中β-紫罗兰酮的产量。各基因模块的组装顺序如图2～4所示。crispr/cas9操作载体，以pcas1yl(addgene编号73226)为出发载体，构建如图5所示。利用gibsonassembly的方法构建以下基因表达模块和crispr/cas9操作载体：ku70up-tef1p-carb-xpr2t-exp1p-carrp，lip2t-gpd2p-ccd1-mig1t，hisg-ura3-hisg-ku70down；d17up-hisg-ura3-hisg，exp1p-thmg1-lip2t-d17down；ku80up-hisg-ura3-hisg，tef1p-ggs1-xpr2t-ku80down；lip1up-tef1p-erg10-erg10t，gpd2p-erg13-erg13t，hisg-ura3-hisg-lip1down；pox3up-exp1p-idi-idit，tef1p-erg20-erg20t，hisg-ura3-hisg-pox3down；pox5up-exp1p-erg8-erg8t，tef1p-erg12-erg12t，gpd2p-erg19-erg19t，hisg-ura3-hisg-pox5down；xpr2up-hisg-ura3-hisg，gpd2p-b.bpk-mig1t，tef1p-b.cpta-xpr2t-xpr2down；pcas1yl-ku70-1，pcas1yl-ku70-2；pcas1yl-ku80-1，pcas1yl-ku80-2；pcas1yl-d17-1，pcas1yl-d17-2；pcas1yl-lip1-1，pcas1yl-lip1-2；pcas1yl-pox3-1，pcas1yl-pox3-2；pcas1yl-pox5-1，pcas1yl-pox5-2；pcas1yl-xpr2-1，pcas1yl-xpr2-2。各dna片段信息如表1所示：表1各dna片段信息其中，表1中的启动子tef1p的序列如201810695855.9中序列表的seqidno：6所示，启动子exp1p的序列如201810695855.9中序列表的seqidno：9所示，启动子gpd2p的序列如201810695855.9中序列表的seqidno：12所示；终止子xpr2t的序列如201810695855.9中序列表的seqidno：8所示，终止子lip2t的序列如201810695855.9中序列表的seqidno：11所示，终止子mig1t的序列如201810695855.9中序列表的seqidno：14所示；hisg-ura3-hisg的序列是201810695855.9中序列表的seqidno：4与seqidno：5组装得到，长度为4230bp。pcas1yl-ku70-1的序列如seqidno：10所示，可根据实际需求通过表2的引物替换为ku80、d17、lip1、pox3、pox5、xpr2，分别得到pcas1yl-ku80-1、pcas1yl-d17-1、pcas1yl-lip1-1、pcas1yl-pox3-1、pcas1yl-pox5-1、pcas1yl-xpr2-1的序列；pcas1yl-ku70-2的序列如seqidno：11所示，可根据实际需求通过表2的引物替换为ku80、d17、lip1、pox3、pox5、xpr2，分别得到pcas1yl-ku80-2、pcas1yl-d17-2、pcas1yl-lip1-2、pcas1yl-pox3-2、pcas1yl-pox5-2、pcas1yl-xpr2-2的序列；按照gibsonassembly组装的技术要求，使用oligo6设计pcr引物序列用于扩增以上各dna片段，引物序列如表2所示。表2引物序列实施例2基因工程菌的构建2.1基因的获得：β-紫罗兰酮合成基因选择来源于卷枝毛霉菌的carb，carrp和来源于矮牵牛的ccd1，经密码子优化，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；参照201810695855.9中实施例2的步骤2.1，分别扩增获得carb，carrp，ccd1基因片段；其序列分别如201810695855.9中序列表的seqidno：7、10、13所示。mva途径相关基因选择来源于解脂耶氏酵母内源基因，利用表2中的引物，以酵母基因组为模板，分别扩增获得ggs1(cp028451.1：2084792-2085775)，thmg1(cp028452.1：571078-572577)[该基因在使用时需在标注中的序列5′端添加起始密码子atg]，erg8(cp028452.1：746796-748052)，erg10(cp028449.1：1141697-1143297)，erg12(cp028449.1：2082357-2083706)，erg13(cp028453.1：3780129-3781469)，erg19(cp028459.1：814770-815933)，erg20(cp028452.1：672034-673068)，idi(cp028459.1：584544-585356)基因片段。磷酸转酮酶途径相关基因选择来源于两岐双岐杆菌的pk(记为b.bpk)和来源于枯草芽孢杆菌的pta(记为b.cpta)，经密码子优化，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；利用表2中的引物，分别扩增获得pk和pta基因片段。其序列分别如seqidno：8、9所示。表1中的整合位点片段ku70up(cp028450.1：1161989-1162774))、ku70down(cp028450.1:1161089-1161838)、ku80up(cp028452.1：250546-251257)、ku80down(cp028452.1：251492-252275)、d17up(cp017556.1：2136781-2137777)、d17down(cp017556.1：2137804-2138693)、lip1up(cp028453.1：1337171-1338184)、lip1down(cp028453.1：1339278-1340365)、pox3up(cp017558.1：3274887-3275787)、pox3down(cp017558.1：3277388-3278291)、pox5up(cp017558.1：3286007-3287003)、pox5down(cp017558.1：3288682-3289700)、xpr2up(cp017558.1：3949231-3950223)，xpr2down(cp017558.1：3948204-3949167)，均来源于解脂耶氏酵母。表1中的终止子erg8t(cp028452.1：746517-746795)、erg10t(cp028458.1：1351217-1351623)、erg12t(cp028449.1：2083707-2084123)、erg13t(cp028453.1：3781470-3781902)、erg19t(cp028453.1：819934-820310)、erg20t(cp017557.1：674471-674873)、idit(cp028459.1：584190-584543)，均来源于解脂耶氏酵母。2.2酵母基因组dna的提取解脂耶氏酵母po1f(解脂耶氏酵母yarrowialipolyticapo1f，购至yeasternbiotech公司，还在专利“201810695855.9、一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用”中公开)基因组的提取方法如下：从新鲜复苏的平板中挑取单克隆菌落接于5mlypd液体培养基试管，28℃，250rpm，培养24小时，收集1ml菌液，使用酵母基因组提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组。质粒的提取方法如下：接种含有相应质粒的dh5α菌于5mllb液体培养基，其中含有氨苄青霉素终浓度为50μg/ml，37℃，220rpm，过夜培养约14小时，使用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)抽提质粒。2.3表2所述dna片段的pcr扩增各dna片段的pcr扩增均使用q5高保真dna聚合酶(购自newenglandbiolabs公司)，按照50μlpcr体系配制pcr扩增反应液(表3)。表3pcr扩增反应液配制体系成分体积(μl)5×q5reactionbuffer10dntps(10mm)2q5high-fidelitydnapolymerase0.5引物f(20μm)1.25引物r(20μm)1.25模板dna1ngddh2o补齐至50pcr程序设置参照说明书并根据引物tm值设置退火温度值。将pcr产物使用超薄dna产物纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化回收片段，-20℃保存备用。2.4基因表达模块的构建将2.3中获得的dna片段通过gibsonassembly组装方法构建以下各表达模块，ku70up-tef1p-carb-xpr2t-exp1p-carrp，lip2t-gpd2p-ccd1-mig1t，hisg-ura3-hisg-ku70down，所采用的试剂为gibsonassemblymastermix(购自newenglandbiolabs公司)。在获得各表达模块后，再通过gibsonassembly按顺序进行组装，构建β-紫罗兰酮表达模块：ku70up-tef1p-carb-xpr2t-exp1p-carrp-lip2t-gpd2p-ccd1-mig1t-hisg-ura3-hisg-ku70down，简称为ku70up-carb-carrp-ccd1-huh-ku70down，示意图如图2所示。构建得到的重组子通过pcr和测序验证正确。其中，以puc19(addgene编号：50005)为克隆载体。2.5酵母mva途径相关基因表达模块将2.3中获得的dna片段通过gibsonassembly组装方法构建以下各表达模块，d17up-hisg-ura3-hisg，exp1p-thmg1-lip2t-d17down；ku80up-hisg-ura3-hisg，tef1p-ggs1-xpr2t-ku80down；lip1up-tef1p-erg10-erg10t，gpd2p-erg13-erg13t，hisg-ura3-hisg-lip1down；pox3up-exp1p-idi-idit，tef1p-erg20-erg20t，hisg-ura3-hisg-pox3down；pox5up-exp1p-erg8-erg8t，tef1p-erg12-erg12t，gpd2p-erg19-erg19t，hisg-ura3-hisg-pox5down。所采用的试剂为gibsonassemblymastermix(购自newenglandbiolabs公司)。在获得各模块后，再通过gibsonassembly按顺序进行组装，构建6个整合片段模块：ku80up-huh-ggs1-ku80down(见图3a)；d17up-huh-thmg1-d17down(见图3b)；lip1up-erg10-erg13-huh-lip1down(见图3c)；pox3up-idi-erg20-huh-pox3down(见图3d)；pox5up-erg8-erg12-erg19-huh-pox5down(见图3e)。构建得到的重组子通过pcr和测序验证正确。其中，以puc19(addgene编号：50005)为克隆载体。2.6构建磷酸转酮酶途径表达模块将2.3中获得的dna片段通过gibsonassembly组装方法构建以下各表达模块，xpr2up-hisg-ura3-hisg，gpd2p-b.bpk-mig1t，tef1p-b.cpta-xpr2t-xpr2down。所采用的试剂为gibsonassemblymastermix(购自newenglandbiolabs公司)。在获得各片段后，再通过gibsonassembly按顺序进行组装，构建磷酸转酮酶途径表达模块：xpr2up-huh-b.bpk-b.cpta-xpr2down，示意图如图4所示。构建得到的重组子通过pcr和测序验证正确。其中，以puc19(addgene编号：50005)为克隆载体。2.7crispr/cas9操作载体的构建参照专利“201810695855.9、一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用”中实施例2的步骤2.5，按相同方法构建获得pcas1yl-ku70(如图5所示)、pcas1yl-ku80、pcas1yl-d17、pcas1yl-lip1、pcas1yl-pox3、pcas1yl-pox5、pcas1yl-xpr2。构建得到的重组子通过pcr和测序验证正确。2.8基因表达模块和相应crispr/cas9操作载体共转化至产β-紫罗兰酮基因工程菌＝采用化学转化方法将2.5中获得的酵母mva途径相关基因表达模块ku80up-huh-ggs1-ku80down和2.7中获得的crispr/cas9操作载体pcas1yl-ku80转化至201810695855.9获得的产β-紫罗兰酮基因工程。操作方法如下：挑取单克隆菌落接于10mlypd液体培养基，28℃，250rpm，培养至od600达到0.8～1.0，500×g，4min离心收集菌体，弃尽上清。按照酵母感受态细胞制备试剂盒(frozen-ezyeasttransformationii，购自zymo公司)说明书步骤制得转化感受态细胞。取20μl感受态细胞并加入dna片段400ng，按说明书步骤进行转化，涂布于缺尿嘧啶和亮氨酸的sd固体培养基，于28℃培养3～4天。2.9鉴定β-紫罗兰酮显微黄色，因此产β-紫罗兰酮的菌株会有颜色变化。在转化平板上挑选显微黄色的菌株，按2.2中的基因组提取方法提取基因组为pcr模板，并将上下游引物设计在启动子和各基因编码框区域，进行pcr扩增目的基因片段，经电泳分析，结果如图6所示，成功获得整个所有片段的β-紫罗兰酮工程菌株。2.10ura3抗性丢失将含有hisg-ura3-hisg筛选标记的整合子接种到5mlypd液体培养基，30℃培养过夜，至od600约1～2，用ypd稀释1000倍后取100μl涂布于含有1mg/ml5-氟乳清酸的ypd固体平板上，30℃培养2～3天，挑取其中颜色较深的较大单克隆分别划线于sd和sd/△ura固体培养基中，获得ura3成功丢失的菌株并进行菌落pcr鉴定筛选得到阳性整合子，进行下一阶段工程菌株的构建。重复步骤2.8、2.9和2.10，将酵母mva途径相关基因表达模块d17up-huh-thmg1-d17down和pcas1yl-d17转化至2.9鉴定成功的菌株上，然后再将酵母mva途径相关基因表达模块lip1up-erg10-erg13-huh-lip1down与pcas1yl-lip1，酵母mva途径相关基因表达模块pox3up-idi-erg20-huh-pox3down与pcas1yl-pox3，酵母mva途径相关基因表达模块pox5up-erg8-erg12-erg19-huh-pox5down与pcas1yl-pox5，磷酸转酮酶途径表达模块xpr2up-huh-pk-pta-xpr2down与pcas1yl-xpr2，β-紫罗兰酮表达模块ku70up-carb-carrp-ccd1-huh-ku70down与pcas1yl-ku70，依次转化至上一轮转化鉴定成功且ura3成功丢失的菌株上，最终获得高产β-紫罗兰酮基因工程菌，名称为解脂耶罗维亚酵母(yarrowialipolytica)ylbi3118，其保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期：2019年07月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno：18286。实施例3基因工程菌的发酵及β-紫罗兰酮的检测3.1发酵种子液培养方法如下：选取实施例2中最终构建的高产β-紫罗兰酮基因工程菌，挑选单克隆，接种到ypd培养液中(50ml/250ml锥形瓶)，28℃，250rpm，培养至od600为3～5。摇瓶发酵培养方法如下：将种子液接种到20mlypd培养基中(50ml摇瓶)，初始od600值为0.1，有机相为正十二烷(10％v/v)，20℃，250rpm，培养12天。碳源选择葡萄糖(d-glucose)，蔗糖(sucrose)，淀粉(starch)，甘油(glycerol)，油酸(oilacid)，浓度为20g/l。氮源选择tryptone(胰蛋白胨)和peptone(蛋白胨)。当使用tryptone作为氮源时，培养基命名为ypdm，各成分浓度均与ypd保持一致。发酵罐(3l)发酵培养方法如下：将过夜培养种子液接种至初始培养基ypdm，初始od600值控制为0.2，初始体积为1.2l，有机相为正十二烷(10％v/v)，温度为20℃，转速为400rpm，ph控制为5.5。当溶氧下降到20％时，以20ml/hour流加250ml的10×ypdm，当溶氧下降至15％左右，通过溶氧转速联动控制溶氧的稳定，流加结束后以0.1ml/min的速度补加600g/l葡萄糖，定时取样，并制备样品。3.2β-紫罗兰酮的检测发酵结束后，小心吸取发酵液上层有机相，12000rpm离心5min，吸取1ml上清液至一新1.5ml离心管，经0.22μm滤头过滤至气相瓶，进行气相色谱检测。内参为异长叶烯(终浓度为200μm)。气相色谱检测方法如下：仪器型号：安捷伦7890a；分析柱：db-ffap毛细管柱(60m×0.25mmid,0.25μmfilmthickness或j&wscientific,agilenttechnologies)；进样量：1μl；升温程序：80℃保持1min；以10℃/min上升到120℃，保持1min；再以10℃/min上升到240℃，保持18min；程序结束。3.3β-胡萝卜素的检测样品制备：离心收集一定量菌体于1.5mlep管，用0.7mldmso重悬菌体，55℃温浴10分钟；再加入0.7ml丙酮，45℃温浴15分钟；12000rpm离心5分钟，吸取上清液经0.22μm滤头过滤至气相瓶，进行hplc检测。hplc检测方法如下：仪器：安捷伦1260高效液相色谱；检测器：紫外检测器；检测波长：450nm；流动相组成：甲醇：乙腈：二氯甲烷＝42：42：16；流速为1.0ml/min，温度为30℃，检测时间为16分钟。3.3β-紫罗兰酮的产量测定经过检测，通过以上步骤构建的基因工程菌在以葡萄糖为碳源，胰蛋白胨和酵母抽提物为氮源时，β-紫罗兰酮摇瓶产量可达358±25mg/l，发酵罐产量达0.98g/l。产β-紫罗兰酮工程菌发酵产量如图7所示，其中，a为β-紫罗兰酮基因工程菌以不同碳源为底物摇瓶发酵产量结果；b为β-紫罗兰酮基因工程菌以不同氮源为底物摇瓶发酵产量结果；c为3l发酵罐发酵的产量结果。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南理工大学<120>一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用<160>127<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ku70位点的sgrna靶序列<400>1aactcttcataaggccttggagg23<223>ku80位点的sgrna靶序列<400>2tcctagccagaacaaccttcagg23<223>d17位点的sgrna靶序列<400>3tccgtaatataggtgacgacagg23<223>lip1位点的sgrna靶序列<400>4gctcggcaaccaggaatggaagg23<223>pox3位点的sgrna靶序列<400>5cccttgtaccggtagctaatagg23<223>pox5位点的sgrna靶序列<400>6cctctgacttcaccctatccagg23<223>xpr2位点的sgrna靶序列<400>7gctggactctctggtcgacgagg23<223>b.bpk<400>8atgactagccccgtgatcggcacaccctggaagaagctgaacgcccccgtctctgaggag60tcccttgagggcgttgacaagtactggcgagttgctaactacctgtctatcggtcagatc120tacctccgatctaaccccctgatgaaggcccccttcacccgagaggatgtgaagcaccga180ctggtgggccactggggtaccactcccggtctgaacttcctcattggccacattaaccga240ttcatcgctgaccacggccagaacaccgtcatcattatgggccctggccacggtggccct300gccggtacttcccagtcctacctggacggtacctacaccgagaccttccccaagatcacc360aaggacgaggccggccttcagaagttcttccgacagttctcataccctggaggaatcccc420tcgcatttcgcccctgagacccctggctcgatccacgagggcggtgagcttggctacgcc480ctcagccacgcctacggcgccattatggacaacccctcgctgttcgtccctgctattgtc540ggtgacggagaggccgagaccggccctctcgccacgggatggcagtccaacaagctcgtc600aacccccgaaccgacggaatcgtcctgcccatcctccacctgaacggttacaagatcgct660aaccctaccatcctgtctcgaatctccgacgaggagctgcatgaattcttccacggtatg720ggttacgagccctacgagttcgtcgccggttttgacgacgaggaccacatgtccattcac780cgacgattcgccgagctctgggagaccatctgggacgagatctgcgacattaaggcagcc840gctcagactgacaacgttcatcggcccttctaccccatgctgatctttcggacccccaag900ggctggacctgtcctaagtacattgacggcaagaagaccgagggctcctggcgagctcac960caggtgcccctggcctccgcccgagacactgaggcccactttgaggttctcaagaactgg1020ctggagtcgtacaagcctgaggaactgtttgacgccaacggcgccgtgaaggatgacgtc1080ctcgccttcatgcccaagggtgagctccgaatcggcgctaacccgaacgctaacggcggc1140gtcattcgagatgacctgaagctgcccaacctggaagactacgaggtgaaggaggtcgct1200gagtacggtcatggatggggccagctggaggctacccgaaccctcggcgcctacacacgg1260gacatcatccgaaacaaccccagagacttccgaattttcggtcccgacgagaccgcctct1320aacagactccaggccagctacgaggtgaccaacaagcagtgggacgccggctacatttcc1380gatgaggtcgacgagcacatgcatgtctccggccaggtcgtggagcagctctctgagcac1440cagatggagggcttccttgaggcttaccttctgaccggccgacacggcatttggtcctcc1500tacgagtccttcgttcacgtgattgactccatgctgaaccagcacgccaagtggctcgag1560gccaccgtccgggagatcccttggcgaaagcccatcgcctccatgaacctgctcgtgtcc1620tctcacgtctggcgacaggaccacaacggtttctctcaccaggaccccggtgtgacctct1680gtccttctgaacaagtgcttccacaacgaccacgttatcggcatctacttcgccactgac1740gctaacatgctcctcgccattgctgagaagtgctacaagtccaccaataagatcaacgct1800atcatcgccggaaagcagcctgctgccacctggctcaccctggacgaggcccgagctgag1860ctggcaaagggcgccgccgcctgggactgggcttctaccgccaagaacaacgacgaggcc1920gaggttgtcctggccgccgctggagacgtccccacccaggagatcatggccgcttcggac1980aagctgaaggagctcggcgtgaagttcaaggtcgtcaacgtcgctgacctgctgtccctg2040cagtctgctaaggagaacgacgaggccctgtccgacgaggagttcgccgacattttcacc2100gccgacaagcccgtcctgttcgcctaccactcttacgcccacgacgtccgaggcctgatc2160tacgaccgacccaaccacgacaactttaacgtccacggttacgaggaggagggctctacc2220accaccccctacgatatggtccgagtgaaccgaatcgaccgatacgagctgaccgccgag2280gctctgcgaatgatcgacgctgacaagtacgccgacaagatcgacgagctggagaagttc2340cgagacgaggccttccagttcgccgtcgacaagggctacgaccaccccgactacactgac2400tgggtgtactccggcgtgaacaccgacaagaagggcgccgtgaccgccaccgccgctacc2460gccggcgacaacgagtaa2478<223>b.cpta<400>9atggttgccgacctgttctccaccgtccaggagaaggtcgccggcaaggacgtgaagatc60gtcttccccgagggcctggacgagcgaatcctggaggccgtctccaagctcgcaggcaac120aaggtcctgaaccccatcgtgattggcaacgagaacgagatccaggccaaggccaaggag180ctgaacctgaccctgggcggcgtgaagatctacgacccccacacctacgagggcatggag240gatctggtgcaggccttcgtcgagcgacgaaagggcaaggccaccgaggagcaggcccga300aaggccctgctggacgagaactacttcggtaccatgctggtctacaagggcctggctgac360ggcctggtctccggcgccgcccactccaccgccgacaccgtgcgacccgccctgcagatc420atcaagaccaaggagggtgtgaagaagacctccggtgtcttcatcatggcccgaggcgag480gagcagtacgtcttcgccgactgtgccatcaacatcgcccccgactcccaggacctggcc540gagatcgccattgagtccgccaacaccgctaagatgttcgacatcgagccccgagttgcc600atgctctccttctccaccaagggctctgccaagtccgacgagaccgagaaggtggccgac660gccgtcaagattgccaaggagaaggcccccgagctgaccctcgacggcgagttccagttc720gacgccgccttcgtcccctctgtcgccgagaagaaggcccctgactccgagatcaagggc780gacgccaacgtcttcgtcttcccctccctcgaagccggcaacatcggctacaagatcgct840cagcgactgggaaactttgaggccgttggtcccattctgcagggactgaacatgcctgtt900aatgatctgtctagaggttgtaacgctgaggacgtttacaacctggctctgattaccgcc960gctcaggctctgtaa975<223>pcas1yl-ku70-1<400>10gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagt60ggcaccgagtcggtgcttttggccggcatggtcccagcctcctcgctggcgccggctggg120caacatgcttcggcatggcgaatgggaccactggccggtcgataatttaacgtgctgagc180tcagcacacgcattgcccattggctgtatatagatgaatgtaatgataccgtaagagaat240gagagcacggtattgtattacaggggattaagtacacattacttggagttctgtaccaga300agacactactatacatggtatcacttacattagagtcggtgaccgtattcgtctcgtata360gacataatattttcctaccccacattgttcctgggccttcggagcacatctacagtgagt420gactgtttcagttgagcttgaggggttaagtaagtgggggaagggtttgcgattctgaaa480aagagcatgactaatctctctgtggaggagcaatgaagtcacgtgatgcaatcataccgg540tgtatcggatctgcctgggtgtctgattactaatcatttactcacctgttttccccagct600atctcatccatctcagagcctcggcccagccttcggcccttttgggtttgtcgacagaga660ccgggttggcggcgtatttgtgtcccaaaaaacagccccaatt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