一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域中一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法。

背景技术：

神经节苷脂(gls)是一种含唾液酸的酸性鞘糖脂，由鞘氨醇、脂肪酸和低聚糖链组成。神经节苷脂在多种生物过程中发挥重要作用。其中，单唾液酸四己糖神经节苷脂(gm1)能穿透血脑屏障，对脑疾病有很好的治疗作用，临床上已用于治疗阿尔茨海默病、帕金森病、中风等神经系统疾病。gls广泛分布于哺乳动物组织，尤其是脑和神经组织。1957年，folch等人用溶剂萃取法从各种组织中提取总脂提取物。作为一种强有力的工具，色谱法被广泛用于从组织中分离纯化gls，如单级硅酸柱、多孔硅胶柱、反相lyrsrorbrp8或bordapkrp18柱、deae-sephadexa25柱和医珠微珠adso，rip液相色谱法、lipsep凝胶色谱法、sephadexlh-20和硅胶离心液相色谱法。上述方法虽然大大促进了gls的分离纯化，但仍存在操作步骤复杂、成本高、环境污染、收率低、检测手段复杂等问题。

在我国，gm1注射液的原料为猪脑。gm1的天然含量很低，占猪脑湿组织的0.02％，单纯依靠从大脑中提取制备gm1是比较困难并且成本较高。根据结构相似性，可以从多唾液酸神经节苷脂gd1a、gd1b和gt1b中除去末端唾液酸制备gm1。该过程可采用化学水解法和酶水解法。化学水解法的优点是方法简单，易于实现，缺点是反应专一性差，副产物多，并且对环境具有一定的污染性。酶是一种催化剂，具有一些优良的性质(高活性、选择性和特异性)，可以执行最复杂的化学过程。唾液酸酶(neuraminidases，ec3.2.1.18)广泛分布于生物体内，参与唾液酸的代谢。科学家们已经做出了更多的努力，用唾液酸酶产生菌或者重组唾液酸酶将gls转化为gm1，再利用适当的方法进行纯化。酶转化法优势明显，但是也存在一定的问题，利用唾液酸酶产生菌直接转化，会引入微生物产生的次生代谢产物，利用重组唾液酸酶则成本较高，这些因素都导致了gm1注射液价格较高，影响了gm1的临床应用。

超临界co2萃取(sce)，采用无污染的co2在超临界状态下的特殊溶解能力，通过合适的携带剂可以实现gls的提取，并且在恢复常压后以气体形式排放，对环境友好性高。从生物实体到工业反应器的酶工程是一个非常令人兴奋的目标。幸运的是，固定化，已被揭示为一个非常强大的工具，以改善几乎所有的酶性能，它还可以让酶的回收和再利用很容易。酶固定化的基本方法可分为五种：吸附法、共价结合法、包埋法、微胶囊法和交联法。可重复使用的固定化酶由于其高效的重复使用和反应器过程控制，可以降低工业生产成本。

技术实现要素：

本发明的目的是解决上述技术中的不足，并提供一种简单、高效、低毒性、低污染的单唾液酸四己糖神经节苷脂(gm1)制备方法，减少制备过程中氯仿的使用量，提高gm1的得率。

为达到上述目的，本发明所设计的具体方法如下：

1、将猪脑组织洗净除杂匀浆，加入3-4倍体积的预冻在-20℃的丙酮，离心，将新鲜猪脑制备为脑丙酮粉，将丙酮溶液回收。

2、将上述方法中获得的丙酮粉装入提取袋中，放入二氧化碳超临界萃取仪(sce)的提取釜中，泵入乙醇溶液携带剂，调温，加压。在提取时间结束后，减压调温，经分离釜获得脑总脂，减压干燥获得脑总脂干粉。

3、将上述方法获得的脑总脂干粉与等重硅胶粉混合，上样于硅胶柱，通过洗脱获得总神经节苷脂。洗脱溶剂为乙酸乙酯-甲醇溶液，溶液比例为1：1(v:v)。

4、将zl201410254870.1方法制备的重组唾液酸水解酶，加入海藻酸钠和羧甲基纤维素钠制备为固定化酶。

5、将上述方法3中的总神经节苷脂溶解，加入方法4中的固定化酶反应。反应结束后，离心，上清液膜过滤除盐后，冷冻干燥，沉淀中固定化酶回收。

6、将上述方法中的转化产物经反向硅胶柱层析纯化后，紫外220nm测量吸光值，根据吸收光谱回收，干燥获得gm1纯品。

附图说明

图1为固定化重组唾液酸酶形状，利用游标卡尺测量外径。

图2为单唾液酸四己糖神经节苷脂(gm1)反相硅胶纯化的紫外吸收图谱，吸收峰依次为杂质吸收峰，gm1的两种脂肪酸链分子吸收峰。

图3为gm1纯化结果液相色谱图，曲线1为纯化gm1图谱，曲线2为固定化酶转化后产物图谱，曲线3为总神经节苷脂图谱，曲线4为神经节苷脂标准品图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

重组唾液酸酶有东北师范大学构建，发明专利号zl201410254870.1。

实施例1、单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备

1、脑粉制备。将猪脑组织10000g，洗净除去碎骨等杂质，高速匀浆。加入3倍体积的-20℃预冻丙酮，搅拌均匀，3000rpm离心，沉淀再加入少量丙酮再次离心，丙酮倒出减压蒸馏回收。沉淀在常温条件下减压干燥，得到干燥脑粉2003g。

2、总神经节苷脂的制备。将干燥的丙酮粉放入800目物料袋，放入超临界萃取反应釜。泵入3倍体积的携带剂，携带剂选用70％乙醇溶液。升温至60℃，加压萃取，压力30mpa，提取时间2小时。减压分离后重复上述步骤1次，将2次提取液合并浓缩，减压干燥。将干燥样品中加入等重量硅胶粉，加入少量溶剂a混合均匀后，干法上样于已平衡好硅胶柱。利用溶剂a洗脱，收集总神经节苷脂级份，减压浓缩干燥。溶剂a为乙酸乙酯：甲醇＝1:1(v：v)

3、固定化酶的制备。以海藻酸钠作为重组唾液酸酶包埋剂进行固定化酶制备，本发明使用的重组唾液酸酶为专利zl201410254870.1方法制备的重组唾液酸水解酶。海藻酸钠和羧甲基纤维素钠的浓度分别为1.6％和0.2％，唾液酸酶的浓度为1mg/ml。

4、单唾液酸四己糖神经节苷脂的生物转化制备。将以固定化的酶(小球状)和总神经节苷脂加入醋酸缓冲液(ph5.0)中，并在34℃下搅拌2h，然后过滤分离小球，用醋酸缓冲液洗涤固定化酶留用。上清液经膜过滤除盐后，冷冻干燥。

5.转化产物中gm1的纯化。将转化产物上样于反相硅胶柱，利用90％甲醇水溶液洗脱，以220nm紫外检测，根据洗脱曲线收集样品，减压浓缩后干燥，获得纯品gm1，5.5g。

实施例2、单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备

1、脑粉制备。将猪脑组织10000g，洗净除去碎骨等杂质，高速匀浆。加入4倍体积的-20℃预冻丙酮，搅拌均匀，3000rpm离心，沉淀再加入少量丙酮再次离心，丙酮倒出减压蒸馏回收。沉淀在常温条件下减压干燥，得到干燥脑粉1998g。

2.总神经节苷脂的制备。将干燥的丙酮粉放入800目物料袋，放入超临界萃取反应釜。泵入3倍体积的携带剂，携带剂选用75％乙醇溶液。升温至60℃，加压萃取，压力30mpa，提取时间2小时。减压分离后重复上述步骤1次，将2次提取液合并浓缩，减压干燥。将干燥样品中加入等重量硅胶粉，加入少量溶剂a混合均匀后，干法上样于已平衡好硅胶柱。利用溶剂a洗脱，收集总神经节苷脂级份，减压浓缩干燥。

3.固定化酶的制备。以海藻酸钠作为重组唾液酸酶包埋剂进行固定化酶制备，本发明使用的重组唾液酸酶为专利zl201410254870.1方法制备的重组唾液酸水解酶。海藻酸钠和羧甲基纤维素钠的浓度分别为1.6％和0.2％，唾液酸酶的浓度为1mg/ml。

4.单唾液酸四己糖神经节苷脂的生物转化制备。将以固定化的酶(小球状)和gls加入醋酸缓冲液(ph5.0)中，并在37℃下搅拌2h，然后过滤分离小球，用醋酸缓冲液洗涤固定化酶留用。上清液经膜过滤除盐后，冷冻干燥。

5.转化产物中gm1的纯化。将转化产物上样于反相硅胶柱，利用90％甲醇水溶液洗脱，以220nm紫外检测，根据洗脱曲线收集样品，减压浓缩后干燥，获得纯品gm1，5.6g。