一种用于铜离子检测的大斯托克斯位移深红荧光探针RQNA及其制备方法和应用与流程

本发明涉及分子荧光探针技术领域，特别是一种基于氧杂蒽染料检测铜离子的大斯托克斯位移深红荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

近年来，得益于荧光成像技术的发展，荧光探针技术因其具有高选择性与灵敏度、快速响应等优点，可以在细胞及细胞器水平实现非侵入性、高时空分辨可视化检测，因此，在检测和监测生物活性分子领域显示出巨大的应用潜力。与发射光谱位于紫外-可见光区的荧光探针相比，发射光谱为位于深红区的荧光探针显示出更好的组织穿透性和更小的光损伤，并且可以有效避免生物组织背景荧光产生的干扰，受到研究人员的青睐。此外，具有大斯托克斯位移的荧光探针可以有效避免自淬灭和激发光谱产生的干扰。

铜离子作为酶辅助因子和信号信使在多种生理过程中起着不可或缺的作用，包括细胞呼吸、神经递质合成和代谢、肽生物合成、维持和修复结缔组织、为生化反应提供能量、维持免疫系统、氧化还原过程和骨骼健康等。作为呼吸酶细胞色素c氧化酶辅助因子的重要作用，线粒体是细胞内铜离子的重要储库。研究表明虽然铜是生命过程中不可或缺的微量元素，但是铜离子的显著水平异常将会导致疾病的发生，例如冠心病、关节炎、脑功能障碍、贫血和白癜风、帕金森病、阿尔茨海默氏症、威尔逊病和门克斯病等疾病。目前，具有大斯托克斯位移深红发射波长的开启型荧光探针的报道还比较少，而且以花菁和bodipy类探针居多，基于罗丹明结构的探针还比较少见。因此，设计合成基于罗丹明结构的大斯托克斯位移深红发射波长开启型线粒体靶向性荧光探针，实时监测线粒体内铜离子浓度对于疾病的早期检测和预防具有重要意义和实用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对目前检测铜离子荧光探针存在的问题，提供一种能够特异性检测体外及体内环境中铜离子的大斯托克斯位移深红荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针能高选择性和灵敏性地检测溶液中的铜离子，并且可以对细胞中铜离子进行荧光成像检测。

本发明的技术方案：

本发明所设计、合成的用于铜离子检测的大斯托克斯位移深红荧光探针rqna，结构通式如下：

一种所述用于铜离子检测的大斯托克斯位移深红荧光探针rqna的制备方法，制备流程如下所示：

具体制备步骤如下：

1)将碘甲烷加至7-氯-6-硝基喹唑啉-4(3h)-酮和碳酸钾的甲醇溶液中，然后于65℃反应22小时，反应结束后冷却至室温得到反应液。将上述反应液倒入水中，然后用二氯甲烷进行萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后进行减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为25：1-2的二氯甲烷-甲醇混合液，得到黄色粉末化合物b。所述7-氯-6-硝基喹唑啉-4(3h)-酮、碘甲烷和碳酸钾的摩尔比为1:1.5:3；所述7-氯-6-硝基喹唑啉-4(3h)-酮与溶剂甲醇的重量比为1:8-9；所述碘甲烷与溶剂甲醇的重量比为1:9-10；所述碳酸钾与溶剂甲醇的重量比为1:4-5。

2)将化合物b和罗丹醇异构体溶于dmf溶液中，然后于80℃反应12小时，反应结束后冷却至室温得到反应液。将上述反应液倒入水中，然后用二氯甲烷进行萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后进行减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为20：6：1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇混合液，得到黄色粉末化合物c。所述化合物b和罗丹醇异构体的摩尔比为1:1.1；所述化合物b与溶剂dmf的重量比为1:8-9；所述罗丹醇异构体与溶剂dmf的重量比为1:11-12。

3)将浓盐酸加入到化合物c和氯化亚锡的混合甲醇溶液中，然后于65℃反应22小时，反应结束后冷却至室温得到反应液。将上述反应液倒入水中，然后用二氯甲烷进行萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后进行减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为50：1-2的二氯甲烷-甲醇混合液，得到黄色粉末化合物d。所述化合物c、氯化亚锡和浓盐酸的摩尔比为1:5:1；所述9-甲基化合物c与溶剂甲醇的重量比为1:13-14；所述氯化亚锡与溶剂甲醇的重量比为1:7-8；所述浓盐酸与溶剂甲醇的重量比为1:39-40。

4)将化合物d和无水碳酸钾加入乙酸乙酯中，然后在室温下搅反应12小时。将上述反应液倒入水中，然后用乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后进行减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为4：2：1的二氯甲烷-石油醚-甲醇混合液，得到蓝色粉末染料rqn。所述化合物d和碳酸钾的摩尔比为1:1；所述化合物d与溶剂乙酸乙酯的重量比为1:9-10；所述碳酸钾与溶剂乙酸乙酯的重量比为1:39-40。

5)将水合肼加入到染料rqn的甲醇溶液中，然后于50℃反应3小时，反应结束后冷却至室温得到反应液。将上述反应液减压蒸馏进行浓缩，然后将其溶解在丙酮中，并于65℃反应6小时，反应结束后冷却至室温得到反应液。将上述反应液减压蒸馏进行浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为50：1-2的二氯甲烷-甲醇混合液，得到浅黄色粉末探针rqna。所述染料rqn和水合肼的摩尔比为1:5；所述染料rqn与溶剂甲醇的重量比为1:20-21；所述水合肼与溶剂甲醇的重量比为1:46-47；所述染料rqn和水合肼的总重量与丙酮的重量比为1:14-15。

具体基于氧杂蒽染料的大斯托克斯位移深红荧光探针rqna的应用如下：

运用大斯托克斯位移深红荧光探针rqna从不同金属离子物种中选择性识别铜离子，铜离子可以引起探针溶液显著的荧光增强，且探针可以对细胞内铜离子进行荧光成像检测。

本发明的优点和有益效果：

本发明设计并合成了一种基于氧杂蒽染料用于检测铜离子的大斯托克斯位移深红荧光探针rqna。该探针合成过程简单且反应条件温和。所制备的探针具有高选择性与灵敏度，可以在较宽的ph范围内与铜离子发生反应，引起深红区荧光发射光谱的显著变化，从而实现对铜离子的特异性检测。同时，该探针具有良好的细胞膜透性、低细胞毒性以及线粒体靶向定位功能，成功实现对人宫颈癌(hela)细胞中的铜离子进行荧光成像检测。

附图说明

图1是荧光探针rqna的结构；

图2是荧光探针rqna加入不同金属离子后的荧光光谱；

图3是荧光探针rqna对hela细胞内铜离子的荧光成像图。

具体实施方式

实施例1、化合物b的制备路线如下：

具体制备步骤如下：

1)将ch3i(30mmol，4.26g)加入到7-氯-6-硝基喹唑啉-4(3h)-酮(20mmol，4.5g)和无水碳酸钾(60mmol，8.28g)的混合甲醇(50ml)溶液中，然后在于65℃条件下反应22小时，反应结束后冷却至室温得到反应液；

2)将上述反应液倒入100ml水中并用二氯甲烷(3×100ml)进行萃取。合并收集有机相，用无水硫酸钠干燥后减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为25：1-2的二氯甲烷-甲醇混合液，得到浅黄色固体化合物b，产率为89％；熔点：208-214℃。

¹hnmr((cd3)2co,400mhz,ppm)δ＝8.78(1h),8.39(1h),8.02(1h),3.61(3h)；¹³cnmr((cd3)2co,100mhz,ppm)δ＝189.58,181.62,180.55,160.72,159.83,153.98,150.45,147.13,63.41.

实施例2、化合物c的制备路线如下：

具体制备步骤如下：

1)将罗丹醇异构体(2.2mmol，l688.6mg)和化合物b(2mmol，478mg)溶于dmf中(6ml)，然后于80℃反应12小时，反应结束后冷却至室温得到反应液；

2)将上述反应液倒入100ml水中并用二氯甲烷(3×50ml)进行萃取。合并收集有机相，用无水硫酸钠干燥后减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为20：6：1的石油醚-乙酸乙酯-甲醇混合液，得到黄色固体化合物c，产率为81％；熔点：168-172℃。

¹hnmr(cdcl3,400mhz,ppm)δ＝8.76(1h),8.02(1h),7.95(1h),7.66(1h),7.58(1h),7.32(1h),7.21(1h),7.16(1h),6.92(s,1h),6.61(1h),6.56(1h),6.46(1h),6.37(1h),3.54(3h),3.36(4h),1.17(6h)；¹³cnmr(cdcl3,100mhz,ppm)δ＝169.28,159.77,155.66,152.69,152.61,152.17,149.99,149.65,148.63,139.14,135.15,129.84,128.73,126.70,125.50,125.06,123.98,123.20,121.47,120.05,119.21,116.20,114.34,112.97,108.77,104.16,97.56,83.37,44.51,42.16,34.18,33.91,12.51.

实施例3、化合物d的制备路线如下：

具体制备步骤如下：

1)将1ml浓盐酸加入到化合物c(2mmol，1.18g)和氯化亚锡(10mmol，2.25g)的混合甲醇溶液(20ml)中，然后于65℃反应12小时，反应结束后冷却至室温得到反应液；

2)将上述反应液倒入100ml水中并用二氯甲烷(3×50ml)进行萃取。合并收集有机相，用无水硫酸钠干燥后减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为50：1-2的二氯甲烷-甲醇混合液，得到黄色固体化合物d，产率为77％；熔点：178-182℃。

¹hnmr(cdcl3,400mhz,ppm)δ＝8.25(1h),7.85–7.76(3h),7.74–7.65(2h),7.60–7.53(2h),7.34(1h),7.30(1h),6.97(1h),6.87(1h),6.76(1h),4.05–3.94(2h),3.88–3.78(2h),3.68(3h),3.51(3h),1.43(3h),1.37(3h)；¹³cnmr(cdcl3,100mhz,ppm)δ＝165.20,160.63,159.31,159.27,158.93,152.33,150.14,149.97,144.50,141.28,137.97,133.64,132.99,132.81,131.65,131.03,130.27,129.47,128.58,122.76,120.84,119.77,119.22,118.13,112.98,110.06,96.58,52.81,48.19,47.77,34.07,13.90,12.50.

实施例4、染料rqn的制备路线如下：

具体制备步骤如下：

1)将化合物d(1mmol，575mg)和无水碳酸钾(1mmol，138mg)投入乙酸乙酯(6ml)中，然后于室温下反应12小时；

2)将上述反应液倒入20ml水中并用乙酸乙酯(30ml×3)进行萃取。合并收集有机相，用无水硫酸钠干燥后减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为4：2：1的二氯甲烷-石油醚-甲醇混合液，得到蓝色固体染料rqn，产率为51％；熔点：276-282℃。

¹hnmr(cdcl3,400mhz,ppm)δ＝8.33–8.24(2h),7.81(1h),7.74(1h),7.54(1h),7.29(1h),7.18(1h),7.02(1h),6.93(1h),6.86–6.80(2h),6.29(1h),3.68(3h),3.62–3.56(4h),3.53(3h),1.32(6h)；¹³cnmr(cdcl3,100mhz,ppm)δ＝165.29,157.79,157.48,155.97,155.01,148.29,146.64,145.55,142.73,142.14,133.60,133.19,131.44,130.49,130.42,130.04,129.68,127.63,116.83,115.88,114.61,114.44,113.05,112.34,111.93,110.58,100.29,96.48,52.65,49.97,49.75,49.54,46.01,34.18.

实施例5、探针rqna的制备路线如下：

具体制备步骤如下：

1)将水合肼(2mmol，100mg)加入到染料rqn(0.4mmol，230mg)的甲醇(6ml)溶液中，然后于50℃反应3小时，反应结束后冷却至室温得到反应液；

2)将上述反应液进行减压蒸馏浓缩，并溶解于丙酮(6ml)中，然后于60℃下反应6小时，反应结束后冷却至室温得到反应液；

3)将上述2)反应液进行减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为50：1-2的二氯甲烷-甲醇混合液，得到浅黄色固体探针rqna，产率为61％；熔点：262-265℃。

¹hnmr(cdcl3,400mhz,ppm)δ＝7.93(1h),7.75(s,1h),7.52–7.42(2h),7.08(1h),6.84(1h),6.66(1h),6.54(1h),6.22(1h),6.16(1h),6.11(1h),6.05(1h),3.45(3h),3.19(4h),2.07(3h),1.98(3h),1.08(6h)；¹³cnmr(cdcl3,100mhz,ppm)δ＝174.78,160.85,160.59,152.94,151.47,149.10,148.58,144.67,138.35,132.55,131.57,131.29,130.08,128.54,128.41,123.59,123.31,118.04,113.18,112.02,111.00,109.18,108.11,106.89,106.87,104.68,100.95,97.58,65.92,44.23,34.15,32.69,25.46,22.05,12.65,12.62.

探针rqna的荧光检测应用：

将探针配成浓度为5.0×10^-3mol/l的dmf溶液，避光保存备用。检测方法如下：

1)探针rqna的选择性检测

分别将探针在hepes缓冲溶液(hepes/ch3cn＝8/2)中配置成1×10^-5mol/l的待测液3ml，然后分别加入5×10^-5mol/l的不同种类金属阳离子(ag⁺、al³⁺、ca²⁺、cd²⁺、co²⁺、cu²⁺、cr³⁺、fe²⁺、fe³⁺、k⁺、li⁺、mg²⁺、mn²⁺、na⁺、ni²⁺、pb²⁺、pd²⁺和zn²⁺)，静置5分钟后，以575nm波长进行激发，测试各溶液荧光发射光谱。结果如图2所示，只有铜离子引起显著的荧光增强。

添加5倍当量不同种类的2)探针rqna用于hela细胞内铜离子荧光成像检测

先将1μm探针与hela细胞共同培养0.5h，然后加入5μm铜离子继续培养0.5h，用pbs缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行成像，采用559nm进行激发，收集618-718nm范围内荧光信号。成像结果如图3所示，在细胞内可以观察到显著的荧光发射信号，表明探针可以荧光成像检测细胞内粘度。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围，作为荧光探针是本发明的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光探针，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。