一种白芨多糖的制备方法与流程

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种白芨多糖的制备方法。

背景技术：

白芨为兰科多年生草本植物白芨bletillastriata(thunb.)reichb.f.的干燥块茎，常见于荫蔽草丛或林下潮湿地，因其根色白而连生，故名之，在我国各地均有分布。《中国药典》收载白芨的入药部位为块茎，其主要药效成分为白芨多糖，又称白芨胶、白芨甘露聚糖。研究表明干燥的鳞茎组织中含量约为40％～50％，这些多糖主要由β-1,4-甘露糖、β-1,4-葡萄糖和β-1,6-葡萄糖残基组成，属中性杂多糖，白芨多糖主要分子量跨度很大，其分子量范围从几万到几百万不等。现代药理研究表明，白芨多糖具有抗炎、促凝血、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等生物学活性；作为天然高分子材料，同时，白芨多糖具较好的组织相容性、生物黏附性、生物降解性、对黏膜无刺激性，且资源丰富、廉价易得，具有生物黏附载体材料的特性。

现有白芨多糖的提取方法有：水提法、水提醇沉法、连续逆流提取法和酶法。单一的水提法经过高温处理，此过程往往会造成白芨药材中淀粉会随多糖同时溶出，从而造成所制备的白芨多糖中含有大量的淀粉；而酶法在制备过程中虽然不会有淀粉等非活性多糖溶出，但在提取过程中又同时引入了蛋白质等杂质，而蛋白质和淀粉都是大分子结构在后期的纯化过程中很难除去，从而限制了白芨多糖的综合开发。此外，采用上述方法提取后需要结合sevage法除蛋白质、乙醇沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和吸附层析等一种或多种方法对白芨多糖进行纯化，存在得率较低、试剂消耗量大、能耗高、价格昂贵、操作步骤繁琐等缺陷。

有鉴于此，研究出一种白芨多糖能够适合工业化生产、纯度好收率高的提取纯化方法是从业人员所迫切希望地。双水相萃取技术(aqueoustwo-phaseextraction,atps)又称水溶液两相分配技术，是近年来出现的引人注目，极有前途的新型分离技术，已经在生物化学、细胞生物学、生物化工等领域得到了较为广泛的应用。当生物物质或天然产物中的有效成分进入双水相体系时，由于表面性质、电荷作用和各种力(疏水键、氢键和离子键)的存在和环境因素(浓度、温度、ph值以及离子的种类和强度等)的影响，生物物质或天然产物中的有效成分易在两相间形成选择性的分配。尤其是低分子醇/盐双水相体系具有价廉、低毒、粘度较小等优势，可以用于天然产物的提取和分离。而目前关于双水相体系萃取白芨多糖的研究尚未见报道。为此，我们研究了低分子醇与不同无机盐如钾盐、钠盐和铵盐等的醇盐比及形成双水相体系的稳定性，建立了简单高效的白芨多糖制备方法，并将白芨多糖用于预防皮肤屏障的损伤，促进皮肤屏障损伤的修复。该方法通过微波辅助双水相技术将白芨多糖萃取物直接进入水层，同时将蛋白质等杂质萃取到上相或在两相界面，从而提高目标产物纯度，避免了现行工艺中有机溶剂的残留。该技术简单便捷，经济省时、绿色高效，便于放大。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于提供一种快速简便的白芨多糖制备方法，该方法白芨多糖提取率高，达到快速提取纯化目标产物的目的。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

一种白芨多糖的制备方法，具体包括如下操作步骤：

(1)白芨原料的处理：取白芨块根置于60℃-80℃温度下干燥至恒重，干燥块根经过粉碎、过筛，得到20目-80目白芨粉末；

(2)低分子醇/盐双水相体系的配制：室温下配制低分子醇与无机盐双水相体系，并调节溶液ph值为7.0～8.0，充分搅拌混匀，建立双水相体系；

(3)双水相萃取结合微波提取：将白芨粉末加入到双水相体系制成萃取溶液，将萃取溶液在100w～600w，30℃-60℃下微波处理60min～180min；使白芨多糖充分萃取，然后静置60～100min，经8000～12000rpm高速离心，分离出白芨多糖萃取相；

(4)超滤浓缩脱盐：将步骤(3)所获得的白芨多糖萃取相以截留分子量为1-10kd的超滤膜进行超滤脱盐，得到白芨多糖浓缩液；

(5)冷冻干燥：将步骤(4)所获得的白芨多糖浓缩液经冷冻干燥得白色均匀的白芨多糖固体。

进一步地，所述步骤(2)中，低分子醇类为c1-c5的直链或支链的烷基醇，特别优选为乙醇或异丙醇。

进一步地，所述步骤(2)中，无机盐类为钾盐、钠盐和铵盐，特别优选为碳酸钾、磷酸氢二钾、碳酸钠、磷酸氢二钠、硫酸铵或碳酸铵。

进一步地，所述步骤(2)中，无机盐类的质量分数为10％～40％，低分子醇的质量分数为20％～25％。

进一步地，所述步骤(2)中，双水相溶液的ph值为7.0～8.0，特别优选为ph7.5。

进一步地，所述步骤(3)中，白芨粉末和双水相溶液的固液比为1:20～1:100的比例，特别优选为1:50～1:80。

进一步地，所述步骤(3)中，微波处理条件，特别优选为400w，50℃下微波处理120min。

进一步地，所述步骤(4)中，特别优选为以截留分子量为5kd的超滤膜进行超滤脱盐。

进一步地，所述步骤(5)中，白芨多糖固体的分子量平均分布为1-100kd，特别优选为25kd；其单糖组成摩尔比n(甘露糖)：n(葡萄糖)＝4:1～1:1，特别优选为2.7：1。

我们研究了低分子醇与不同无机盐如钾盐、钠盐和铵盐等的醇盐比及形成双水相体系的稳定性，建立了简单高效的白芨多糖制备方法，并将白芨多糖用于预防皮肤屏障的损伤，促进皮肤屏障损伤的修复。该方法通过微波辅助双水相技术将白芨多糖萃取物直接进入水层，同时将蛋白质等杂质萃取到上相或在两相界面，从而提高目标产物纯度，避免了现行工艺中有机溶剂的残留。该技术简单便捷，经济省时、绿色高效，便于放大。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1)采用双水相萃取能在将白芨多糖萃取到水相的同时将蛋白质等杂质萃取到上相或在两相界面，从而提高目标产物纯度；结合微波萃取技术，能大大提高白芨多糖的萃取率，缩短提取周期，且回收率高。2)该技术简单便捷，经济省时、绿色高效，便于放大。制备的白芨多糖结构完整，低毒安全，能够预防皮肤屏障的损伤，促进皮肤屏障损伤的修复进程，对皮肤屏障功能异常的敏感皮肤具有良好的抗敏作用。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1是本发明中白芨多糖的红外图谱。

图2是本发明中白芨多糖的高效分子排阻色谱图(hpsec-elsd)。

图3是本发明中白芨多糖的单糖组分hplc图谱分析。

【具体实施方式】

本发明一种白芨多糖的制备方法，具体包括如下操作步骤：

(1)白芨原料的处理：取白芨块根置于60℃-80℃温度下干燥至恒重，干燥块根通过高速组织捣碎机粉碎，过筛，得到20目-80目白芨粉末；

(2)低分子醇/盐双水相体系的配制：室温下配制低分子醇与无机盐双水相体系，准确称取无机盐，加入适量的水配制成一定浓度，溶解结束后加入适量的低分子醇，调节溶液ph值，充分搅拌混匀，建立双水相体系。

(3)双水相萃取结合微波提取：将白芨粉末按一定的固液比加入到双水相体系制成萃取溶液，将萃取溶液在100w～600w，30℃-60℃下微波处理60min～180min；使白芨多糖充分萃取，静置60～100min，经8000～12000rpm高速离心，分离出白芨多糖萃取相。

(4)超滤浓缩脱盐：将步骤(3)所获得的白芨多糖萃取相以截留分子量为1-10kd的超滤膜进行超滤脱盐，期间补加水两次，即可得白芨多糖浓缩液。

(5)冷冻干燥：将步骤(4)所获得的白芨多糖浓缩液经冷冻干燥得白色均匀的白芨多糖固体。

其中，步骤(2)中，低分子醇类为c1-c5的直链或支链的烷基醇，特别优选为乙醇或异丙醇中的一种。

步骤(2)中，无机盐类为钾盐、钠盐和铵盐，特别优选为碳酸钾、磷酸氢二钾、碳酸钠、磷酸氢二钠、硫酸铵或碳酸铵。

步骤(2)中，无机盐类的质量分数为10％～40％，低分子醇的质量分数为20％～25％。

步骤(2)中，双水相溶液的ph值为7.0～8.0，特别优选为ph7.5。

步骤(3)中，白芨粉末和双水相溶液的固液比为1:20～1:100的比例，特别优选为1:50～1:80。

步骤(3)中，微波处理条件，特别优选为400w，50℃下微波处理120min。

步骤(4)中，特别优选为以截留分子量为5kd的超滤膜进行超滤脱盐。

需要说明的是，本发明采用硫酸蒽酮比色法检测白芨多糖的含量和提取率，采用高效凝胶渗透色谱法-elsd(hpgpc)测定白芨多糖的分子量，采用pmp衍生物高效液相色谱法测定单糖组成和比例，结合红外光谱分析，从而对双水相萃取结合微波提取白芨多糖的效果和产品质量特征有充分认识。

蒽酮-浓硫酸比色法：将葡萄标准品置烘箱烘至恒重，准确称取0.1g，配制成1.0mg/ml葡萄糖溶液，然后稀释10倍得100μg/ml葡萄糖标准溶液。准确量取葡萄糖标准液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，在冰水浴中加入0.2％蒽酮-浓硫酸溶液(0.5ml蒽酮液和4ml浓硫酸)，置沸水浴中反应10min，取出置冰水浴中10min，在波长为625nm处检测吸光值，制作标准曲线。用同样的方法测定白芨多糖的吸光度值，根据绘制的标准曲线确定白芨多糖质量，并计算多糖含量和提取率。

白芨多糖含量计算公式为：白芨多糖含量％(g/g)＝比色法测得白芨多糖质量/称取白芨多糖质量×100％。

白芨多糖提取率计算公式为：白芨多糖提取率％(g/g)＝白芨多糖质量/白芨粉末质量×100％。

以下结合实施例对本发明作进一步地说明。

实施例1

将白芨块根置于60℃-80℃温度下干燥至恒重，干燥块根通过高速组织捣碎机粉碎，过筛，得到20目-80目白芨粉末；按照表1的设计，称取一定质量的碳酸钠和一定体积的无水乙醇，先加入超纯水搅拌使无机盐溶解后加入无水乙醇，最后补水至1000ml终体积，充分搅拌，调节双水相溶液的ph值为7.5。称取一定质量的白芨粉末，加入到该双水相体系，不停搅拌，在400w，50℃下微波处理120min，使白芨多糖充分析出，静置60min，经10000rpm高速离心30min，分离出白芨多糖萃取相，将萃取相以截留分子量为5kd的超滤膜进行超滤脱盐，期间补加水两次，即可得白芨多糖浓缩液。浓缩液经冷冻干燥得白色均匀的白芨多糖固体。

表1双水相组成和白芨多糖萃取结果

实施例2

将白芨块根置于60℃-80℃温度下干燥至恒重，干燥块根通过高速组织捣碎机粉碎，过筛，得到20目-80目白芨粉末；按照表1的设计，称取一定质量的磷酸氢二钠和一定体积的无水乙醇，先加入超纯水搅拌使无机盐溶解后加入无水乙醇，最后补水至1000ml终体积，充分搅拌，调节双水相溶液的ph值为7.5。称取一定质量的白芨粉末，加入到该双水相体系，不停搅拌，在400w，50℃下微波处理120min，使白芨多糖充分析出，静置60min，经10000rpm高速离心30min，分离出白芨多糖萃取相，将萃取相以截留分子量为5kd的超滤膜进行超滤脱盐，期间补加水两次，即可得白芨多糖浓缩液。浓缩液经冷冻干燥得白色均匀的白芨多糖固体。

表2双水相组成和白芨多糖萃取结果

实施例3

将白芨块根置于60℃-80℃温度下干燥至恒重，干燥块根通过高速组织捣碎机粉碎，过筛，得到20目-80目白芨粉末；按照表1的设计，称取一定质量的碳酸钠和一定体积的异丙醇，先加入超纯水搅拌使无机盐溶解后加入无水乙醇，最后补水至1000ml终体积，充分搅拌，调节双水相溶液的ph值为7.5。称取一定质量的白芨粉末，加入到该双水相体系，不停搅拌，在400w，50℃下微波处理120min，使白芨多糖充分析出，静置60min，经10000rpm高速离心30min，分离出白芨多糖萃取相，将萃取相以截留分子量为5kd的超滤膜进行超滤脱盐，期间补加水两次，即可得白芨多糖浓缩液。浓缩液经冷冻干燥得白色均匀的白芨多糖固体。

表3双水相组成和白芨多糖萃取结果

实施例4

采用高效凝胶渗透色谱法-elsd(hpgpc)对白芨多糖的分子量进行测定(结果见附图2)。色谱条件为：g-6000色谱柱(6.0×400mm)，流动相为水溶液，标准品及样品质量浓度均为2mg·ml-1，进样量10μl，流速为0.5ml·min-1，柱温为40℃，检测器为蒸发光检测器elsd(温度110℃，增益2)。

标准曲线的制作：将葡萄糖及葡聚糖系列标准品(5、50、100、200和500kda)分别用水溶液配成质量浓度为2mg·ml-1的溶液，按分子质量由小到大依次进样，测定保留时间ve。分别用葡萄糖和t-200葡聚糖标定vt和v0。分配系数(kav)和保留时间的关系如下：kav＝ve-v0/vt-v0；以以kav为横坐标，lgmw(分子质量对数)为纵坐标绘制标准曲线。

分子量测定：将待测样品用水溶液配成质量浓度为2mg·ml-1的溶液，测定保留时间ve。根据标准曲线的数量关系推测样品分子量大小。结果见附图2，所得样品分子量为23kd。

实施例5

取干燥的白芨多糖样品2mg，以kbr压片，在4000～400cm-1的范围内进行红外光谱扫描，记录红外光谱图(见附图1)。结果显示，本发明制备的白芨多糖包括β构型的葡萄糖和甘露糖的指纹区吸收，特征的乙酰基吸收(1743cm-1附近)。从ir谱图中可以看出，白芨多糖有多糖的特征吸收峰，3600～3200cm-1处(3372.27cm-1)的吸收峰为o-h的伸缩振动；3000～2750cm-1处(2887.97cm-1)有2个吸收峰，表示有糖类-ch2上的c-h对称和反对称伸缩振动；1742.31cm-1有吸收说明有酰基的修饰。波数811.46cm-1和871.05cm-1是甘露糖残基的特征吸收，波数920cm-1有吸收，表明存在葡萄吡喃糖残基。糖苷键的特征吸收峰在840cm-1处无明显吸收，说明无α型糖苷键的存在，而在871.05cm-1有吸收，表明糖苷键构型为β型。

实施例6

白芨多糖单糖组成和比例分析(实施例1)

采用pmp衍生物高效液相色谱法测定单糖组成和比例

色谱条件：安捷伦hplc系统，色谱柱kromasilc18(4.6mm×150mm,5μm)，流动相为82.0％pbs(0.05m,ph7.0)和18.0％乙腈(v/v)，流速为1.0ml·min-1，进样量为10μl，检测波长为254nm。

精密称取白芨多糖样品2mg，分别加入0.5ml2m三氟乙酸，120℃水解2小时，加入少量甲醇，45℃水浴蒸干，重复3～5次，直至完全蒸除三氟乙酸为止。完全酸水解后获得的干燥样品加入1.0ml纯化水溶解，取100ul样品溶液进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化操作，稀释20倍检测。

经pmp柱前衍生化法测定，各单糖混合对照品及白芨多糖5号样品纯化组分经三氟乙酸水解后产物的单糖hplc色谱见附图3，出峰顺序保留时间及峰面积见表3。结果表明，白芨多糖5号样品主要由甘露糖和葡萄糖组成，单糖组成摩尔比n(甘露糖)：n(葡萄糖)＝2.7:1.0。

实施例7

体外实验探讨白芨多糖对紫外线照射下皮肤成纤维细胞的保护作用。

实验方法：用10％fbs的dmem培养基培养hsf人皮肤成纤维细胞株，设立正常对照组、紫外线照射组，和紫外线照射+白芨多糖(20ug/ml)组，用日光模拟器suv-1000照射连续照射7天，每天30min，照射量1j/cm²，总累计照射量7j/cm²，用细胞免疫组化法观察紫外线照射下成纤维细胞衰老标志物β-半乳糖糖苷酶以及胶原降解酶mmp-1的变化。

表4β-半乳糖糖苷酶和mmp-1的变化(*p<0.05)

通过上述体外试验提示白芨多糖对紫外线引起的皮肤成纤维细胞衰老及胶原降解有明显的保护作用。单糖组成及连接方式、糖苷键类型、分支度，都对白芨多糖的用途起到重大的贡献，白芨多糖不同于其他植物多糖，其单糖组成由甘露糖和葡萄糖组成，单糖的组成比例不同，其体现在生物活性的差异。当单糖组成摩尔比n(甘露糖)：n(葡萄糖)＝2.7:1.0，效果显著。

实施例8

通过测试皮肤的角质层含水量和经皮失水率评价白芨多糖对皮肤屏障损伤的修复效果。按照自愿原则选择20-40岁之间无皮肤病史及化妆品过敏史的人员作为受试者。具体方法是取同一志愿者对称部位皮肤随机双盲外用本发明白芨多糖乳剂，每个样品随机选用10名受试者，每次使用样品约20g均匀涂抹于面部，试验期间不再使用其他保湿产品，采用定位膜标记好测试点位置，每天早晚各一次，共用4周时间。在第0周、第2周、第4周利用德国ck公司mc760型多功能皮肤测试仪测试经表皮丢水程度(tewl),皮肤角质层水化程度检测。通过试验证实本发明的制备白芨多糖有明显的修复皮肤屏障保湿功效。当单糖组成摩尔比n(甘露糖)：n(葡萄糖)＝2.7:1.0，效果显著。

表5tewl和皮肤角质层水化程度的变化(*p<0.05)

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。