一种用于miRNA检测的装置的制作方法

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种用于mirna检测的装置。

背景技术：

核苷酸小分子rna（mirna）是一类非蛋白质编码，只有19-24个核苷酸的内源性短rna。mirna不编码蛋白质，但可在转录后调控基因表达，影响蛋白质的翻译，在人体细胞发育、分化、增殖、凋亡和免疫系统的各种生理过程中起重要作用。同时mirna也被证实与多种疾病，特别是人的癌症密切相关，例如mirna-31，最早在a549细胞中发现，研究表明mirna-31是癌细胞增殖、侵袭及迁移过程中重要的调控因子，在结直肠癌、头颈癌瘤、肝癌、肺癌等多种癌细胞系过表达，显示出显著的临床相关性。因此，mirna逐渐成为癌症早期监测的新型生物标志物。

mirna具有调节人体发育和生理过程的重要生物学功能，因此，已开发出各种技术用于mirna的定量分析，最常见的mirna检测方法有：northern印迹分析、微阵列芯片技术、反转录-聚合酶链反应（pt-pcr）和荧光成像技术。传统的northern印迹分析技术灵敏度较低，相对耗时且需要大量rna样品；微阵列芯片技术具有高通量但需要极其精确的仪器，并且还存在不期望的交叉杂交和低灵敏度的问题；qpcr灵敏度高，但成本高，过程复杂且需要特殊的实验室技能。此外，mirna易降解，在细胞表达水平低，序列同源性高，这极大地限制了mirna的检测。因此，开发出一种简单、快速的mirna检测技术具有重大意义。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种用于mirna检测的装置，结构简单，成本低，操作便利；使用本发明装置进行mi-rna检测，特异性好，灵敏度高，耗时短，适用性强。

为达到上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：

－芯片，为mirna信号放大反应的载体，设有若干反应单元；

－透明夹片组，包括上夹片和下夹片，上夹片和下夹片叠合形成的一中间夹层，供所述芯片容置；

－固定件，使上夹片、芯片和下夹片紧密贴合，彼此之间不发生相对位移；

－活动部，设于透明夹片组下方，用于为反应单元提供可移动的检测接口；

－检测器，设于活动部下方，用于接收和分析所述芯片反应单元的mirna信号；

－驱动件，与活动部连接并驱动其移动；

所述活动部设有通孔，作为芯片-检测器检测接口，使驱动件带动活动部移动时，检测器的激发光能透过所述通孔照射到芯片反应单元，使反应单元mirna信号得到激发而产生荧光，被检测器接收，通孔的大小至少能使激发光透过后在芯片的照射面积覆盖一个反应单元，通过活动部的移动，完成不同反应单元与检测器的对接。

优选的，所述芯片包括纸质基底和固态蜡薄层；通过将设计图案打印到所述纸质基底，加热使纸质基底上的固态蜡薄层融化并渗透到纸质基底中，形成对应设计图案的疏水化反应孔；所述设计图案为对称图案，使得芯片对折后上、下层反应孔重合，每一对重合反应孔为一反应单元。

进一步的，利用所述反应单元进行mirna信号放大反应并检测的方法如下：

s1：将分子信标溶液/dsn酶溶液加入上层反应孔/下层反应孔，或分子信标溶液/dsn酶溶液加入下层反应孔/上层反应孔，对折芯片，使分子信标和dsn酶固定在所述反应单元；

s2：将待测液加至反应单元，使其由上层反应孔渗透至下层反应孔；

s3：目标mirna与分子信标碱基互补配对，形成双链结构，dsn酶剪切dna-rna双链中的dna，释放目标mirna，目标mirna继续结合新的分子信标，dsn酶继续剪切，直至分子信标或dsn酶消耗完全；

s4：在dsn酶剪切过程中，分子信标带有的荧光基团和猝灭基团相互远离而使荧光恢复，

dsn酶的反复作用使得荧光信号得到放大，放大的荧光信号由检测器接收和分析，得到待测液的荧光信号峰；

s5：将待测液换成depc水进行反应和检测，得到分子信标空白峰，待测液的荧光信号峰扣除分子信标空白峰即为目标mirna的荧光信号峰。

更进一步的，所述检测器为激光诱导荧光检测器。

更进一步的，所述mirna信号放大反应的反应条件为温度50-60℃，时间30-40min。

优选的，所述上夹片和下夹片为载玻片。

优选的，所述固定件为磁铁，活动部为铁片。

本发明所述的用于mirna检测的装置设计原理是将激光诱导荧光检测法(lif)检测技术与纸芯片结合对mirna进行检测。本发明开发的纸芯片用于进行dsn酶切放大反应，首先将dsn酶和分子信标固定在纸芯片上设置的反应单元，再将待测液加至反应单元，分子信标是针对目标mirna设计的dna单链，能与目标mirna特异性结合，dna单链一端连接荧光基团另一端连接猝灭基团，dsn酶能切割mirna与分子信标形成的复合双链中的dna链，使分子信标两端的荧光基团和猝灭基团相互远离，荧光得以恢复，释放后的mirna又会结合新的分子信标，再次被dsn酶切割，反复作用后，荧光信号能得到有效放大；放大的荧光信号由激光诱导荧光检测器采集和分析，得到待测液的荧光信号峰，激光诱导荧光检测技术的灵敏度比普通荧光高1-3个数量级，其对荧光物质的检测限可以达到年nm数量级，甚至可以实现单分子检测，具有灵敏度高、快速、便捷、连续测量等优势，本发明将其与dsn酶切放大反应结合，灵敏度提高约5个数量级，检测限达到fm数量级，大大提高目标mi-rna的检出率；采用dsn酶切放大反应，40min内就可以完成待测液中mirna的检测，耗时短；且对样品的处理要求不高，所需的样品量少，5μl也能完成检测，节省样本。本发明装置包括反应组件和激光诱导荧光检测器组件，将纸芯片进行简单组装即可得到反应组件，与传统mirna检测需要复杂的永久性仪器或装置相比，结构简单，不需要专业人员负责操作，大大降低设备和人力成本；纸芯片制作方便，能现制现用，设置的反应单元数量、大小和形状均可变，满足多种通量要求，适用于不同体积样本的检测，效率高、灵活度高。此外，本发明芯片-检测器检测接口的设置使得采集到的信号为峰形，易于判断；并有效缩短激光照射在纸上的时间，检测器中的光电管接收到的光子少，不易产生疲劳，因而重现性好。

本发明的有益效果如下：

相较传统的检测技术，不涉及复杂的程序或复杂的仪器，成本低，操作简单，方便快速。利用dsn酶切放大反应，结合激光诱导荧光检测技术，将灵敏度提高约5个数量级，检测限达到fm数量级；dsn酶切放大反应耗时短，特异性高，所需样本量少。开发的纸芯片可以完成dsn酶、分子信标的储存固定，酶切放大反应的进行，制作简单，能够满足多种通量要求，适用于不同体积样本的检测。

附图说明

图1：本发明所述用于mirna检测的装置的结构示意图。

图2：实施例1所述纸芯片的制作示意图。

图3：实施例2所述a549细胞裂解液mirna-31的检测结果。

图4：实施例3所述不同浓度mirna-31的检测结果。

图中：1-芯片，2-透明夹片组，3-活动部，4-驱动件，5-检测器，11-反应单元，12-上层反应孔，13-下层反应孔。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种用于mirna检测的装置，如图1所示，包括：

－芯片1，为mirna信号放大反应的载体，设有若干反应单元11；

－透明夹片组2，包括上夹片和下夹片，上夹片和下夹片叠合形成的一中间夹层，供所述芯片容置；

－固定件，使上夹片、芯片和下夹片紧密贴合，彼此之间不发生相对位移；

－活动部3，设于透明夹夹片组2下方，用于为反应单元提供可移动的检测接口；

－检测器5，设于活动部3下方，用于接收和分析所述芯片1反应单元11的mirna信号；

－驱动件4，与活动部3连接并驱动其移动；

所述活动部3设有通孔31，作为芯片-检测器检测接口，使驱动件4带动活动部3移动时，检测器5的激发光能透过所述通孔31照射到反应单元11，使反应单元11的mirna信号得到激发而产生荧光，被检测器5接收，通孔31的大小至少能使激发光透过后在芯片1的照射面积覆盖一个反应单元11，通过活动部3的移动，完成不同反应单元11与检测器5的对接。所述上夹片和下夹片为载玻片，固定件为磁铁，活动部3为铁片，驱动件4为步进电机，检测器5为激光诱导荧光检测器；铁片中间有一通孔，尺寸1.4cm×0.8cm。

芯片1的制作方法如下：

首先通过喷蜡打印机，将设计图案打印至纸质基底之上，而后利用烘箱对其进行烘烤，使纸质基底上的薄层固态蜡融化并渗透到纸质基底当中，形成疏水化的圆形反应孔。如图2所示，所述芯片1设计图案为对称图案，使用时将芯片对折、压平，使得芯片上层反应孔12和下层反应孔13重合，每一对重合反应孔为一反应单元11。

实施例2

利用实施例1所述装置对a549细胞裂解液进行mirna-31检测。

样品准备：

（1）核酸链碱基序列（序列由5'to3'）如下：

mirna-31:aggcaagaugcuggcauagcu

分子信标p31:fam-agctatgccagcatcttgcct-eclipse

（2）样品处理：将a549细胞灭活后裂解，裂解液离心取上清液作为待测液进行检测。

mirna-31检测具体过程如下：

（1）将分子信标p31溶液固定在上层反应孔12，将dsn酶溶液固定在下层反应孔13，将芯片对折并压平，使得芯片上层反应孔12和下层反应孔13重合并构成反应单元11，向反应单元11滴加待测液，使其自然渗透至下层；

（2）将该芯片放置于两片载玻片的夹层，用磁铁进行固定，放于50℃烘箱35min进行扩增反应；

（3）取出载玻片，于反应单元11处滴加depc水，保证纸片浸湿，便于检测；

（4）取一张长方形铁片，铁片中间有一通孔（1.4cm×0.8cm），在铁片一端用线连接步进电机，将反应好的纸芯片置于芯片-检测器检测接口上方；

（5）启动步进电机，线拉动铁片移动，速度2.2cm/s，当检测器的激光透过铁片通孔直接照射到纸芯片，fam基团荧光被激发，检测器采集到样品荧光信号峰；

（6）在相同的条件下，将待测液液换成depc水进行检测，即可测得分子信标p31空白峰，用待测液所得的峰高扣除分子信标p31空白峰即可得到所检测的mirna-31的荧光信号实际峰高。

检测结果如图3所示，左侧峰为待测液信号峰，右侧峰为分子信标p31信号峰，左侧峰高减去右侧峰高即为a549细胞裂解液中mirna-31的荧光强度，本发明装置可成功用于mirna-31的检测。

实施例3

利用实施例1所述装置对mirna-31系列浓度的标准液进行检测，标准液浓度依次是：

2.00×10^-13m、1.00×10^-13m、5.00×10^-14m、2.00×10^-14m、5.00×10^-15m、2.00×10^-15m，具体检测过程同实施例2。

检测结果如图4所示，随着标准液浓度降低，mirna-31峰高依次降低。本发明装置具有高灵敏度，测得检测限为0.50fm。

本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在本发明权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。

序列表

<110>福州大学

<120>一种用于mirna检测的装置

<141>2019-09-23

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<212>rna

<213>a549细胞

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aggcaagaugcuggcauagcu21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agctatgccagcatcttgcct21