一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法。

背景技术：

分子在成键过程中，会产生一些未配对的电子，我们把这种电子称为自由基。自由基未配对电子有很强的配对目标性和偏向性，导致多种自由基具有很强的氧化性。自由基的产生有很多原因，如紫外线照射，α、β、γ线的辐射，杀虫剂，环境污染，会刺激人体产生自由基。情绪高度紧张、生活习惯不良、饮食习惯不健康等也会促使人体产生大量自由基，可见自由基充斥在我们身边。当体内自由基含量过剩，自由基会通过攻击细胞膜，进入细胞，破坏蛋白质，损伤dna，导致身体产生一系列疾病，如心脏病，人体机能衰老情况也加快。因此，许多学者致力于研究更有效、更安全的自由基清除剂。相比于化学合成的抗氧化剂，更多人选择食用天然抗氧化剂来清除体内自由含量。

鱿鱼皮是鱿鱼加工中主要的副产物之一，在鱿鱼加工过程中，以废弃物的形式被丢弃。鱿鱼皮中含有丰富的蛋白质，可用来提取胶原蛋白和制备抗氧化肽。提高了鱿鱼的利用率，增加了鱿鱼皮的利用价值。

由葡萄糖、果糖等还原性糖与氨基酸引起的褐变反应称为美拉德反应，也称为羧－氨缩合反应，美拉德反应所引起的褐变与氨基化合物和糖的结构有密切关系。研究表明：美拉德反应产物中含有的还原酮、类黑精和一系列含s、n的杂环化合物具有一定的抗氧化活性，美拉德的中间体—还原酮类化合物的还原能力及美拉德产物的金属离子络合特性与其抗氧化能力有关，说明美拉德反应能明显提高肽的抗氧化活性。

本发明通过美拉德反应，提高鱿鱼皮肽的抗氧化活性，从而增加鱿鱼皮的商业价值。本发明的目的在于研发一种高效抗氧化活性的鱿鱼皮美拉德肽液的制备方法。

技术实现要素：

本发明提供一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法，通过采用鱿鱼内脏自溶液酶解法，鱿鱼皮酶解更完全，得到小分子肽与亚硒酸钠螯合，进一步添加还原糖制备的美拉德肽液比普通美拉德肽液具有更好的抗氧化效果，也改善了风味，减少了鱼腥味带来的不愉快味道，同时产物为无色透明液体，增加了其美观程度，产生其特有的香味。

本发明提供一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法，将新鲜鱿鱼皮干燥，粉碎后过筛，得到鱿鱼皮粉，利用低温连续相变技术提取鱼油，得到的萃取残渣即为脱脂鱿鱼皮粉，过筛后加入鱿鱼内脏自溶液，自溶2h后，灭酶，离心，收集上清液，加入亚硒酸钠溶液，超声波混匀，调节ph，恒温螯合后，向上清液中加入还原糖，在合适条件下反应，醇沉，溶于去离子水中调节相对密度，得到具有抗氧化活性的美拉德肽液。

作为本发明进一步的改进，所述还原糖的添加量为鱿鱼皮质量的5-10wt%，所述还原糖选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖中的一种或几种。

作为本发明进一步的改进，所述亚硒酸钠的质量分数为5-10wt%，所述超声波功率为1000-2000w，调节ph为6-7，所述恒温螯合的温度为35-45℃。

作为本发明进一步的改进，所述合适条件为100℃、ph呈中性的条件下反应4-6h。

作为本发明进一步的改进，所述内脏自溶液的制备方法为：将鱿鱼内脏以1︰5比例加入去离子水，搅拌机绞碎后高速匀浆，得到鱿鱼内脏自溶液。

作为本发明进一步的改进，所述灭酶条件为105℃灭酶10min，所述脱脂鱿鱼皮粉与鱿鱼内脏自溶液的质量体积比为1：（5-10）。

作为本发明进一步的改进，所述离心转速为5000-10000r/min。

作为本发明进一步的改进，所述低温连续相变技术的具体方法为：将鱿鱼皮粉装入低温连续相变萃取釜中密封，设定相关萃取参数进行低温连续相变萃取操作，所述萃取温度为37℃，萃取压力为1.2mpa，萃取时间为50min，解析温度为60℃。

作为本发明进一步的改进，所述醇沉条件为按体积比1:1加入95%乙醇，调节相对密度为1.2-1.5。

本发明进一步保护一种上述方法制备得到的具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液。

本发明具有如下有益效果：本发明采用低温连续相变技术萃取得到鱿鱼中的高附加值的产物鱼油，将鱿鱼脱脂，得到的脱脂产物对酶解及后续美拉德反应具有良好的反应性，得到的肽液纯度较高，抗氧化活性较好，且鱼油还可以另外售卖，附加值高，提高了其经济效益；

本发明得到了一种新的肽硒化合物和美拉德肽化合物的混合物，既满足了缺硒人群对硒的要求，又提供了安全性高的生物活性肽，该肽类同时具有良好的抗氧化活性，具有极好的保健效果；

本发明采用鱿鱼内脏自溶液酶解法，在内脏内含有大量的自溶酶，可有效的将鱿鱼皮中的蛋白质成分酶解，使大分子蛋白质水解为低分子肽，再经过美拉德反应，不仅增加了美拉德肽液的生物活性、抗氧化性能，也改善了风味，减少了鱼腥味带来的不愉快味道，同时产物为无色透明液体，增加了其美观程度，产生其特有的香味。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明测试例1中清除羟基自由基能力对比图；

图2为本发明测试例2中清除超氧阴离子自由基能力对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法，将新鲜鱿鱼皮干燥，粉碎后过筛，得到鱿鱼皮粉，利用低温连续相变技术提取鱼油，得到的萃取残渣即为脱脂鱿鱼皮粉，过筛后加入鱿鱼内脏自溶液，脱脂鱿鱼皮粉与鱿鱼内脏自溶液的质量体积比为1：5，自溶2h后，105℃灭酶10min，离心，转速为5000r/min，收集上清液，加入5wt%亚硒酸钠溶液，超声波混匀，超声波功率为1000w，调节ph为6，恒温螯合，温度为35℃，向上清液中加入葡萄糖，添加量为鱿鱼皮质量的5wt%，在合适条件下反应，所述合适条件为100℃、ph=7的条件下反应4h，醇沉，醇沉条件为按体积比1:1加入95%乙醇，溶于去离子水中调节相对密度为1.2，得到具有抗氧化活性的美拉德肽液。

所述内脏自溶液的制备方法为：将鱿鱼内脏以1︰5比例加入去离子水，搅拌机绞碎后高速匀浆，得到鱿鱼内脏自溶液。

所述低温连续相变技术的具体方法为：将鱿鱼皮粉装入低温连续相变萃取釜中密封，设定相关萃取参数进行低温连续相变萃取操作，所述萃取温度为37℃，萃取压力为1.2mpa，萃取时间为50min，解析温度为60℃。

实施例2

一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法，将新鲜鱿鱼皮干燥，粉碎后过筛，得到鱿鱼皮粉，利用低温连续相变技术提取鱼油，得到的萃取残渣即为脱脂鱿鱼皮粉，过筛后加入鱿鱼内脏自溶液，脱脂鱿鱼皮粉与鱿鱼内脏自溶液的质量体积比为1：10，自溶2h后，105℃灭酶10min，离心，转速为10000r/min，收集上清液，加入10wt%亚硒酸钠溶液，超声波混匀，超声波功率为2000w，调节ph为7，恒温螯合，温度为45℃，向上清液中加入半乳糖，添加量为鱿鱼皮质量的10wt%，在合适条件下反应，所述合适条件为100℃、ph=7的条件下反应6h，醇沉，醇沉条件为按体积比1:1加入95%乙醇，溶于去离子水中调节相对密度为1.5，得到具有抗氧化活性的美拉德肽液。

所述内脏自溶液的制备方法为：将鱿鱼内脏以1︰5比例加入去离子水，搅拌机绞碎后高速匀浆，得到鱿鱼内脏自溶液。

所述低温连续相变技术的具体方法为：将鱿鱼皮粉装入低温连续相变萃取釜中密封，设定相关萃取参数进行低温连续相变萃取操作，所述萃取温度为37℃，萃取压力为1.2mpa，萃取时间为50min，解析温度为60℃。

实施例3

一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法，将新鲜鱿鱼皮干燥，粉碎后过筛，得到鱿鱼皮粉，利用低温连续相变技术提取鱼油，得到的萃取残渣即为脱脂鱿鱼皮粉，过筛后加入鱿鱼内脏自溶液，脱脂鱿鱼皮粉与鱿鱼内脏自溶液的质量体积比为1：7，自溶2h后，105℃灭酶10min，离心，转速为7000r/min，收集上清液，加入7wt%亚硒酸钠溶液，超声波混匀，超声波功率为1500w，调节ph为6.5，恒温螯合，温度为40℃，向上清液中加入麦芽糖，添加量为鱿鱼皮质量的7wt%，在合适条件下反应，所述合适条件为100℃、ph=7的条件下反应5h，醇沉，醇沉条件为按体积比1:1加入95%乙醇，溶于去离子水中调节相对密度为1.35，得到具有抗氧化活性的美拉德肽液。

所述内脏自溶液的制备方法为：将鱿鱼内脏以1︰5比例加入去离子水，搅拌机绞碎后高速匀浆，得到鱿鱼内脏自溶液。

所述低温连续相变技术的具体方法为：将鱿鱼皮粉装入低温连续相变萃取釜中密封，设定相关萃取参数进行低温连续相变萃取操作，所述萃取温度为37℃，萃取压力为1.2mpa，萃取时间为50min，解析温度为60℃。

对比例1

与实施例3相比，所述内脏自溶液由木瓜蛋白酶溶液替代，所述木瓜蛋白酶溶液的添加量为500u/kg。

一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法，将新鲜鱿鱼皮干燥，粉碎后过筛，得到鱿鱼皮粉，利用低温连续相变技术提取鱼油，得到的萃取残渣即为脱脂鱿鱼皮粉，过筛后加入木瓜蛋白酶溶液，调节ph为6，添加量为500u/kg，反应2h后，105℃灭酶10min，离心，转速为7000r/min，收集上清液，加入7wt%亚硒酸钠溶液，超声波混匀，超声波功率为1500w，调节ph为6.5，恒温螯合，温度为40℃，向上清液中加入麦芽糖，添加量为鱿鱼皮质量的7wt%，在合适条件下反应，所述合适条件为100℃、ph=7的条件下反应5h，醇沉，醇沉条件为按体积比1:1加入95%乙醇，溶于去离子水中调节相对密度为1.35，得到具有抗氧化活性的美拉德肽液。

对比例2

与实施例3相比，未加入亚硒酸钠溶液。

一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法，将新鲜鱿鱼皮干燥，粉碎后过筛，得到鱿鱼皮粉，利用低温连续相变技术提取鱼油，得到的萃取残渣即为脱脂鱿鱼皮粉，过筛后加入鱿鱼内脏自溶液，脱脂鱿鱼皮粉与鱿鱼内脏自溶液的质量体积比为1：7，自溶2h后，105℃灭酶10min，离心，转速为7000r/min，收集上清液，向上清液中加入麦芽糖，添加量为鱿鱼皮质量的7wt%，在合适条件下反应，所述合适条件为100℃、ph=7的条件下反应5h，醇沉，醇沉条件为按体积比1:1加入95%乙醇，溶于去离子水中调节相对密度为1.35，得到具有抗氧化活性的美拉德肽液。

对比例3

与实施例3相比，未加入麦芽糖。

一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法，将新鲜鱿鱼皮干燥，粉碎后过筛，得到鱿鱼皮粉，利用低温连续相变技术提取鱼油，得到的萃取残渣即为脱脂鱿鱼皮粉，过筛后加入鱿鱼内脏自溶液，脱脂鱿鱼皮粉与鱿鱼内脏自溶液的质量体积比为1：7，自溶2h后，105℃灭酶10min，离心，转速为7000r/min，收集上清液，加入7wt%亚硒酸钠溶液，超声波混匀，超声波功率为1500w，调节ph为6.5，恒温螯合，温度为40℃，得到具有抗氧化活性的肽硒螯合物溶液。

测试例1清除羟基自由基的试验

试验方法：

取8支具塞试管，分别加入0.2ml10mmol/l的feso4-edta混合液，0.2ml20mmol/l的2-d-脱氧核糖溶液，0.2ml受试样品（蒸馏水、实施例1-3、对比例1-3和阳性对照维生素c），并用pbs补充至1.8ml，最后加入0.2ml10mmol/l的过氧化氢，37℃水浴加热反应1h，以苯甲酸（1mg/ml）和抗坏血酸（1mg/ml）为对照，加入1ml10%的三氯乙酸终止反应，再加入1ml1%的硫代巴比妥酸，混匀后沸水浴中加热10min，冷却后离心取上清液，于532nm处测定吸光度。

羟基自由基的清除率/%=（a对照-a样品）/a对照×100

结果见图1。

测试例2清除超氧阴离子自由基能力测定

实验方法：采用邻苯三酚自氧化的方法进行清除超氧阴离子自由基能力的测定。

邻苯三酚自氧化反应速度的测定：测定试验在25℃下进行，向具塞试管中加入1.5mltris-hcl-edta缓冲液（ph8.2）和0.1ml6mmol/l的邻苯三酚（对照组以10mmol/l盐酸代替邻苯三酚），用去离子水补足至3ml，迅速混匀后，以对照管调零，在波长420nm处每0.5min测定一次吸光度，共测4min，以吸光度和时间作图，根据线性变化部分的斜率求出自氧化反应速度（δod420/min）；适当改变邻苯三酚的用量，使自氧化速度为0.02δod420/min左右。

受试样品对邻苯三酚自氧化反应速度的影响：测定过程与邻苯三酚自氧化相同，在反应体系中另加入0.1ml受试样品（蒸馏水、实施例1-3、对比例1-3和阳性对照维生素c），适当调整样品的浓度，使抑制下的氧化反应速度在0.007-0.013δod420/min。

超氧阴离子清除率/%=[δod420/min（自氧化）-δod420/min（样品管）]/δod420/min（自氧化）×100

结果见图2。

由图1和2可知，本发明实施例1-3制备的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液具有良好的羟基自由基的清除效果和清除超氧阴离子自由基的能力，明显优于维生素c。对比例1中未采用内脏自溶液，由木瓜蛋白酶替代，其酶解效果明显不如自溶液的溶解性，没有得到大量氨基酸和短肽，从而在后期美拉德反应时没有产生较多的抗氧化物质；对比例2中未添加亚硒酸钠溶液，溶液中氨基酸没有与亚硒酸钠中的硒螯合，降低了产物的抗氧化性能；对比例3中没有进行美拉德反应，没有进行美拉德反应的肽液抗氧化性能不佳。几个工艺的组合能够得到具有良好抗氧化效果的肽液。

本发明采用自溶液酶解脱脂鱿鱼皮，其效果明显优于单独使用木瓜蛋白酶酶解（对比例1），向酶解后的溶液中添加亚硒酸钠溶液，生成的螯合物继续与单糖进行美拉德反应，生成的肽液具有良好的抗氧化效果，明显优于未与亚硒酸钠溶液反应（对比例2）或者没有与单糖进行美拉德反应（对比例3）的对比例。

与现有技术相比，本发明采用低温连续相变技术萃取得到鱿鱼中的高附加值的产物鱼油，将鱿鱼脱脂，得到的脱脂产物对酶解及后续美拉德反应具有良好的反应性，得到的肽液纯度较高，抗氧化活性较好，且鱼油还可以另外售卖，附加值高，提高了其经济效益；

本发明得到了一种新的肽硒化合物和美拉德肽化合物的混合物，既满足了缺硒人群对硒的要求，又提供了安全性高的生物活性肽，该肽类同时具有良好的抗氧化活性，具有极好的保健效果；

本发明采用鱿鱼内脏自溶液酶解法，在内脏内含有大量的自溶酶，可有效的将鱿鱼皮中的蛋白质成分酶解，使大分子蛋白质水解为低分子肽，再经过美拉德反应，不仅增加了美拉德肽液的生物活性、抗氧化性能，也改善了风味，减少了鱼腥味带来的不愉快味道，同时产物为无色透明液体，增加了其美观程度，产生其特有的香味。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。