一种原核工程菌株及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种原核工程菌株及其制备方法和应用。

背景技术：

乙酰化甘油三酯是一种在sn-3端包含乙酰基团的特殊的甘油三酯。相较于常规的长链甘油三酯，乙酰化甘油三酯具有粘度低、在低温环境下活性好的优点，因此乙酰化甘油三酯能够直接应用于柴油当中作为生物燃料。另外，源于sn-3端的酰基，乙酰化甘油三酯能够作为1，2-二乙酸甘油三酯的半合成产物，这一类脂类能够应用于食物的乳化剂，润滑油，pvc的增塑剂和其他塑料制品。

美国的tam等人尝试用卫矛属(euonymus)植物来源的乙酰化甘油三酯合成酶基因对亚麻荠(camelinasativa)、大豆、拟南芥(arabidopsisthaliana)和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)进行基因工程改造，得到重组酿酒酵母，利用该工程株合成乙酰化甘油三酯。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

重组酿酒酵母菌除了合成乙酰化甘油三酯外，同时还会合成常规的甘油三酯，且合成的乙酰化甘油三酯仅为每克重组酿酒酵母菌干重的0.24％左右，占总甘油三酯重量的31％。若通过敲除重组酿酒酵母中合成常规的甘油三酯的编码基因后，虽能够使重组酿酒酵母菌只合成乙酰化甘油三酯，但同时生成的乙酰化甘油三酯仅为每克重组酿酒酵母菌干重的0.15％左右，且细胞生物量大幅减少。这极大的限制对乙酰化甘油三酯的提取与纯化，不利于乙酰化甘油三酯的大规模生产。

技术实现要素：

本发明实施例提供了一种原核工程菌株及其制备方法和应用，该原核工程菌株能够单一的合成高纯度的乙酰化甘油三酯。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种原核工程菌株，所述原核工程菌株表达的蛋白为甘油二酯乙酰化转移酶，所述甘油二酯乙酰化转移酶的氨基酸序列表中seqidno:1所示。

另一方面，本发明实施例提供一种上述原核工程菌株的制备方法，所述制备方法包括：

将efdact基因与载体连接，得到连接产物；

将所述连接产物转入感受态细胞中，得到转化产物；

将所述转化产物于37℃下发酵培养0.6～1h，得到复苏液；

将所述复苏液离心，得到浓缩液；

将所述浓缩液涂布在含壮观霉素抗性的固体培养基上，于37℃下摇床培养8～12h，得到所述原核工程菌株。

具体地，采用热击法将所述连接产物转入所述感受态细胞中。

具体地，所述热击法包括：将所述连接产物和所述感受态细胞混合后，置于冰上30～40min，得到混合液，将所述混合液置于42℃水浴锅中热击45s后，在冰上冷却2min，得到所述转化产物。

具体地，所述载体为pcdfduet-1或prsfduet-1。

具体地，所述感受态细胞为普通的大肠杆菌bl21(de3)的感受态细胞。

又一方面，本发明实施例提供了一种上述原核工程菌株的应用，所述应用包括：将所述原核工程菌株经过发酵培养合成乙酰化甘油三酯。

具体地，将所述原核工程菌株在含有浓度为2～10％的甘油的发酵培养基中进行培养。

具体地，所述原核工程菌株在所述发酵培养基中于120～180rpm的转速下摇床培养。

具体地，所述培养的温度为25℃，所述培养的时间为36～48h。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种原核工程菌株及其制备方法和应用，该原核工程菌株能够单一的合成高纯度的乙酰化甘油三酯，可以通该原核工程菌株实现乙酰化甘油三酯进行大规模生产，本发明实施例提供的制备方法能够获得大量的原核工程菌株，为乙酰化甘油三酯进行大规模生产提供基础，该应用包括将该原核工程菌株用于合成乙酰化甘油三酯。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的efdact扩增产物采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是本发明实施例提供的验证扩增产物采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是本发明实施例提供的硅胶板上脂质分布情况图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例

本发明实施例提供了一种原核工程菌株，该原核工程菌株表达的蛋白为甘油二酯乙酰化转移酶(diacylglycerolacetyltransferase，dact)，甘油二酯乙酰化转移酶的氨基酸序列表中seqidno:1所示，该甘油二酯乙酰化转移酶源自扶芳藤。

本发明实施例提供了一种原核工程菌株的制备方法，该制备方法包括：

将带有efdact(euonymusfortuneidiacylglycerolacetyltransferaseenzyme)基因的质粒与载体连接，得到连接产物pcdf::efdact(2560)；

在实现时，efdact基因由中国农业科学院提供。efdact基因的具体制备方法包括：以化学合成的efdact基因序列作为cdna模板，利用正向引物efdact-f和反向引物efdact-r进行pcr扩增，该扩增产物即为efdact基因。其中，正向引物的序列如序列表中seqidno:2所示，反向引物的序列如序列表中seqidno:3所示。上述pcr扩增体系共25μl，且该pcr扩增体系如表1所示。

表1为pcr扩增体系

pcr扩增程序如下：

将扩增产物采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示，由图1可知，电泳检测结果与实际一致。利用胶回收试剂盒(购置于北京擎科新业生物技术有限公司)回收目的基因片段(扩增产物)。

将目的基因片段与载体连接，得到连接产物，在本实施例中，载体可以为prsfduet-1，连接时可采用t4-dna连接酶(购于newenglandbiolabs)。

将连接产物转入感受态细胞中，得到转化产物；在本实施例中，该感受态细胞的制备方法为：

1、宿主大肠杆菌的培养

感受态细胞为普通的大肠杆菌bl21(de3)，该大肠杆菌bl21(de3)由中国农业科学院油料作物研究所应用微生物实验室保存提供。挑取新活化的大肠杆菌bl21(de3)的单一菌落，用牙签接种于2ml的lb液体无抗性培养基中，于37℃下恒温200rpm摇床培养12h，培养至大肠杆菌bl21(de3)的菌株生长到对数生长的后期，得到菌悬液。将1ml菌悬液接种于100ml的lb发酵培养基中，于37℃摇床培养3～4h直至od600为0.4～0.5，得到复苏后的大肠杆菌菌液。其中，lb液体无抗性培养基的制备方法包括：取5g进口酵母提取物、10g进口蛋白胨、10g无水氯化钠和1l无菌水混匀后，经121℃灭菌20min后使用。

2、采用cacl2法制备大肠杆菌感受态细胞

将发酵后的大肠杆菌菌液转入1.5ml预冷且无菌的ep管中，在冰上静置10min后，于4℃下4000rpm离心2min。

用微量移液器吸去上层清液，保留沉淀，用已经提前100μl预冷的solutiona溶液轻轻悬浮沉淀中的细胞，并在冰上静置2min左右后，于4℃下4000rpm离心2min。

用微量移液器吸去上层清液，保留沉淀，向沉淀中加入50～100μl预冷的solutionb溶液，轻轻悬浮沉淀中的细胞，在无菌操作台中将其分装成25～50μl的小份，在冰上放置2min以上，得到的大肠杆菌感受态细胞的菌液可直接用作宿主菌进行转化实验。

采用热击法将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中。具体地，在超净工作台上，取已经准备好的大肠杆菌感受态细胞的菌液，加入连接产物，轻轻摇匀，置于冰上30min左右。在已经准备好的42℃恒温水浴锅中热击45s，迅速在冰上冷却2min，得到转化产物。

将转化产物于37℃下发酵培养0.6～1h，得到复苏液；具体地，将转化产物培养于1ml的lb液体无抗性培养基中，于37℃摇床复苏1h左右。其中，lb液体无抗性培养基的制备方法包括：取5g进口酵母提取物、10g进口蛋白胨、10g无水氯化钠和1l无菌水混匀后，经121℃灭菌20min后使用。

将复苏液离心，得到浓缩液；具体地，将复苏液通过离心进行浓缩并摇匀。

将浓缩液涂布在含壮观霉素抗性的固体培养基上，于37℃下培养8～12h，得到原核工程菌株。具体地，取50μl涂布于含壮观抗性的lb固体平板培养基上，该1l的含壮观抗性的lb固体平板培养基的制备方法包括：称取5g进口壮观霉素粉末(购于biosharp公司)，溶解于100ml的去离子水中，使其终浓度为50mg/ml，用规格为0.22μm的抽滤器进行无菌抽滤，将抽滤产物分装至灭菌的ep管中，于-20℃保存。将含壮观抗性的lb固体平板培养基的正面朝上放置半小时到一个小时待复苏液完全被含壮观抗性的lb固体平板培养基吸收后倒置，于37℃条件恒温培养箱中培养8～12h。

将获得的转化子进行pcr扩增验证，获得原核工程菌株。该pcr扩增验证体系共25μl，且该pcr扩增验证体系如表2所示。

表2为pcr扩增验证体系

pcr扩增程序如下：

将验证扩增产物采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示，由图2可知，电泳检测结果与实际一致。

在120rpm的转速下经摇床发酵培养，发酵培养基为含有浓度为2～10％的甘油的zyp培养基，通过发酵培养使原核工程菌株合成乙酰化甘油三酯，发酵培养的温度为25℃，发酵培养的时间为36～48h。检测原核工程菌株合成的乙酰化甘油三酯。1l的发酵培养基的制备方法包括：取10g酶解酪蛋白、5g酵母提取物、17.9g十二水磷酸氢二钠、6.845g磷酸二氢钾、3.3035g硫酸铵和20g甘油，混合均匀后于115℃灭菌20min，再加入10ml100×硫酸镁母液、10ml100×葡萄糖和乳糖混合液和1ml1000×微量元素混合溶液。其中，100×硫酸镁母液的制备方法包括：称取4.92g硫酸镁溶于100ml去离子水中，单独灭菌。100×葡萄糖和乳糖混合液的制备方法包括：称取5g葡萄糖和20g乳糖溶于100ml去离子水中，经0.22μm抽滤器无菌抽滤，保存在4℃环境中待用。1000×微量元素混合溶液的制备方法包括：称取13.51g六水氯化铁、2.22g氯化钙、2.03g四水氯化亚锰、2.88g七水硫酸锌、0.48g六水氯化钴、0.34g二水氯化亚铜、0.12g氯化镍、0.48g四水钼酸钠、0.35g亚硒酸钠和0.12g硼酸，得到混合物，将2ml浓盐酸溶于1l去离子水中，得到混合液，将混合物加入混合液中经0.22μm抽滤器无菌抽滤，分装至灭菌的ep管中，保存在-20℃环境中待用。

乙酰化甘油三酯的检测：发酵结束后，将菌液转移至50ml离心管中，于6000rpm离心8min，并收集菌体(沉淀物)，将菌体放置于-80℃的超低温冰箱预冷1～2h。将预冷后的菌体放在真空冷冻干燥机中干燥24h，称重。用研钵将菌体研磨至粉末状，称取20mg菌粉，并转移至4ml螺纹玻璃瓶中，向螺纹玻璃瓶中依次加入1ml甲醇、1ml氯仿、10μl浓度为0.5mg/ml的十五烷酸甘油三酯标品和20μl浓度为1mg/ml的十五烷酸标品，将玻璃瓶超声振荡15min，使得菌粉和试剂充分互溶。然后在低速离心机中以3500rpm的速率离心10min，再以4000rpm离心5min，小心地将上清液(样品)转移至新的4ml螺纹玻璃瓶中，并于-20℃保存。

采用薄层层析(thin-layerchromatography，tlc)分离不同种类的油脂并进行分析，具体方法如下：

1、配置tlc层析剂：在通风橱中配制tlc层析剂，tlc层析剂包括体积比为70:30:1的色谱级正己烷、分析纯乙醚和分析纯乙酸，正己烷、乙醚和乙酸，将配制好的tlc层析剂后摇匀；

2、点样：在硅胶板(silicagel60，20×20cm；emdchemicals，germany)的一侧距边沿1.5cm处用铅笔画一条水平直线，按照一定的间隔在直线上标记所要点的样品。吹干后的样品用100μl色谱级氯仿复溶，在硅胶板相应的标记处点样，重复一次操作，点样时尽量保证每个点的直径尽可能小；

3、在点样结束前约10min，将配置好的tlc层析剂倒入层析缸内。点完样品后，将硅胶板置于展层缸中，进行展开。当tlc层析剂跑至距硅胶板上沿约1cm时，取出硅胶板在通风橱中晾干；

4、显色。将丙酮和水按照体积比为4:1进行混合，得到混合液，称取10mgprimuline溶于20ml混合液中制成显色液，将显色液均匀并喷在硅胶板的表面进行显色。在紫外灯下观察硅胶板上脂质分布情况，并拍照留存结果，其结果如图3所示，由图3可见乙酰化甘油三酯(acetyl-tag)条带、甘油三酯(tag)条带、游离脂肪酸(ffa)条带、甘油二酯(dag)和甘油单酯(mag)条带。将其中的乙酰化甘油三酯条带刮下来进行甲脂化，得到甲酯化的乙酰化甘油三酯。

将乙酰化甘油三酯进行气相定量分析：

将经过甲酯化的乙酰化甘油三酯转移至4ml螺纹透明玻璃瓶中，向螺纹透明玻璃瓶中加入0.75ml硫酸甲醇(硫酸甲醇中的硫酸与甲醇的体积比为5:95)，将螺纹透明玻璃瓶的瓶盖密封后振荡混匀。将螺纹透明玻璃瓶置于92℃水浴锅中进行水浴，水浴时间1.5h。待螺纹透明玻璃瓶冷却至室温以后，向螺纹透明玻璃瓶中加入500μl浓度为0.9％的nacl溶液和300μl色谱级正己烷，经过涡旋振荡1min，于3500rpm离心20min，得到上层溶液(有机相)，取上层溶液转移至1.5ml的ep管中，于12000rpm离心10min，得到上清液，将上清液转移至gc瓶中，采用气相色谱检测产物中的脂肪酸组成。

本实施例采用安捷伦7890a气相色谱仪来检测脂肪酸甲酯化样品，色谱条件如下：

分离脂肪酸甲酯采用的色谱柱为hp-ffap(30m×250μm×0.25μm)，氢离子火焰化检测器(flameionizationdetector，fid)；载气为纯度99.999％的氮气；按程序升温：最初开始温度，150℃，10℃/min升高温度至210℃，保持7min；继续以20℃/min升高温度至230℃，保持6min；分流比为30:1；进样口温度为260℃。

经检测，样品(bl21-pcdfduet-1::efdact)中的乙酰化甘油三酯占总甘油三酯的比例为100％。由此可见，通过原核工程菌株获得的乙酰化甘油三酯具有很高的纯度。

本发明实施例提供了一种原核工程菌株及其制备方法和应用，该原核工程菌株能够单一的合成高纯度的乙酰化甘油三酯，可以通该原核工程菌株实现乙酰化甘油三酯的大规模生产，本发明实施例提供的制备方法能够获得大量的原核工程菌株，为乙酰化甘油三酯进行大规模生产提供基础，该应用包括将该原核工程菌株用于合成乙酰化甘油三酯。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>一种原核工程菌株及其制备方法和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cggaattcgatgatggacgtacaccagg28

<210>2

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cttttgcggccgctcagttaccgcaaatgaaac33

<210>3

<211>363

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

metmetaspvalhisglngluileasnasnpheilelysvaltrpval

151015

glnalametalacysleusertyralatyrtyrpheserserargleu

202530

prolysglyleuleuargleuleuserleuleuprovalphetyrleu

354045

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505560

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65707580

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245250255

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260265270

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