一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法与流程

本发明涉及生物技术的基因工程领域，具体涉及利用crispr技术定向遗传改造米曲霉基因的方法。

背景技术：

米曲霉用于酱油、米酒等食品发酵已有悠久的历史，因此被认为是国际公认的食品安全级的真菌。2005年米曲霉基因组测序工作的完成，为加快遗传改造米曲霉，使其成为高效生产酶制剂、真菌代谢产物的理想菌株奠定了基础。但由于米曲霉多核，表型多变，对常用筛选标记药物不敏感，导致遗传改造米曲霉进展缓慢，工业生产应用受限。

当前米曲霉遗传操作的成功与否依赖于两个因素：第一个是筛选标记的选择；第二个是同源同组的效率问题。由于米曲霉对多种抗性药物不敏感，使得米曲霉遗传转化筛选主要依赖于营养缺陷型菌株的构建，而营养缺陷型菌株的构建费时，工作量大，其效率取决于同源重组的效率。目前研究表明，敲除参与非同源重组途径的基因能够促进同源重组效率，这些基因主要有ku70，ku80，ligd。因此，为了提高米曲霉遗传操作，常常需要构建ku70，ku80，ligd和营养双缺陷菌株。而且，对于工业应用中常需要转化多个基因，这样就需要构建包含多个营养缺陷的菌株，这无疑加大了遗传改造米曲霉的难度。此外，多个营养缺陷筛选标记的构建势必造成宿主菌株表型和代谢的改变，这对于后续利用该遗传改造的菌株造成影响。

利用crispr-cas系统在真菌中进行基因编辑，能够很好的解决上述问题。首先crispr-cas系统敲除基因的效率不依赖于同源同组，这样免去了敲除ku70，ku80，ligd的繁琐；其二，crispr-cas系统可利用一个营养缺陷筛选标记完成对多个基因的遗传改造。这些恰好解决了上述传统的同源重组改造米曲霉的困难。但crispr-cas系统也有一些弊端。例如crispr-cas表达盒若插入到异染色质上，引起cas9表达量低，造成基因编辑效率低；在米曲霉中常利用α淀粉酶诱导型启动子amyb启动表达cas9，该启动子受培养基中碳源类型诱导表达，而碳源类型对米曲霉的生长影响大，从而影响后续转基因表型鉴定；无法形成无标记(marker-free)的工程菌株，引起人们对转基因的担忧。为了解决上述crispr-cas系统的问题，本发明通过利用一种可以在aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体，并通过组成型启动子pgpda启动表达cas9，使cas9的表达不受插入位点及培养基组分影响，提高基因编辑效率，并能够形成marker-free工程菌株。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何高效的遗传改造米曲霉基因。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种基于crispr技术定向突变米曲霉基因的方法。

本发明所提供的基于crispr技术定向突变米曲霉基因的方法中，所包括的步骤如下：

1)以cas9序列(katayama等人(2016)biotechnollett38:637–642)为参考，人工合成cas9基因，其核苷酸序列为序列1所示的dna分子；以上述人工合成的cas9基因为模板，以序列seqidno:1，seqidno:2的dna片段为引物，执行pcr扩增获得的cas9dna分子重组连接到载体pex1上(该载体出自于nguyen等人(2016)worldjmicrobiolbiotechnol，32:204)。所述重组载体为将pex1的xhoi和bamhi识别序列间的dna替换为序列1所示的dna分子得到的重组载体pex1-cas9。pex1-cas9重组载体含有由构巢曲霉基因gpda基因启动子pgpda，序列1所示的cas9基因，trpc基因终止子(ttrpc)三部分组成的序列2所示的cas9蛋白表达盒，即pgpda-cas9-ttrpc。

2)以上述cas9蛋白表达盒pgpda-cas9-ttrpc为模板，以序列seqidno:3，seqidno:4的dna片段为引物，执行pcr扩增获得的cas9蛋白表达盒重组连接到载体pptrii上(日本takara公司，codeno.3622)。所述重组载体为在载体pptrii的hindiii多克隆位点上插入pgpda-cas9-ttrpc表达盒，得到重组载体pptrii-cas9，其中载体pptrii是一种可以在aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体。

3)以米曲霉rib40基因组dna为模板，以序列seqidno:5，seqidno:6的dna片段为引物，执行pcr扩增获得序列3所示的u6启动子(u6promoter)融合靶基因向导序列(guidesequence)，其中seqidno:6的dna片段含有靶基因的向导序列(20个碱基)，从而在该融合dna分子3’端融合了靶基因的向导序列，形成u6promoter+guidesequence的融合dna分子；以人工合成向导rna(single-guiderna,sgrna)和u6终止子序列(katayama等人(2016)biotechnollett38:637–642)为参考，人工合成sgrna融合u6终止子(u6terminator)的融合dna分子，其核苷酸序列为序列4所示的dna分子，并以此为模板，以seqidno:7，seqidno:8的dna片段为引物，执行pcr扩增获得序列4所示的sgrna融合u6终止子，其中seqidno:7的dna片段含有靶基因的向导序列(20个碱基)，从而在该融合dna分子5’端融合了靶基因的向导序列，形成guidesequence+sgrna+u6terminator的融合dna分子；以上述扩增的u6promoter+guidesequence，guidesequence+sgrna+u6terminator融合dna分子为模板，以seqidno:5，seqidno:8的dna片段为引物，执行重叠pcr扩增获得的u6promoter+guidesequence+sgrna+u6terminator表达盒重组连接到载体pptrii上。所述重组载体为在载体pptrii的smali多克隆位点上插入u6promoter+guidesequence+sgrna+u6terminator表达盒，得到重组载体pptrii-cas9-guidesequence。

4)米曲霉(rib40或3.042)孢子接种到液体dpy培养基中，培养16-20h后收集菌丝，并用无菌水洗2次。用yatalase酶法裂解上述菌丝，获取原生质体。将提取好的重组载体与原生质体混匀，加上60％peg4000进行原生质体转化，室温静置20min后，离心收集原生质体，并与含0.1μg/ml吡啶硫胺素，0.8％琼脂的mm培养基混匀，平铺在含0.1μg/ml吡啶硫胺素，1.5％琼脂mm培养基平板上，30℃培养3-4天。

5)挑取上述mm培养基长出的菌丝，转移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的cd培养基上，进行二次筛选。

6)选取上述长满菌丝的的cd平板，挑取菌丝，以seqidno:9，seqidno:10的dna片段为引物执行pcr扩增，并对扩增产物进行测序，比对测序结果看是否在靶基因的向导序列上发生突变。

7)为获得无标记(marker-free)的阳性菌株，将获得的二轮筛选出的阳性菌株在不含吡啶硫胺素的cd培养基上再连续培养四轮，挑取菌丝，以seqidno:11，seqidno:12的dna片段为引物执行pcr扩增，检测米曲霉是否还含有pptrii-cas9载体，并再次对靶基因的向导序列进行测序。

作为优选，步骤1)中cas9由组成型启动子pgpda启动表达。

作为优选，步骤2)利用pptrii载体中的ama1基因，实现在aspergillus属真菌内进行自主复制。

作为优选，步骤3)中序列seqidno:6，seqidno:7含有互补的20bp重叠序列，该序列恰好为靶基因向导序列。

作为优选，步骤3)中的重叠pcr具体程序为：取pcr产物各2μl，加上buffer、dntps、酶，退火温度为50℃，扩增5次后，再添加引物和补充0.5μl酶，退火温度改为60℃，继续扩增30个循环。

作为优选，步骤4)中的mm培养基的组分为：0.2％nh4cl，0.1％(nh4)2so4，0.05％kcl，0.05％nacl，0.1％kh2po4，0.05％mgso4·7h2o，0.002％feso4·7h2o，2％glucose，0.15％methionine，l.2msorbitol，ph5.5

作为优选，步骤4)中液体dpy培养孢子，最好不要超过20h，否则影响后续的原生质体转化效率。

作为优选，步骤4)中提取的质粒(重组载体)必须用去内毒素的方法提取纯化，这样有利于提高原生质体转化效率。

作为优选，步骤7)通过多轮筛选，获得无标记(marker-free)的米曲霉工程菌。

本发明的有益效果

本发明提供了利用一种可以在aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体，并通过组成型启动子pgpda启动表达cas9，定向遗传改造米曲霉基因的方法，该方法消除了载体插入位点和培养基组分对cas9表达的影响，提高了基因编辑效率，并且能够产生无标记(marker-free)的米曲霉工程菌，免除对转基因的担忧，提高转基因改造米曲霉的实用性。

附图说明

图1为pgpda-cas9-ttrpc表达盒的构建过程。

图2为pptrii-cas9载体构建过程。

图3为pptrii-cas9-aozfpb载体构建过程。

图4筛选培养基生长的转化子。

图5为转化子的鉴定。

图6为无标记(marker-free)crispr-aozfpb工程菌的检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

利用pptrii-cas9自主复制载体定向敲除米曲霉基因aozfpb

1、自主复制载体pptrii-cas9-aozfpb的构建

将载体pex1的xhoi和bamhi识别序列间的片段替换为序列1所示的dna分子，得到重组载体，将该重组载体命名为pex1-cas9。pex1-cas9与pex1的差别仅在于：pex1-cas9为将pex1的xhoi和bamhi识别序列间的dna替换为序列1所示的dna分子得到的重组载体。pex1-cas9重组载体含有由构巢曲霉基因gpda基因启动子pgpda，序列1所示的cas9基因，trpc基因终止子(ttrpc)三部分组成的序列2所示的cas9蛋白表达盒，即pgpda-cas9-ttrpc表达盒(图1)。

在自主复制的穿梭载体载体pptrii的hindiii多克隆位点上插入序列2所示的cas9蛋白表达盒(pgpda-cas9-ttrpc表达盒)，得到重组载体pptrii-cas9(图2)。

以米曲霉rib40基因组dna为模板，利用引物pu6-f：ctagaggatccccgggtaatgccggctcattcaaa、pu6-aozfpb-r：ttgcatctctggatccactgacttgttcttctttacaatgatttattta，扩增获得序列3所示的u6启动子融合aozfpb的向导序列(u6promoter+aozfpbguidesequence)(图3a)；以序列4所示的dna分子为模板，利用引物tu6-aozfpb–f：cagtggatccagagatgcaagttttagagctagaaatagcaagttaaa、tu6-r：gagctcggtacccgggagcagctctatatcacgtgacg扩增获得序列4所示的sgrna融合u6终止子的dna分子，并在该融合dna分子5’端融合了aozfpb的向导序列，形成aozfpbguidesequence+sgrna+u6terminator的融合dna分子(图3a)；以上述扩增的u6promoter+aozfpbguidesequence，aozfpbguidesequence+sgrna+u6terminator融合dna分子为模板，以pu6-f，tu6-r为引物，进行重叠pcr扩增，获得u6promoter+aozfpbguidesequence+sgrna+u6terminator表达盒(图3b)。在自主复制的穿梭载体载体pptrii的smali多克隆位点上插入u6promoter+aozfpbguidesequence+sgrna+u6terminator表达盒，得到重组载体pptrii-cas9-aozfpb(图3c)。

2、米曲霉的原生质体转化

将步骤1的pptrii-cas9-aozfpb质粒转化米曲霉rib40，具体方法为：

(1)将米曲霉rib40的孢子接种到100ml的液体dpy培养基中，200rpm，30℃培养16-20小时；

(2)用灭菌的双层擦镜纸过滤收集上述dpy培养基培养的菌球，并用无菌水洗涤2次，沥干；

(3)将步骤(2)洗涤沥干后的菌丝转移至过滤除菌的10mlyatalase酶裂解液(solutioni)中，50rpm，30℃裂解3小时；

yatalase酶裂解液组分：50mmmaleicacid(ph5.5)，1％yatalase

(takara)，0.6m(nh4)2so4；

(4)裂解完毕后，加入等体积的solutionii到步骤(3)的酶裂解中，用手摇晃数次，将上述酶液通过灭菌的双层擦镜纸过滤，用圆底管收集过滤液，1000rpm，8min，4℃，收集沉淀。用solutionii溶液洗涤沉淀一次，再离心收集，放在冰上，备用(图4a)；

solutionii组分：1.2msorbitol，50mmcacl2·2h2o，35mmnacl，10mmtris–hcl(ph7.5)；

(5)将～3μg质粒与200μl原生质体混匀，放在冰上静置30min；

(6)向上述混合液中依次加入250，250，850μl新鲜制备的peg溶液，每次加入后都轻轻混匀，最后黑暗条件下室温孵育20min；

peg溶液组分：60％(w/v)peg4000，50mmcacl2·2h2o，10mmtris–hcl(ph7.5)

(7)孵育后，缓慢的加入5–10mlsolutionii溶液，并轻轻的上下颠倒离心管混匀以终止反应，1000rpm，8min，4℃，收集原生质体；

(8)加入1mlsolutionii溶液重悬原生质体，并与含0.1μg/ml吡啶硫胺素，0.8％琼脂的mm培养基混匀，平铺在含0.1μg/ml吡啶硫胺素，1.5％琼脂mm培养基平板上，30℃培养3-4天(图4b)。

mm培养基的组分：0.2％nh4cl，0.1％(nh4)2so4，0.05％kcl，0.05％nacl，0.1％kh2po4，0.05％mgso4·7h2o，0.002％feso4·7h2o，2％glucose，0.15％methionine，l.2msorbitol，ph5.5

(9)挑取上述mm培养基长出的菌丝，转移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的cd培养基上，进行二次筛选(图4c)。

3、转化子的鉴定

选取上述长有菌丝的cd平板，挑取菌丝，转到50μl的水中，混匀；微波炉高火加热4min，冰中放置2min；吸取2μl作为模板,以seqidno:9，seqidno:10的dna片段为引物执行pcr扩增，并对扩增产物进行测序，比对测序结果看是否在向导序列上发生突变，结果如图5所示，米曲霉基因aozfpb的向导序列出现了一个碱基的缺失，该缺失位点恰好位于pam序列前3bp的位置。

为获得无标记(marker-free)的阳性菌株，将获得的二轮筛选出的阳性菌株在不含吡啶硫胺素的cd培养基上再连续培养四轮，挑取菌丝，以seqidno:11，seqidno:12的dna片段为引物执行pcr扩增，检测crispr-aozfpb工程菌是否还含有pptrii-cas9-aozfpb载体(是否能够扩增出载体上面的pu6_aozfpb_sgrna_tu6片段，并以pptrii-cas9-aozfpb载体为对照)，并再次对aozfpb的向导序列进行测序。结果显示：经过总共六轮的筛选，crispr-aozfpb米曲霉工程菌中的pptrii-cas9-aozfpb载体已检测不到(图6)，而aozfpb的向导序列依然出现了一个碱基缺失(图5)，因此成功获得了marker-free的阳性菌株。

序列表

<110>江西科技师范大学

<120>一种基于crispr技术定向遗传改造米曲霉基因的方法

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4218

<212>dna

<213>序列1(xulie1)

<400>1

atggattacaaggatgacgacgataagatcatggccccaaagaagaagcggaaggtcggt60

atccacggagtcccagcagccgacaagaagtactccatcggtctcgacatcggtaccaac120

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<211>5919

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<400>2

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