一种干细胞培养液及其应用的制作方法

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种干细胞培养液及其应用。

背景技术：

胚胎干细胞(embryonicstemcells，escs)在体内可分化为3个胚层来源的所有细胞，进而参与形成机体所有组织和器官，在再生医学、组织工程和药物发现与评价等领域极具应用价值。但是escs面临的伦理、免疫排斥以及资源不足等难题在干细胞生物学的基础研究和临床应用中阻碍了其发展，而人类诱导多功能干细胞(humaninducedpluripotentstemcells，hipsc)的获取方法则能很好的克服了这些问题。因此，在同样称之为“干细胞”领域内，hipsc相比于胚胎干细胞，既可以避免生理伦理问题，又可避免无法控制的分化差异。

hipsc是具有类似胚胎早期多能干细胞分子特性、更新能力和分化潜能的一类多能干细胞，可以经人工干预定向分化成特定的功能性细胞、组织和器官，在体外已成功地被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等，为疾病机制研究与细胞治疗提供了全新的途径。现有研究通过hipsc表明，oct4基因和nanog基因共同调控细胞的生长发育和维持全能性，lin基因和fgf4基因不仅在维持细胞全能性上发挥重要作用，而且促进了细胞增值和组织修复。

但是，hipsc是一种难以在体外进行培养的细胞，培养环境要求严格，采用常规培养方式进行培养容易出现生长缓慢、死亡率较高，研究表明，在细胞分离和解离后易于凋亡，在完全解离后大量细胞会凋亡，并且解离后细胞的克隆效率较低，而细胞实验中细胞的生长与繁殖是关键的一步，这些问题对于细胞实验进行是一大阻碍，因此寻求一种新的培养方式来改善hipsc的生长状况至关重要。

y-27632([(+)-(r)-trans-4-(1-aminoethyl)-n-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamidedihydrochloride])被广泛用作rho相关的卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(rock)家族的特异性抑制剂，是一种atp竞争性的rock-i和rock-ii抑制剂，已被证实具有调节干细胞的自我更新、促进克隆形成和存活的作用。y-27632在研究中也被广泛证明对hipsc的生长具有促进的作用。但是，y-27632存在较大毒性，如被吸入、皮肤接触或不慎吞咽会对人体有较大伤害，而且保存条件严格，以冻干粉形式保存的化学稳定期为24个月，一旦配成溶液，3个月后便会失效，并且需要注意的是，反复冻融会对其化学稳定期有较大的影响。

技术实现要素：

本发明提供了一种干细胞培养液及其应用，该干细胞培养液添加有生长因子，可减少y-27632的使用。

本发明的具体技术方案如下：

一种干细胞培养液，包括tesr-e8培养基、y-27632和生长因子；

所述生长因子选自fgf2、tgf-β和wnt的一种或多种。

本发明干细胞培养液包括tesr-e8培养基、y-27632和生长因子，将生长因子与y-27632共同使用，通过改变细胞的生化活性和生长，以及调节细胞的增殖速率，影响细胞分化，从而刺激细胞和组织功能，并可减少y-27632的使用量，该干细胞培养液具有很好的稳定性，可减少因使用y-27632而造成的安全问题和质量问题，并能进一步改善hipsc的生长状况。

优选的，所述y-27632的浓度为4mm～6mm；

所述生长因子的浓度为4mm～6mm。

优选的，所述y-27632的浓度为5mm；

所述生长因子的浓度为5mm。

实验结果表明，在tesr-e8培养基中加入了y-27632，能够改善hipsc培养过程中的生长状况，并且通过浓度梯度的细胞复苏图和血球计数板计数图，表明y-27632的浓度为10mm时，相对于其它浓度，hipsc的存活状态最佳，但是和加入了生长因子(5mmy-27632+5mm生长因子)的干细胞培养液相比，hipsc在后者中的生长状况更为良好。并且，本发明干细胞培养液具有很好的稳定性，hipsc的数量生长完全符合干细胞的生长趋势。

优选的，所述生长因子为wnt。

本发明还提供了上述技术方案所述干细胞培养液在培养干细胞中的应用。

优选的，所述干细胞为hipsc、psc、ipsc或esc，更优选为hipsc，进一步优选为hipsc-u1。

优选的，所述干细胞培养液的接种密度为4000个/ml～20000个/ml。

本发明还提供了上述技术方案所述干细胞培养液在复苏干细胞中的应用。

综上所述，本发明提供了一种干细胞培养液，包括tesr-e8培养基、y-27632和生长因子；所述生长因子选自fgf2、tgf-β和wnt的一种或多种。本发明干细胞培养液包括tesr-e8培养基、y-27632和生长因子，将生长因子与y-27632共同使用，可减少y-27632的使用量，该干细胞培养液具有很好的稳定性，可减少因使用y-27632而造成的安全问题和质量问题，并能进一步改善hipsc的生长状况。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中采用组别1培养液的hipsc复苏图；

图2为本发明实施例1中采用组别2培养液的hipsc复苏图；

图3为本发明实施例1中采用组别3培养液的hipsc复苏图；

图4为本发明实施例1中采用组别4培养液的hipsc复苏图；

图5为本发明实施例1中采用组别5培养液的hipsc复苏图；

图6为本发明实施例1中采用组别6培养液的hipsc复苏图；

图7为本发明实施例1中hipsc在不同组别培养液生长的血球计数板计数图；

图8为本发明实施例1中hipsc在组别6培养液中的生长数量图。

具体实施方式

本发明提供了一种干细胞培养液及其应用，该干细胞培养液添加有生长因子，可减少y-27632的使用。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，hipsc具体为hipsc-u1，购自北京赛贝有限公司，ca4002106；vtn-n购自gibco，a14700；tesr-e8培养基购自stemcell，cat.05990；y-27632购自tocris，cat.1254；wnt购自merck，srp4754。

实施例1

1)对培养皿进行铺板处理

将100μlvtn-n和10mldpbs在15ml离心管中混合均匀配置成10％基底液，取1ml基底液均匀加入35mm培养皿中，然后将培养皿放置37℃培养箱中孵育1h。

2)hipsc的解冻处理

从液氮罐中取出装有细胞(hipsc-u1)的冻存管，在37℃恒温水浴下轻轻快速摇晃融化，时间约1min左右。然后用吸水纸将冻存管上的水擦拭干净，再喷上酒精，最后放入超净台。

3)对细胞悬浮液进行离心沉淀操作

使用移液枪轻轻吹打细胞悬浮液1-3次来吹散聚集成团的细胞后，将细胞悬液转移至添加有3mltesr-e8培养基的15ml离心管内，轻轻吹打1次后放入离心机，以1000r/min的速度，室温离心4min。

4)配置不同组别的培养液

组别1：tesr-e8培养基；

组别2：按0.5μly-27632加入至1999.5μltesr-e8培养基的体积比配制培养液，y-27632的浓度为2.5mm；

组别3：按1μly-27632加入至1999μltesr-e8培养基的体积比配制培养液，y-27632的浓度为5mm；

组别4：按2μly-27632加入至1998μltesr-e8培养基的体积比配制培养液，y-27632的浓度为10mm；

组别5：按3μly-27632加入至1997μltesr-e8培养基的体积比配制培养液，y-27632的浓度为15mm；

组别6：按1μly-27632和1μlwnt加入至1998μltesr-e8培养基的体积比配制培养液，y-27632的浓度为5mm，生长因子的浓度为5mm。

5)将离心后沉积的细胞重悬配置成细胞悬浮液

将步骤3)离心后的离心管内溶液快速倒去，若离心管内还有残余溶液，用移液枪快速吸弃之，留下沉积的细胞，分别加入步骤4)配置好的不同组别的2ml培养液，轻轻吹打细胞悬液1次，制成六组4000个/ml的细胞浓度悬浮液。

6)在培养皿中培养细胞

使用移液枪将步骤1)铺板处理1h后的35mm培养皿中的vtn-n—dpbs基底液吸弃之，再将步骤5)在离心管内配制好的2ml细胞悬浮液轻吹1次后，直接倒入35mm培养皿内，然后快速前后、左右摇匀后，放置于37℃、5％co2培养箱中进行培养，每24h更换一次新的培养液。

7)记录细胞形态和计算细胞增殖数量

使用光学显微镜和ccd(chargecoupledevice)技术对复苏培养2d后的hipsc进行拍照记录，在培养3d后将35mm培养皿中的培养基吸走，加入0.25％的胰酶把hipsc消化下来后，加入新鲜培养液配成细胞悬浮液，采用血球计数板计算细胞数量，然后对细胞悬浮液进行离心沉淀操作后重复步骤5)和步骤6)。

此步骤每3d进行一次，直至p3代。

结果请参阅图1至图7，图1至图6依次为采用组别1至6培养液的hipsc复苏图，其中为了更好地展现出hipsc的形貌结构，图6为采用相差显微镜拍摄的hipsc复苏图，图7为hipsc在不同组别培养液生长的血球计数板计数图。结果表明，在tesr-e8培养基中加入了y-27632，能够改善hipsc培养过程中的生长状况，y-27632的浓度为10mm时，相对于其它浓度，hipsc的存活状态最佳，但是和加入了生长因子(5mmy-27632+5mm生长因子)的干细胞培养液相比，hipsc在后者中的生长状况更为良好，生长因子与y-27632共同使用，可减少y-27632的使用量，提高hipsc的存活率，并能进一步改善hipsc的生长状况。

实施例2

对三组hipsc采用组别6培养液进行复苏培养并统计三天中hipsc的数量，结果如图8所示，图8为本发明实施例1中hipsc在组别6培养液中的生长数量图，结果表明本发明干细胞培养液具有很好的稳定性，hipsc的数量生长完全符合干细胞的生长趋势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。