一种高通量单细胞小RNA文库构建方法与流程
本发明属于单细胞小rna测序技术领域，涉及一种高通量单细胞小rna文库构建方法。
背景技术：
mirna是一种广泛存在于真核生物中，可调节其他基因的表达的非编码rna。mirna与一种或多种mrna分子部分互补，以各种方式下调基因表达，包括翻译抑制，mrna剪切和脱腺苷化，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。mirna在癌症等相关疾病形成过程中也起着关键的作用，已经被用于癌症的诊断、分期、进展、预后以及评估治疗的反应性等方面。
现有技术中，illumina公司和neb等生物公司采用小rna标准建库试剂盒。其样本要求起始量高，最低100ngtotalrna，无法做到单细胞(10pg/cell)水平；没有设计barcode，无法将多个样品混合建库；没有设计umi，无法降低由pcr引入的偏好性；接头自连产物与非特异性产物多，导致目的片段连接和扩增困难，建库效率低；page胶回收实验操作繁琐，危险性高。faridani等人发表于2016年naturebiotechnology杂志和2018年natureprotocol杂志中关于单个细胞smallrna建库过程，该方案由于接头残留过多，并且在实验过程中没有进行目的片段筛选和回收，导致产物中接头自连产量极高，目的产物含量不到1％，测序需要的数据量大大增加，造成了极大的浪费；该方案无单细胞分子标签，使得实验无法提高通量，不能进行多个细胞同时操作；该方案对于3’接头和5’接头没有末端加入随机序列的改进，使得在连接反应过程中，连接反应可能产生偏好性。
因此，目前尚未发展出可在高度异质性的肿瘤样本中，分析单细胞的mirna表达谱的可行性方法。肿瘤样本通常包含正常细胞和癌细胞，癌细胞中mirna的表达谱常会被数据分析所掩盖。因此，需要一种高灵敏度、高通量的单细胞小rna测序文库构建方法。
技术实现要素：
基于现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种高通量单细胞小rna文库构建方法。本发明的目的还在于提供通过该方法构建获得的单细胞小rna文库。本发明的方法具有准确度高、灵敏度高、重复性好等优点。
本发明的目的通过以下技术手段得以实现：
一方面，本发明提供一种高通量单细胞小rna文库构建方法，其包括以下步骤：
制备单细胞悬浮液，将其加入到单细胞操作系统的芯片的微孔中，并选择单一活细胞的微孔进行实验；
依次进行细胞裂解反应、3’端连接反应、去除游离接头反应、5’端连接反应、反转录反应和两次pcr反应；
产物进行纯化和片段筛选回收，从而获得能够直接用于上机测序的单细胞小rna文库；
在进行3’端连接反应过程中，所采用的3’接头(ra3-a2n)的核苷酸序列如seqidno：1所示；
在进行5’端连接反应过程中，所采用的5’接头(sr5f)的核苷酸序列如seqidno：2所示。
本发明利用单细胞操作系统及上述设计的平行单细胞小rna测序(pscsr-seq)流程，通过修饰改良3’接头和5’接头，其中，3’接头的核苷酸序列如下：
seqidno：1：/rapp/nnctgtaggcaccatcaat/ddc/(5’→3’)
(rapp表示酰化腺苷；ddc表示双脱氧胞苷；划线部分为特异性分子标签3’umi，n表示a、g、c或t，为随机序列)
5’接头的核苷酸序列如下：
seqidno：2：
rgrarcrargrarcrarararurcrarcrgrarararnrnrarararnrnrarararnrn(5’→3’)
(划线部分为特异性分子标签5’umi，rn表示a、c、g或u，为随机序列)。
本发明中，3’接头两端进行了修饰改良，同时设置了随机序列，一端引入了3’umi；5’接头一端进行了重新设计，引入了含义随机序列的5’umi。5’接头序列分两部分中，5’端部分为通过模拟计算设计出的最佳序列组合，3’端部分为带有间隔序列的umi序列nnaaannaaann，这一设计的目的是避免连续6个n导致在反转录中产生非特异性结合。此种优化的5’接头和3’接头提高了连接效率和准确性，降低了连接过程中接头的偏好性带来的影响。
上述的方法中，制备单细胞悬浮液的过程还包括对细胞进行染色和计数的步骤。
上述的方法中，通过将细胞分别加入到单细胞操作系统的芯片的多个微孔中，并对每个微孔进行拍照，选择单一活细胞的微孔。
上述的方法中，优选地，所述的方法，其中，进行细胞裂解反应是将细胞裂解液加入到已选择的微孔中，然后将芯片移至pcr仪中进行孵育和加热反应。
上述的方法中，优选地，所述细胞裂解液的成分包括tritonx-100裂解液和核糖核酸酶抑制剂。
上述的方法中，进一步优选地，所述细胞裂解液的成分包括0.5％的tritonx-100裂解液和0.14u的核糖核酸酶抑制剂(每35nl的细胞裂解液)。
上述的方法中，优选地，进行细胞裂解时的孵育温度为25℃，孵育时间为5min；加热反应的温度为75℃，加热时间为5min。
上述的方法中，细胞内游离的smallrna分子很少，需要加热把smallrna从蛋白质复合体(risc)中释放。发明人研究发现，在进行细胞裂解时，加热反应的温度设定为75℃反应5min，该条件下能够有助于mirna从rna诱导的沉默复合物(risc)中释放出来，提高mirna的产物收率。本发明对细胞裂解液的优化和对细胞裂解反应条件的优化，能够实现细胞裂解后无需对rna进行纯化，且不会对后续实验造成影响。
上述的方法中，优选地，进行3’端连接反应是将3’端连接反应液加入到已选择的微孔中，执行3’端连接反应程序。
上述的方法中，优选地，所述3’端连接反应液的成分包括3’接头、t4rna连接酶2(截短型kq)、t4rna连接缓冲液和核糖核酸酶抑制剂。
上述的方法中，进一步优选地，所述3’端连接反应液的成分包括0.07pmol的3’接头、2.1u的t4rna连接酶2(截短型kq)、0.9x的t4rna连接缓冲液和0.05u的核糖核酸酶抑制剂(“x”表示原始商品浓度基础上的稀释倍数)(每35nl的3’端连接反应液)。
上述的方法中，优选地，进行3’端连接反应过程为25℃孵育6h、然后4℃反应8～10h、最后65℃加热20min。
上述的方法中，优选地，在进行去除游离接头反应前，还包括将反转录混合物加入到已选择的微孔中，然后将芯片移至pcr仪中，进行加热反应。
优选地，所述反转录混合物的成分包括带标签的反转录引物和lambda核酸外切酶反应缓冲液。
上述的方法中，进一步优选地，所述反转录混合物的成分包括0.7pmol的带标签的反转录引物和0.5x的lambda核酸外切酶反应缓冲液(每35nl的反转录混合物)。
所述带标签的反转录引物的序列包括如seqidno：3至seqidno：74所示中的一种或多种。
上述的方法中，带标签的反转录引物的核苷酸序列具体如下：(5’→3’)
cttggcacccgagaattccagatcgcnnnnnngattgatggtgcctacag(seqidno：3)
cttggcacccgagaattccagcaggannnnnngattgatggtgcctacag(seqidno：4)
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cttggcacccgagaattccaaacaggnnnnnngattgatggtgcctacag(seqidno：70)
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cttggcacccgagaattccaatgaatnnnnnngattgatggtgcctacag(seqidno：73)
cttggcacccgagaattccaccaagannnnnngattgatggtgcctacag(seqidno：74)
(其中，划线部分为标签，记为3’barcode)
上述的方法中，优选地，进行加热反应的温度为70℃，反应时间为2min。
上述的方法中，优选地，进行去除游离接头反应是将去除接头反应液加入到已选择的微孔中，然后将芯片移至pcr仪中，执行去接头反应程序。
上述的方法中，优选地，去除接头反应液的成分包括lambda核酸外切酶、5’去腺苷化酶和核糖核酸酶抑制剂。
上述的方法中，进一步优选地，去除接头反应液的成分包括0.087ulambda核酸外切酶、0.23u的5’去腺苷化酶和0.05u的核糖核酸酶抑制剂(每35nl的去接头反应液)。
上述的方法中，优选地，进行去接头反应过程为30℃孵育30min、然后37℃孵育60min、最后75℃加热10min。
上述的方法中，优选地，进行5’端连接反应是将5’端连接反应液加入到已选择的微孔中，然后将芯片移至pcr仪中，执行5’端连接反应程序。
上述的方法中，优选地，所述5’端连接反应液的成分包括5’接头、t4rna连接酶1(高浓度)、t4rna连接缓冲液和核糖核酸酶抑制剂。
上述的方法中，进一步优选地，所述5’端连接反应液的成分包括0.07pmol的5’接头、0.315u的t4rna连接酶1(高浓度)、0.9x的t4rna连接缓冲液和0.05u的核糖核酸酶抑制剂(每35nl的5’端连接反应液)。
上述的方法中，优选地，进行5’端连接反应过程为37℃孵育1h、然后65℃加热20min。
上述的方法中，优选地，进行反转录反应是将反转录反应液加入到已选择的微孔中，然后将芯片移至pcr仪中，执行反转录反应程序。
上述的方法中，优选地，所述反转录反应液的成分包括一链合成缓冲液、dtt、dntp、核糖核酸酶抑制剂和superscriptiii反转录酶。
上述的方法中，进一步优选地，所述反转录反应液的成分包括0.75x的一链合成缓冲液、7mm的dtt、0.2mm的dntp、0.074u的核糖核酸酶抑制剂和1.1u的superscriptiii反转录酶(每35nl的反转录反应液)。
上述的方法中，优选地，所述反转录反应过程为55℃反应50min、然后70℃加热15min。
本发明的上述反转录过程中，采用superscriptiii反转录酶并在酶结合温度为55℃下反应，较常规反应温度42℃升高了温度，减少了特异性结合产物的生产，能够准确的反映出mirna的起始浓度。
上述的方法中，优选地，进行第一次pcr反应是将pcr-1反应液加入到已选择的微孔中，然后将芯片移至pcr仪中，执行pcr-1反应程序；收集反应液，利用磁珠纯化pcr-1产物，然后对pcr-1产物进行片段筛选回收。
上述的方法中，优选地，所述pcr-1反应液的成分包括带标签的pcr-1引物、dntp、pcr缓冲液和dna聚合酶。
上述的方法中，进一步优选地，所述pcr-1反应液的成分包括1um的带标签的pcr-1引物、0.1mm的dntp、0.4x的pcr缓冲液和0.007u的dna聚合酶(每35nl的pcr-1反应液)。
上述的方法中，优选地，所述带标签的pcr-1引物的序列包括如seqidno：75至seqidno：146所示中的一种或多种。
上述的方法中，带标签的pcr-1引物的核苷酸序列具体如下：(5’→3’)
gttcagagttctacagtccgacgatcaaccaagacagacaaatcacgaaa(seqidno：75)
gttcagagttctacagtccgacgatccgataggacagacaaatcacgaaa(seqidno：76)
gttcagagttctacagtccgacgatcagaagagacagacaaatcacgaaa
(seqidno：77)
gttcagagttctacagtccgacgatcgagcctgacagacaaatcacgaaa(seqidno：78)
gttcagagttctacagtccgacgatctagtcagacagacaaatcacgaaa(seqidno：79)
gttcagagttctacagtccgacgatcactgcagacagacaaatcacgaaa(seqidno：80)
gttcagagttctacagtccgacgatccagcatgacagacaaatcacgaaa(seqidno：81)
gttcagagttctacagtccgacgatcccgcctgacagacaaatcacgaaa(seqidno：82)
gttcagagttctacagtccgacgatccctagcgacagacaaatcacgaaa(seqidno：83)
gttcagagttctacagtccgacgatccgcaacgacagacaaatcacgaaa(seqidno：84)
gttcagagttctacagtccgacgatctggcctgacagacaaatcacgaaa(seqidno：85)
gttcagagttctacagtccgacgatcgcggttgacagacaaatcacgaaa(seqidno：86)
gttcagagttctacagtccgacgatcagtcaagacagacaaatcacgaaa(seqidno：87)
gttcagagttctacagtccgacgatcagttccgacagacaaatcacgaaa(seqidno：88)
gttcagagttctacagtccgacgatcatgtcagacagacaaatcacgaaa(seqidno：89)
gttcagagttctacagtccgacgatcccgtccgacagacaaatcacgaaa(seqidno：90)
gttcagagttctacagtccgacgatcgtagaggacagacaaatcacgaaa(seqidno：91)
gttcagagttctacagtccgacgatcgtccgcgacagacaaatcacgaaa(seqidno：92)
(seqidno：93)
(seqidno：94)
(seqidno：95)
(seqidno：96)
(seqidno：97)
(seqidno：98)
(seqidno：99)
(seqidno：100)
(seqidno：101)
(seqidno：102)
(seqidno：103)
(seqidno：104)
(seqidno：105)
(seqidno：106)
(seqidno：107)
(seqidno：108)
(seqidno：109)
(seqidno：110)
(seqidno：111)
(seqidno：112)
(seqidno：113)
(seqidno：114)
(seqidno：115)
(seqidno：116)
(seqidno：117)
(seqidno：118)
(seqidno：119)
(seqidno：120)
(seqidno：121)
(seqidno：122)
(seqidno：123)
(seqidno：124)
(seqidno：125)
(seqidno：126)
(seqidno：127)
(seqidno：128)
(seqidno：129)
(seqidno：130)
(seqidno：131)
(seqidno：132)
(seqidno：133)
(seqidno：134)
(seqidno：135)
(seqidno：136)
(seqidno：137)
(seqidno：138)
(seqidno：139)
(seqidno：140)
(seqidno：141)
(seqidno：142)
(seqidno：143)
(seqidno：144)
(seqidno：145)
(seqidno：146)
(其中，划线部分为标签，记为5’barcode；
上述的pcr-1引物序列中，引物中加入了细胞标签，并在设计时插入了0～3个碱基，能够使得测序过程中相同序列的部分依次向后移动，彼此交错，这样可以使测序仪测序效率更高，降低了后续文库测序过程中的信号干扰问题。
上述的方法中，优选地，进行pcr-1反应过程为95℃反应3min、然后12～14个循环95℃反应20s、然后65℃反应20s、然后72℃反应20s、最后72℃反应5min。
上述的方法中，优选地，利用ampurexp磁珠(优选1.7x)纯化pcr-1产物，并用agilent2100生物分析仪检测产物片段大小分布，接着用qubitdsdnahs检测试剂盒进行定量。
上述的方法中，优选地，进行第二次pcr反应是将回收的pcr-1产物作为模板，配制pcr-2反应液，执行pcr-2反应程序。
上述的方法中，优选地，所述pcr-2反应液的成分包括scsr-pcr-1引物、scsr-pcr-2引物、dntp、pcrbuffer和dna聚合酶。
上述的方法中，进一步优选地，所述pcr-2反应液的成分包括0.35um的scsr-pcr-1引物、0.35um的scsr-pcr-2引物、0.35um的dntp、1x的pcrbuffer和0.02u的dna聚合酶(每35μl的pcr-2反应液)。
上述的方法中，优选地，所述scsr-pcr-1引物的序列如seqidno：147所示，所述scsr-pcr-2引物的序列包括如seqidno：148至seqidno：159所示中的一种或多种。
所述scsr-pcr-1引物的序列具体如下：(5’→3’)
aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttcagagttctacagtccgacga(seqidno：147)
所述scsr-pcr-2引物的序列具体如下：(5’→3’)
caagcagaagacggcatacgagatcgtgatgtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：148)
caagcagaagacggcatacgagatacatcggtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：149)
caagcagaagacggcatacgagatgcctaagtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：150)
caagcagaagacggcatacgagattggtcagtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：151)
caagcagaagacggcatacgagatcactgtgtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：152)
caagcagaagacggcatacgagatattggcgtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：153)
caagcagaagacggcatacgagatgatctggtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：154)
caagcagaagacggcatacgagattcaagtgtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：155)
caagcagaagacggcatacgagatctgatcgtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：156)
caagcagaagacggcatacgagataagctagtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：157)
caagcagaagacggcatacgagatgtagccgtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：158)
caagcagaagacggcatacgagattacaaggtgactggagttccttggcacccgagaattcca(seqidno：159)
上述的方法中，优选地，进行pcr-1反应过程为95℃反应3min、然后7～13个循环反应95℃反应20s、然后67℃反应20s、然后72℃反应20s、最后72℃反应5min。
上述的方法中，优选地，利用ampurexp磁珠(1.5x)纯化pcr-2产物，利用pippinprep(185～220nt)筛选产物片段；用qubit高灵敏度试剂盒测定文库的含量，用agilent2100生物分析仪测定其大小分布，用文库定量试剂盒检测其质量。
上述方法中，通过两步pcr反应，中间加入纯化及片段筛选步骤，使得反应效率更高，同时有效减少非特异性产物的比例。
上述的方法中，优选地，所述单细胞操作系统为icell8。
本发明的方法中，细胞、细胞裂解液、3’端连接反应液、带有标签的反转录引物、去除接头反应液、5’端连接反应液、反转录反应液、pcr-1反应液均是通过icell8单细胞操作系统中的分液装置msnd加入到已选择的微孔中的。
本发明的方法中，采用的是icell8单细胞操作系统中的分液装置msnd，该msnd利用的是微孔注射技术，其能够注射35nl的3’端连接反应液，实现纳升级的反应，发明人研究发现纳升级反应能够增加反应物的有效浓度，提高3’接头的去除效率，同时能够抑制副产物的生成和提高目标产物的生成。
上述的方法中，优选地，所述细胞包括a549细胞、人外周血单核细胞或小鼠b16f10细胞，但不限于此。本发明的方法能够分析不同种类的单个细胞的mirna谱，均取得了良好的效果，体现出本发明方法无细胞类型特异性。
另一方面，本发明还提供上述方法构建获得的高通量单细胞小rna文库。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用icell8单细胞操作系统开发了平行单细胞小rna测序技术(pscsr-seq)，利用本发明的技术有效构建获得了高通量单细胞小rna文库，本发明的方法具有准确度高、灵敏度高、重复性好等优点。
(2)本发明构建文库过程中所采用的接头和引物经过修饰改良，加入了随机序列和标签，提高了连接效率和准确性，降低了连接和扩增过程中接头和引物的偏好性带来的影响，引物中加入了细胞标签，并在设计时插入了0～3个碱基，降低了后续文库测序过程中的信号干扰问题。
(3)本发明构建文库的过程中，优化了实验体系，例如：针对细胞裂解液的优化、针对反转录反应液的优化等；优化了实验条件，例如：采用msnd微孔注射反应体系、裂解过程中反应温度的优化等；提高了连接效率和反转录效率，从而使得建库效率明显提高，通过有效去除剩余接头、片段筛选等方式，使得非目的片段减少，节省了后续文库测序的费用。
(4)本发明构建文库的方法适用范围广，无细胞类型特异性，对于培养细胞、血液，甚至组织样本都具有良好的效果，生物危险性低。
附图说明
图1为本发明高通量单细胞小rna文库构建方法的流程图；
图2为本发明对比例1中连接反应液用量不同对小rna文库产率的对比图；
图3为本发明对比例2中细胞裂解反应条件不同对小rna文库产率的对比图；
图4为采用本发明建库方法与对比例3的现有建库方法连接效率的对比图；
图5为采用本发明建库方法与对比例4的现有建库方法的小rna文库对比图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
下述实施例中所采用的化学试剂，若无特殊要求，均为市售获得。实施例中未详细说明的方法条件，按照领域中的常规技术或说明书的建议操作进行。下述表1为本发明涉及到的主要试剂的中英文名称及购买厂商和规格。
表1
实施例1a549细胞的高通量单细胞小rna文库构建(流程图如图1所示)
(1)准备a549细胞
在dmem/f-12基本培养基中加入10％(v/v)胎牛血清和1％青霉素-链霉素，作为a549细胞系培养环境。将a549细胞系置于环境温度为37℃，二氧化碳含量为5％的湿化培养箱中培养。实验时，取新鲜细胞，用1x磷酸盐缓冲盐(dpbs)水洗涤细胞两次，之后将细胞悬浮在含有0.04％牛血清白蛋白的1xdpbs中。细胞悬液用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dipa)染色标记死亡细胞。用bdfacsariaiii流式细胞仪对活细胞进行分选富集获得细胞悬液。
(2)对细胞进行染色和计数，制备单细胞悬液
细胞悬液用hoechst-33342和碘化丙啶染色，用readyprobescellviabilityimagingkit在冰上静置20min，离心300xg，5min，用1ml含有0.04％bsa的1xdpbs重新悬浮细胞。细胞计数后，细胞悬液被含有1xseconddiluent和0.4u(“u”表示酶活力单位)recombinant
(3)采用icell8单细胞操作系统进行操作，细胞悬浮液被分到一个smartericell8350v芯片的5184个微孔中。所有icell8芯片的微孔都用荧光显微镜(olympusbx43)成像，并使用cellselect软件(takara)分析图像，以确定存活的细胞和细胞数量。
(4)经单细胞分选后，在选定的微孔中加入含有0.5％tritonx-100(t9284，sigma-aldrich)和0.14uribonucleaseinhibitor(核糖核酸酶抑制剂)的混合液进行细胞裂解反应，芯片被转移到pcr仪(bio-rad)上，在25℃孵育5分钟，75℃加热5分钟，立即放置在冰上。
(5)制备含0.07pmol3'接头(ra3-a2n)(其核苷酸序列如seqidno：1所示)、2.1ut4rnaligase2，truncatedkq、0.9xt4rnaligasebuffer和0.05uribonucleaseinhibitor(核糖核酸酶抑制剂)的混合液，将混合液加入到选定的微孔中，进行3’端连接反应。微芯片在25℃孵育6小时，4℃反应8-10小时，然后65℃加热20分钟。
(6)3’接头连接后，将反转录物混合物(0.7pmol带标签的反转录引物[scsr-rtp](其核苷酸序列如seqidno：3～seqidno：74所示)、0.5xlambdaexonucleasebuffer)加入384孔板的a5-p8、a9-d9、a10-d10孔中。执行“index1”程序，将35nl带标签的反转录引物分配到选定的微孔中。将芯片放置在pcr仪上70℃加热2分钟，然后在冰上静置。
(7)制备接头去除反应液(0.087ulambdaexonuclease、0.23u5’deadenylase、0.05uribonucleaseinhibitor)，并分配到选定的微孔中进行去接头反应程序。将芯片离心后置于pcr仪中，30℃孵育30分钟，37℃孵育60分钟，然后75℃加热10分钟。
(8)将0.7pmol5’接头(sr5f)(其核苷酸序列如seqidno：2所示)和1mmatp在70℃孵育2分钟，然后加入到5'连接混合物(0.315ut4rnaligase1(ssrnaligase)、highconcentration、0.9xt4rnaligasebuffer、0.05uribonucleaseinhibitor)中，将之分配到选定的微孔中进行5’端连接反应程序，用37℃连接1小时，65℃加热20分钟。
(9)进行逆转录：逆转录反应液由0.75xfirst-strandbuffer、7mmdtt、0.2mmdntp、0.074uribonucleaseinhibitor、1.1usuperscriptiiireversetranscriptase组成，加入微孔中并在55℃反应50分钟，70℃加热15分钟。
(10)进行pcr-1反应：将1um带标签的pcr-1引物(sr5f-p1)(其核苷酸序列如seqidno：75～seqidno：146所示)与0.1mmdntp、0.4xpcrbuffer、0.007uphantahssuper-fidelitydnapolymerase混合，加入到384孔板中(位置a13-p16，a17-d17，a18-d18)，将35n1pcr-1混合物经“index-2”程序注入微孔中。将芯片被放置在pcr仪上，在95℃下反应3分钟，然后12-14个循环95℃反应20秒，65℃反应20秒，72℃反应20秒，最后在72℃下反应5分钟。反应后芯片被倒置和离心3000xg10分钟，产物收集到离心管中。
收集的pcr-1产物用1.7xampurexp磁珠纯化回收。用agilent2100生物分析仪检测产物片段大小分布，并用qubitdsdnahs检测试剂盒进行定量。用pippinprep对产物进行片段筛选回收，回收范围为105-160nt。
(11)进行pcr-2反应：回收后的dna作为模板，进行pcr-2反应。反应体系为：0.35mmdntp、1xpcrbuffer、0.02uphantamaxsuper-fidelitydnapolymerase、0.35umscsr-pcr-1引物(其核苷酸序列如seqidno：147所示)、0.35umscsr-pcr-2引物(其核苷酸序列如seqidno：148～seqidno：159所示)，反应条件为：在95℃下反应3分钟，然后12个循环95℃反应20秒，67℃反应20秒，72℃反应20秒，最后在72℃下反应5分钟。
用1.5xampurexp磁珠纯化回收pcr-2产物，并用185-220nt的pippinprep筛选产物的大小，从而构建获得能够直接用于上机测序的单细胞小rna文库。
(12)文库测序：用qubit高灵敏度试剂盒测定pscsr-seq文库的含量，用agilent2100生物分析仪测定其大小分布，用文库定量试剂盒检测其质量。样品用illuminahiseq2500和hiseqxten仪器进行测序。
实施例2人外周血单核细胞(pbmcs)的高通量单细胞小rna文库构建
(1)准备人外周血单核细胞
将健康献血者的静脉血采集到含有肝素钠抗凝剂的收集管内，用ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(pbmcs)。肝素化的血液用等体积的1xdpbs溶解，并加入到含有等体积histopaque-1077的sepmatetm-15分离管中。将分离管在离心力1200xg条件下离心10分钟后，快速将pbmcs倒入新的50ml管内，并用1xdpbs洗涤两次，再用1xdpbs悬浮细胞。用cd45，cd3，cd19+，cd20，cd56+，cd14+对细胞进行染色，并用bdfacsariaiii流式细胞仪进行分选富集。
对人外周血单核细胞进行高通量单细胞小rna文库的构建，其构建方法同上述实施例1。
实施例3小鼠b16f10细胞的高通量单细胞小rna文库构建
(1)小鼠b16f10细胞的培养及肿瘤植入
在dmem基本培养基中加入10％(v/v)胎牛血清和1％青霉素-链霉素，作为黑色素瘤细胞系b16f10培养环境。将b16f10细胞置于环境温度为37℃，二氧化碳含量为5％的湿化培养箱中培养。
对5只8-10周龄的c57bl/6雌性小鼠在无特定病原体(spf)条件下自由进食和饮水。将小鼠置于12小时光暗循环的ivc笼中，用co60辐射灭菌的实验室饲料喂养。植入实验当天，更换新鲜培养基培养4小时后收集细胞，在冷的1xdpbs中悬浮细胞，最终浓度为3x105cell/ml。在每只动物尾静脉中注射100ul细胞悬液，产生实验性肺转移。从细胞接种后第12天开始，用二氧化碳对动物实施安乐死，并收集肺转移组织。一只小鼠的转移灶和周围的肺组织汇集在一起，切成2～4毫米的小片。用肿瘤分离试剂盒将这些片段分离成单细胞悬液。细胞悬液用ack溶解液溶解剩余红细胞，用死细胞去除试剂盒去除死细胞后，再通过40ul滤网过滤。细胞悬液用dapi染色，并用bdfacsariaiii流式细胞仪进行分选富集。
对小鼠b16f10细胞进行高通量单细胞小rna文库的构建，其构建方法同上述实施例1。
对比例1：
3’端连接反应液用量对比(反应体积从10μl减少到1nl)，结果如图2所示：
图2中，(a)～(c)为优化前的，(d)～(f)为优化后的。
(a)、(d)为优化前后，使用1pg合成的mirna作为建库样本；
(b)、(e)为优化前后，使用100pguniversalhumanmirnareferencerna标准品(totalrna)作为建库样品；
(c)、(f)为优化前后，使用100个a549细胞作为建库样品。
由图2可以看出：在相同的反应液浓度条件，减小反应体系(从10μl减少到1nl)可以显著增加连接反应效率，进而提高建库效率，增加文库产量。
对比例2：
细胞裂解反应过程中，反应温度时间不同的对比，进行了8组实验。其中：
(a)25℃，10min；(b)37℃，10min；(c)75℃，10min；(d)80℃，10min；(e)85℃，10min；(f)95℃，10min；(g)70℃，5min；(h)75℃，5min(实施例1)。实验结果如图3所示。
由图3可以看出：图3中(a)至(f)图结果说明在相同处理时间内，反应温度的变化可以导致小rna文库产物不同，其中75-80℃产量最高；图3中(g)至(h)图说明缩短反应时间到5min，不会影响小rna释放产量。最终得出结论，75℃下反应5min为最佳反应条件。
对比例3：
采用faridani等人发表于2016年naturebiotechnology杂志的关于单个细胞smallrna建库过程和本发明的建库方法进行对比实验，实验结果如图4所示。实验结果图从左到右依次为对比例、实施例1、实施例2(两组平行实验)、实施例3。
体现连接效率的指标为：在所得的测序数据中，具有有效接头信息的序列所占的比例。通过图4可以看出：对比例的方法有效数据占总测序数据不到1％；而本发明的实验结果中，有效数据信息约占70％以上。
对比例4：
采用faridani等人发表于2018年natureprotocol杂志中关于单个细胞smallrna建库过程和本发明实施例1的建库方法进行对比实验，实验结果如图5所示。图5中的(a)～(c)依次为对比例的小rna文库、空白对照和片段回收产物，可以看出小rna文库与空白对照几乎一致，说明图中最高峰为非目的片段；图中的(d)～(f)依次为本发明实施例1的小rna文库、空白对照和片段回收产物，可以看出：图5的(a)图中，对比例实验结果中非目的片段(接头二聚体)，而在图5的(d)图中，本实例中的小rna文库产物明显，与引物二聚体峰高相等；通过片段回收后，在图5的(c)图中，对比例回收产物全部为非目地片段，小rna文库几乎不可见，而在图5的(f)图中，实验例可有效分离出单一小rna文库产物。
序列表
<110>北京生命科学研究所
<120>一种高通量单细胞小rna文库构建方法
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<212>dna
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<213>人工序列()
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<212>dna
<213>人工序列()
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<212>dna
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<213>人工序列()
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<212>dna
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<213>人工序列()
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<213>人工序列()
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<213>人工序列()
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<213>人工序列()
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gttcagagttctacagtccgacgatcccttcaaggacagacaaatcacgaaa52
<210>125
<211>52
<212>dna
<213>人工序列()
<400>125
gttcagagttctacagtccgacgatccgaataaggacagacaaatcacgaaa52
<210>126
<211>52
<212>dna
<213>人工序列()
<400>126
gttcagagttctacagtccgacgatccggagaaggacagacaaatcacgaaa52
<210>127
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>127
gttcagagttctacagtccgacgatcactaagtaggacagacaaatcacgaaa53
<210>128
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>128
gttcagagttctacagtccgacgatcgaagcttaggacagacaaatcacgaaa53
<210>129
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>129
gttcagagttctacagtccgacgatcgactattaggacagacaaatcacgaaa53
<210>130
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>130
gttcagagttctacagtccgacgatcgagtaataggacagacaaatcacgaaa53
<210>131
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>131
gttcagagttctacagtccgacgatcgcagtctaggacagacaaatcacgaaa53
<210>132
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>132
gttcagagttctacagtccgacgatcgctcaataggacagacaaatcacgaaa53
<210>133
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>133
gttcagagttctacagtccgacgatcggatattaggacagacaaatcacgaaa53
<210>134
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>134
gttcagagttctacagtccgacgatcgtaagataggacagacaaatcacgaaa53
<210>135
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>135
gttcagagttctacagtccgacgatcgtatcttaggacagacaaatcacgaaa53
<210>136
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>136
gttcagagttctacagtccgacgatcgtcatctaggacagacaaatcacgaaa53
<210>137
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>137
gttcagagttctacagtccgacgatctaacgttaggacagacaaatcacgaaa53
<210>138
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>138
gttcagagttctacagtccgacgatcttactttaggacagacaaatcacgaaa53
<210>139
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>139
gttcagagttctacagtccgacgatcttctgataggacagacaaatcacgaaa53
<210>140
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>140
gttcagagttctacagtccgacgatctggtcctaggacagacaaatcacgaaa53
<210>141
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>141
gttcagagttctacagtccgacgatcgttaagtaggacagacaaatcacgaaa53
<210>142
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>142
gttcagagttctacagtccgacgatctcgcggtaggacagacaaatcacgaaa53
<210>143
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
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<210>144
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>144
gttcagagttctacagtccgacgatcaacggttaggacagacaaatcacgaaa53
<210>145
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>145
gttcagagttctacagtccgacgatcaccagataggacagacaaatcacgaaa53
<210>146
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>146
gttcagagttctacagtccgacgatcagcggctaggacagacaaatcacgaaa53
<210>147
<211>53
<212>dna
<213>人工序列()
<400>147
aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttcagagttctacagtccgacga53
<210>148
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
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caagcagaagacggcatacgagatcgtgatgtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
<210>149
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>149
caagcagaagacggcatacgagatacatcggtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
<210>150
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>150
caagcagaagacggcatacgagatgcctaagtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
<210>151
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>151
caagcagaagacggcatacgagattggtcagtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
<210>152
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>152
caagcagaagacggcatacgagatcactgtgtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
<210>153
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>153
caagcagaagacggcatacgagatattggcgtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
<210>154
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>154
caagcagaagacggcatacgagatgatctggtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
<210>155
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>155
caagcagaagacggcatacgagattcaagtgtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
<210>156
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>156
caagcagaagacggcatacgagatctgatcgtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
<210>157
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>157
caagcagaagacggcatacgagataagctagtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
<210>158
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>158
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cca63
<210>159
<211>63
<212>dna
<213>人工序列()
<400>159
caagcagaagacggcatacgagattacaaggtgactggagttccttggcacccgagaatt60
cca63
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