一种利用σ70非依赖型抗胁迫启动子实现异丁醛稳定高产的方法与流程

本发明涉及一种抗胁迫启动子高产异丁醛的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

异丁醛工业上主要是加氢生产异丁醇，异丁醇是一种新型生物燃料，具有高能量密度、低吸湿性等优势；此外，异丁醛也用作氨基酸、维生素等药物的中间体；用于合成纤维素酯、香精、香料等；还可用于制造橡胶硫化促进剂和防老剂、异丁酸等。

为最大化细胞工厂生产异丁醛的产量并使产率接近理论值，异丁醛合成途径必须能够持续高效地表达，以便最小化菌体生物量的增长及副产物的生成对资源的消耗。理想状况下，菌体只进行一定程度的生长繁殖，在此期间合成异丁醛生产所需的前体物质及辅因子，当细胞数量达到生产需求时生长停止，合成途径开始高效表达。如果消除了生长对资源的竞争，途径酶可将前期累积的全部生产资源直接转化为目标化合物，此时细胞工厂的生产能力达到顶峰。然而，这一高产阶段通常难以维持。这是因为合成途径的表达一般依赖于看家型的σ⁷⁰因子，这类σ因子主导必需基因的转录，在对数生长期效用最强。当细胞进入稳定期后，胞内与胞外环境胁迫随之出现，此时胁迫响应σ³⁸因子大量生成，与σ⁷⁰竞争数量有限的rnap核心酶。且稳定期dna超螺旋程度下降，谷氨酸盐类抗胁迫物质累积等胞内环境的变化也更有利于σ³⁸与核心酶的结合。因此，途径基因的转录通常与生长相偶联，一旦细胞生长停滞，合成途径的表达也随即下降，胞内资源开始大量分配给胁迫抵御等生存维持活动。因此，解除合成途径对σ⁷⁰的唯一性依赖，增强其对σ³⁸的兼容性是实现生产途径持续表达的关键。

以σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子gada替代常规的σ⁷⁰型启动子驱动异丁醛的合成，实现了稳定期和酸胁迫条件下异丁醛合成途径的稳定表达。机理研究发现gada启动子不受菌体生长期转变时胞内σ因子更替的影响，可被σ⁷⁰及σ³⁸型rnap分别转录，表现出对低ph、谷氨酸盐累积、dna超螺旋松弛等胁迫条件的抵御能力，能够在几乎整个细胞生长周期及胁迫条件下发挥转录活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种实现异丁醛稳定高产的方法，利用σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子gada替代常规的σ⁷⁰型启动子驱动异丁醛的合成，实现了稳定期和酸胁迫条件下异丁醛合成途径的稳定表达，最终通过摇瓶发酵实验确定菌株最终的异丁醛产量，为实现异丁醛稳定高产提供新的方法。

按照本发明提供的技术方案，一种利用σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子实现异丁醛稳定高产的方法，采用

以下方法步骤：

1、以大肠杆菌mg1655的基因组为模板，扩增包括上游完整非编码区(–1至–183)的gada启动子pgada183

2、异丁醛合成途径由alss-ilvc/d和kivd两个操纵子组成，分别在psa69和psa65两个质粒上，通过gibsonassembly将pgada183插入至alss-ilvc/d操纵子的rbs上游，替换原始启动子pllaco1，得到质粒pmx1。

3、以类似2、3方法将psa65质粒上的pllaco1替换为pgada183，得到质粒pmx2。

4、以jcl260菌株作为异丁醛生产的底盘宿主，将pmx1、pmx2转入jcl260感受态细胞中，涂于平板上培养。

5、将步骤4中转化得到的单菌落转接到少量培养基中培养得到种子液。

6、将种子液接入发酵培养基中进行发酵验证。

油醇可以从水相中高效萃取异丁醛，培养前在发酵瓶中加入同发酵液体积相同的油醇，监测产量时分别从油相与水相等体积取样。

异丁醛发酵所用m9培养基配方为：6.0g/lna2hpo4，3.0g/lkh2po4，1.0g/lnh4cl，0.5g/lnacl，1mmmgso4，0.1mmcacl2，10mg/lvitaminb1，8.5％葡萄糖，1％酵母提取物，调节ph至7.0。另加入100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素。

附图说明

图1：gada启动子是一种生长期独立型抗胁迫启动子，可以在各类生理条件下驱动生物燃料合成途径的高效表达；

图2：葡萄糖添加量，初始ph，发酵液体积，油醇萃取对gada启动子驱动下异丁醛生产的产量(a)，葡萄糖消耗量(b)，od600(c)及产率(d)的影响。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。

以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。

实施例1、一种利用gada启动子实现异丁醛稳定高产的方法

异丁醛合成途径由alss-ilvc/d和kivd两个操纵子组成，分别装载于psa69和psa65两个骨架上。以大肠杆菌mg1655的基因组为模板，扩增包括上游完整非编码区(–1至–183)的gada启动子pgada183，通过gibsonassembly将其插入至alss-ilvc/d操纵子的rbs上游，替换原始启动子pllaco1，得到质粒pmx1。以类似方法将psa65质粒上的pllaco1替换为pgada60，得到质粒pmx2。

基因pcr体系为：fastpfuflybuffer10μl，dntp(2.5mm)4μl，引物2μl，fastpfuflydnapolymerase1μl,模板1μl，蒸馏水32μl，总体积为50μl。扩增条件为95℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性5分钟，55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。连接体系：1.5μlpcr扩增产物、1μlpsa69载体片段，7.5μlgibsonmastermix(购自newenglandbiolabs)，轻轻混合，50℃水浴反应60分钟。随后加入50μldh5α感受态细胞中(购于北京博迈德基因技术有限公司)，冰浴30分钟，42℃热激30秒，立刻置于冰上2分钟。加入250μlsoc培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1小时。因为psa69骨架含有氨苄青霉素抗性基因，取200μl菌液涂于含有氨苄青霉素的lb平板上，过夜培养。待lb平板上长出单菌落后，经pcr测序验证后将阳性克隆进行液体培养，提取质粒进行测序验证。测序结果表明pmx1质粒构建正确，用类似方法构建pmx2质粒。

以前期构建的jcl260菌株作为异丁醛生产的底盘宿主，将pmx1、pmx2两质粒化转jcl260感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热激90秒，立刻置于冰上2分钟。加入250μlsoc培养基，于37℃、200rpm摇床中震荡培养1小时。因为pmx1、pmx2含有氨苄青霉素、卡那青霉素抗性基因，取200μl菌液涂于含有氨苄青霉素、卡那青霉素的lb平板上，过夜培养。

将单菌落接种至5mllb培养基，于37℃，250rpm下培养12h，得到种子液。取400μl接种至20ml发酵培养基中(2％v/v)，加入诱导剂iptg至终浓度0.1mm，于250ml密闭三角瓶条件，30℃，250rpm下发酵。

采用可以从水相中高效萃取高级醇的油醇进行油提法发酵。油醇用量与发酵液体积相同，在培养前随发酵液一同加入发酵瓶，监测产量时从油相与水相等体积取样。补料连续发酵时，每次取样后补充等体积的新鲜油醇与m9培养基。

样品于4000×g离心5min，吸取上清液，采用气相色谱法检测生成的异丁醛。所用色谱仪为agilent6890，配备火焰离子化检测器，色谱柱为安捷伦db-ffap毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)，氮气为载气。采用分流进样法，吸样量0.2μl，分流比50:1。对于水相中的异丁醇，升温程序为：80℃3min，115℃/min升温至230℃，维持1min，120℃/min升温至235℃，维持2min。对于油相中的异丁醇，升温程序为：90℃0.5min，20℃/min升温至110℃，维持0.5min,120℃/min升温至235℃，维持2min。进样口与检测器温度分别为250℃和280℃。异丁醛标样浓度为1g/l，并以1g/l的正戊醇为内标。

异丁醛发酵所用m9培养基配方为：6.0g/lna2hpo4，3.0g/lkh2po4，1.0g/lnh4cl，0.5g/lnacl，1mmmgso4，0.1mmcacl2，10mg/lvitaminb1，8.5％葡萄糖，1％酵母提取物，调节ph至7.0。另加入100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素。