一种从富含γ-氨基丁酸的发酵液中制备粉状γ-氨基丁酸的方法与流程

本发明属于生物技术领域，特别属于微生物发酵产物提取领域，是一种从富含γ-氨基丁酸的发酵液中制备粉状γ-氨基丁酸的方法。

背景技术：

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，gaba)是一种普遍存在于动植物和微生物体内的非蛋白质天然氨基酸。在哺乳动物体内gaba几乎只作用于神经系统，是中枢神经系统内最重要的抑制性氨基酸递质，大约有30％的中枢神经突触以它为介质。gaba具有多种生理功能，主要有调节血压与心率、改善肝脏和肾脏功能、抗衰老、抗癫痫、调节激素分泌等，因此，它既可以作为一种药效良好的药物，又可以被视为具有保健功能的新型功能因子，广泛应用于食品和医疗卫生行业。

由于gaba在水中的溶解度非常大，且受温度的影响较小，所以仅采用降温或者蒸发处理很难结晶出来，在实际操作中可以考虑加入有机溶剂的方法来促进其晶体的形成。因此，现存的gaba精制工艺主要为乙醇辅助结晶法，即加入乙醇降低gaba溶解度，利用旋转蒸发仪使gaba结晶析出，但是这种方法花费时间长，效率低下，乙醇用量大，安全隐患大，不适合大规模批量精制gaba。

喷雾干燥工艺由于在物料干燥过程中具有受热时间短、料温低和生理活性物质活性损失小等特点被广泛应用于多种热敏性物质的干燥，除此之外，喷雾干燥后的粉末颗粒度小而均匀，具有良好的分散性和速溶性。

技术实现要素：

本发明目的是克服现有的乙醇辅助结晶法的不足，提出一种新型的gaba制备技术，旨在减少环境污染，提高生产效率，为gaba的工业化生产提供技术支持。

本发明的另一个目的是对喷雾干燥的各项参数利用响应面法进行优化，公布了最佳的喷雾干燥工艺提取gaba的最佳参数。

具体步骤如下：

1)在无菌条件下接种一环活化好的短乳杆菌(lactobacillusbrevis)cgmccno.3414培养基斜面菌苔于装有40ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃静置培养8～16h；取培养后的种子悬液按10％(v/v)的接种量接种到装有40ml发酵培养基的250ml三角瓶中，30℃静置培养发酵8～16h后补加50～150g/l谷氨酸钠，继续发酵培养60h。

其中种子培养基：蛋白胨5～10g/l，酵母浸粉5～10g/l，葡萄糖10～15g/l，乙酸钠2～5g/l，柠檬酸铵1～2g/l，硫酸锰0.05～1g/l，硫酸镁0.2～1g/l，吐温-801～5ml，ph自然。

发酵培养基：蔗糖35～50g/l，酵母浸粉30～50g/l，谷氨酸钠50～100g/l，乙酸钠2～5g/l，磷酸氢二钾2～5g/l，硫酸镁0.2～1.0g/l，硫酸铵0.2～1.0g/l，柠檬酸5～10g/l，β-甘油磷酸钠0.1～0.5g/l，精氨酸0.001～0.01g/l，硫酸锌0.1～0.5g/l，维生素b15～10mg/l，维生素b55～10mg/l，维生素b65～10mg/l，ph4.5。

2)将发酵液通过8000r/min离心5min，除去发酵液中菌体

3)采用da201-cii大孔吸附树脂脱色，在室温环境下，在室温环境下，将去除菌体的发酵上清液调节ph为4.5，以1～4bv/h的流速动态上柱脱色，上样处理体积为3～6bv，脱色处理后对树脂床以1～3bv/h的流速冲洗1～3bv体积量的蒸馏水。

4)将脱色后的脱色液在ph4.0、空间流速为1～3bv/h的条件下采用d001大孔强酸性苯乙烯阳离子交换树脂动态吸附，上样1～3bv后用1～3bv的1mol/l氨水洗脱。

利用单因素实验对喷雾干燥的8个因素：助干剂种类、进风温度、料液流速、喷雾压力、助干剂添加量、固形物质量分数、撞针执行时间、撞针间隔时间等参数进行确定，然后综合单因素实验结果，本发明根据box-benhnken中心组合试验设计原理，选取对喷雾干燥结果影响最大的进风温度、喷雾压力和助干剂添加量为实验因素，以最终产品得率以及综合评分为响应值，进行3因素3水平响应面分析试验。优化gaba发酵液的喷雾干燥工艺条件。

如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。

与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：

喷雾干燥后的粉末颗粒度小而均匀，具有良好的分散性和速溶性，此方法与传统的gaba提取方法相比较，减少了环境污染，提高了生产效率与生产安全性。。

附图说明

图1不同种类的助干剂对喷雾干燥效果的影响

图2不同进风温度对喷雾干燥效果的影响

图3不同进料速度对喷雾干燥效果的影响

图4不同喷雾压力对喷雾干燥效果的影响

图5不同麦芽糊精添加量对喷雾干燥效果的影响

图6不同固形物含量对喷雾干燥效果的影响

图7不同撞针间隔时间对喷雾干燥效果的影响

图8不同撞针执行时间对喷雾干燥效果的影响

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，这里所述实施例的方案，不限于本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。

实施例1

分别对助干剂种类、进风温度、料液流速、喷雾压力、助干剂添加量、固形物质量分数、撞针执行时间、撞针间隔时间等8个因素进行单因素实验，研究各因素变化对喷雾干燥效果的影响。将初始试验条件固定为进风温度130℃，料液流速600ml/min，喷雾压力0.4mpa，撞针执行时间3s，撞针间隔时间3s，助干剂添加量35％，固形物质量分数3.5％，分别将进风温度改变为120、130、140、150、160℃，料液流速改变为600、700、800、900、1000ml/min，喷雾压力改变为0.25、0.3、0.35、0.4、0.45mpa，助干剂添加量改变为20、25、30、35、40％，固形物质量分数改变为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0％，撞针执行时间与撞针间隔时间分别改变为2、3、4、5、6s，进行喷雾干燥，结果以gaba的集粉率和产物的综合评分进行综合评定。根据图1得到最佳的助干剂为麦芽糊精，由图2～图8可知，当进风温度为130℃、料液流速为700ml、喷雾压力为0.35mpa、麦芽糊精添加量为30％，固形物含量为4.5％、撞针间隔时间为3s、撞针执行时间为3s时，喷雾干燥效果达到最优。

综合评分标准

选择10名相关人员组成评价小组，确定色泽、质感、气味和黏壁情况为gaba发酵液喷雾干燥产品感官评定的4个指标。将各试验结果4项指标的分值相加，即为各试验方案的感官评价分值。具体评价标准及分值见表1。

表1综合评分标准

实施例2

综合单因素试验结果，本实验根据box-benhnken中心组合试验设计原理，选取对喷雾干燥结果影响最大的进风温度、喷雾压力和助干剂添加量为实验因素，以最终产品得率以及综合评分为响应值，进行3因素3水平响应面分析试验优化gaba发酵液的喷雾干燥工艺条件。实验因素和水平见表2。利用design-expert软件对box-behnken实验设计结果进行二次多项回归拟合，建立集粉率和综合评分对进风温度、喷雾压力和助干剂添加量三个显著性影响因子的多元二次响应面回归模型，得到的二次回归方程为：

y1＝-1025.38+10.86*a+1181.36*b+11.87*c-0.67*ab+0.00075*ac-1.04*bc-0.04*a²-1521.3*b²-0.19*c²

y2＝-465.58+6.02*a+408*b+5.77*c-0.5*ab+0.01*ac-bc-0.0235*a²-440*b²-0.114*c²

式中y1代表集粉率，y2代表综合评分，a代表进风温度，b代表喷雾压力，c代表助干剂添加量

对所求得的线性回归方程进行分析，发现其存在稳定点，本次实验中的稳定点也是极大值点。在线性回归方程上对三个显著性的影响因子分别求偏导，得到a(进风温度)130.20℃，b(喷雾压力)0.35mpa，c(助干剂添加量)29.74％，此时集粉率可以达到63.63％，综合评分达到85。

表2响应面分析因子及水平表

实施例3

为了检验响应曲面法所得结果的可靠性，同时考虑到实际操作的便利，将喷雾干燥工艺参数调整进风温度为130℃，喷雾压力为0.35mpa，助干剂添加量为30％，在此条件下进行验证实验，所得结果为：集粉率62.74％，综合评分85，与预测值相比偏差很小，表明基于响应曲面法所得的优化条件准确可靠，进一步验证了模型的合理性。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。例如蔗糖、谷氨酸钠及其它所用的试验材料均是从常规生化试剂厂商处购买得到的。

其中用到的短乳杆菌(lactobacillusbrevis)cgmccno.3414的菌株来源：enzymaticbioconversionforγ-aminobutyricacidbylactobacillusbrevis，cgmccno.3414restingcells[m]//advancesinappliedbiotechnology.springerberlinheidelberg，2015.