用于登革病毒疫苗的方法与组合物与流程
本申请为分案申请，原申请的申请日为2014年6月26日，申请号为201480047442.x(pct/us2014/044410)，发明名称为“用于登革病毒疫苗的方法与组合物”。
优先权声明
本申请依35u.s.c.§119(e)要求2013年6月26日提交的美国临时申请系列号61/839,687的权益，其全部内容经此引用并入本文。
政府支持声明
以由国家健康研究所(nationalinstitutesofhealth)授予的grantno.u54ai057157下的政府支持作出本发明。美国政府在本发明中享有某些权利。
本发明涉及由单一来源诱导针对超过一种登革病毒血清型的中和抗体的登革病毒疫苗。
发明背景
登革是一种蚊媒黄病毒，正在以史无前例的速度传播并已经在超过50个国家发展成为主要的健康与经济负担。针对所有四种denv血清型进行防护的现有denv疫苗必须以四种病毒或四种重组蛋白的“四价”制剂形式递送(各自旨在提供针对该血清型的防护)。还不知道在四价鸡尾酒中血清型的正确组合以实现平衡的抗体应答，近来在泰国进行的大型2b期试验中最先进的四价减毒活嵌合病毒未能提供临床上有意义的防护也凸显了这一点(sabchareona等人,2012)。病毒干扰被认为促进了失败，因为一种或更多种病毒血清型胜过其它病毒血清型。该denv-1/3和denv3/1嵌合病毒是呈现由来自denv-1与denv-3免疫个体的中和抗体识别的表位的单一病毒。这表明，单一病毒应当能够立刻引发针对两种血清型的中和抗体，用一种病毒(denv-1/3或denv-3/1)代替两种病毒(denv-1和3)。
附图概述
图1a-b.对于denv-1/3突变体，将来自denv3的edi-ii铰链移植到denv-1背景(westpac’74)中，产生denv-3/1铰链突变体。使用denv3特异性人mab5j7定义该edi-ii铰链。a)针对单克隆抗体5j7测试所得病毒rdenv-1/3。该图显示了denv-1并未被5j7中和，而denv-3被5j7中和。仅含有该denv-3edi/ii铰链的rdenv-1/3在等效于denv-3中和浓度的浓度下被5j7中和。这表明该5j7表位成功移植到denv-1中。b)该图块(panel)显示denv-3并未被mab1f4中和，denv-1被1f4中和，并且rdenv-1/3也被中和，表明1f4仍可以结合到该嵌合病毒上并中和该嵌合病毒。
图2a-b.该图显示了针对denv-1、denv-3和铰链嵌合病毒westpac-3001铰链(rdenv-1/3)测试的初次denv-1和denv-3人免疫血清。该y轴显示了中和组织培养中50％的输入病毒所需的免疫血清的稀释倍数。更高的值表示更有效的血清。a)denv-1初次免疫血清有效地中和denv-1，但是不能中和denv-3。rdenv-1/3在类似于denv-1的浓度下对被denv-1免疫血清中和敏感，表明与亲代denv-3病毒不同，该嵌合病毒显示被denv-1免疫血清识别的表位。b)denv-3初次免疫血清不中和denv-1，但是中和denv-3。rdenv-1/3在类似于denv-3的浓度下被denv-3初次免疫血清中和，表明该嵌合病毒rdenv-1/3保存了denv-3人免疫血清中的denv-3抗体所靶向(targeted)的关键denv-3表位。*表明未被中和。
图3.该图显示了westpac’743001-铰链在恒河猴中感染后第28、60、90、120和180天引发广泛交叉-中和抗体。y轴显示如上的中和抗体效价。x轴显示各种病毒血清型。各绘制点是针对给定血清型对单一恒河猴的中和效价。贯穿点的各个群簇的中心线是针对各种血清型对各组猕猴的几何平均中和效价。须状线显示了平均值的标准误差。各个时间点(28、30、60、90、120、180天)显示了针对所有四种血清型的广泛交叉-中和抗体应答。
图4a-b.对于denv-3/1突变体，将通过来自denv1(westpac’74)的单克隆抗体1f4足迹所限定的edi-ii铰链移植到denv-3背景(3001)中，产生denv-1/3铰链突变体。对三种不同的病毒(1f4s、1f4r和1f4e)进行该移植，各个变体代表更大的表位区。将来自rdenv-3的edi-ii铰链置入重组体rdenv-1病毒。该图显示了酶联免疫吸附测定(elisa)数据，按光密度(od)计的抗体的相对结合在y轴上，提高的抗体浓度在x轴上。a)mab1f4结合到3001-1f4s、r和e。针对该嵌合病毒的上升曲线显示该抗体的结合，这与不结合mab1f4的亲代3001相反。b)mab5j7结合到亲代3001、3001-1f4s、r和e。在这些病毒中保存了5j7结合，而表位供体icwestpac’74不结合5j7。
图5a-b.该图显示了针对denv-1、denv-3和铰链嵌合病毒3001-1f4e测试的初次denv-1和denv-3人免疫血清。y轴显示了中和组织培养中50％的输入病毒所需的免疫血清的稀释倍数。更高的值表示更有效的血清。a)denv-1初次免疫血清有效地中和denv-1，但是不能中和denv-3。30011f4e在类似于denv-1的浓度下对被denv-1免疫血清中和敏感，表明与亲代denv-3病毒不同，该嵌合病毒显示被denv-1免疫血清识别的表位。b)denv-3初次免疫血清不中和denv-1，但是中和denv-3。30011f4e在类似于denv-3的浓度下被denv-3初次免疫血清中和，表明该嵌合病毒30011f4e保护了denv-3人免疫血清中的denv-3抗体所靶向(targeted)的关键denv-3表位。
图6.3001-1f4e在恒河猴中的免疫原性。仅提供了一个时间点，显示广泛交叉-中和抗体，与对westpac-3001铰链所发现的一致。
技术实现要素：
本发明提供一种包含登革病毒e糖蛋白骨架的嵌合登革病毒e糖蛋白，所述登革病毒e糖蛋白骨架包含引入被可与不同于该登革病毒e糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型反应的抗体识别的表位的氨基酸置换。在一个实施方案中，该登革病毒e糖蛋白骨架来自登革病毒血清型1，并且在一个实施方案中，该登革病毒e糖蛋白骨架来自登革病毒血清型3。在一些实施方案中，该抗体可与登革病毒血清型3反应(例如单克隆抗体5j7)，并且在其它实施方案中，该抗体可与登革病毒血清型1反应(例如单克隆抗体1f4)。
本发明进一步提供了一种嵌合登革病毒e糖蛋白，包含以下氨基酸序列：
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本文中还提供的是一种嵌合登革病毒e糖蛋白，包含以下氨基酸序列：
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在本文中附加提供的是包含本发明的e糖蛋白的黄病毒颗粒或病毒样颗粒(vlp)。
在本文中还提供了编码本发明的e糖蛋白的分离核酸分子，以及编码本发明的黄病毒颗粒或vlp的分离核酸分子。
本发明还提供了在可用于制药的载体中包含本发明的e糖蛋白的组合物，并提供了在可用于制药的载体中包含本发明的核酸分子的组合物。
此外，本发明提供了在受试者(例如需要其的受试者)中产生对登革病毒的免疫应答的方法，包括向该受试者施用有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的核酸分子和/或本发明的组合物及其任意组合。
本发明还提供了在需要其的受试者中治疗登革病毒感染的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、任意本发明的核酸分子和/或本发明的组合物及其任意组合。
本文中附加提供的是在受试者(例如需要其的受试者)中预防登革病毒感染的方法，包括向该受试者施用有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、任意本发明的核酸分子和/或本发明的组合物及其任意组合。
本文中还提供了保护受试者(例如需要其的受试者)免受登革病毒感染的影响的方法，包括向该受试者施用有效量的本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、任意本发明的核酸分子和/或本发明的组合物及其任意组合。
本发明进一步提供了本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的核酸分子和/或本发明的组合物，用于制造在受试者中产生对登革病毒的免疫应答的药物，用于在需要其的受试者中治疗登革病毒感染、用于在受试者中预防登革病毒感染和/或用于防止受试者免受登革病毒感染的影响。
本文中还提供的是本发明的e糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒、本发明的核酸分子和/或本发明的组合物用于在受试者中产生对登革病毒的免疫应答，用于在需要其的受试者中治疗登革病毒感染、用于在受试者中预防登革病毒感染和/或用于防止受试者免受登革病毒感染的影响的用途。
发明详述
本发明基于以下预料不到的发现：限定denv血清型的表位区可以转移到不同denv血清型的蛋白骨架中以产生含有两种血清型的抗体靶标的嵌合分子，由此充当可以由单一来源诱导针对两种不同denv血清型的中和抗体的二价疫苗。由此，在一个实施方案中，本发明提供了构建包含引入被可与不同于该登革病毒e糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型反应的抗体识别的表位的氨基酸置换的嵌合登革病毒e糖蛋白骨架的平台。
在一些实施方案中，该登革病毒e糖蛋白骨架来自于登革病毒血清型1。在一些实施方案中，该登革病毒e糖蛋白骨架可以来自于登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革病毒血清型4。
在一些实施方案中，可与不同于该登革病毒e糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型反应的抗体是可与登革病毒血清型3反应的抗体。此类抗体的非限制性实例是单克隆抗体5j7。
在其它实施方案中，可与不同于该登革病毒e糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型反应的抗体是可与登革病毒血清型1、登革病毒血清型2或登革病毒血清型4反应的抗体。
要理解的是，可以使用用于该登革病毒e糖蛋白骨架的第一登革病毒血清型和作为识别引入到该e糖蛋白骨架中的表位的抗体的靶标的第二登革病毒血清型的任意组合，只要该第一登革病毒血清型与该第二登革病毒血清型不同(即并非相同的血清型)。
在一些实施方案中，本发明的嵌合登革病毒e糖蛋白可以包含以下氨基酸序列、基本由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
westpac74-3001铰链(rdenv-1/3)
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在一些实施方案中，本发明的嵌合登革病毒e糖蛋白可以包含以下氨基酸序列、基本由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
3001-1f4e(rdenv-3/1)
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本发明还提供了包含本发明的嵌合e糖蛋白的黄病毒颗粒或病毒样颗粒(vlp)。
可以通过将表1中确定的一些(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等等)或所有氨基酸置换引入登革病毒e糖蛋白骨架或黄病毒e糖蛋白骨架中来制造本发明的嵌合体。无需置换表1中确定的每一个氨基酸来制造本发明的嵌合蛋白。例如，在一些实施方案中，在表1中确定为各自表位区的邻接氨基酸序列的任一末端处的大约1、2、3、4或5个氨基酸的进一步置换和/或置换的省略可以包括在本发明的嵌合体的制造中。制造所需构象性表位所需要的置换数可以容易地由本领域技术人员按照本文中的教导和按照本领域中公知的规程来确定。表1中的氨基酸位置编号基于westpac74(denv-1)的氨基酸序列，或unc3001(denv-3)的氨基酸序列，如本文中提供的那样。但是，本领域普通技术人员容易理解的是，在其它登革病毒e糖蛋白氨基酸序列或其它黄病毒e糖蛋白氨基酸序列中的等效氨基酸位置可以容易地确定并在本发明的嵌合蛋白的制造中使用。
表2显示了可以对编码该denv-1e糖蛋白以引入被该单克隆抗体5j7识别的表位的核苷酸序列进行的修饰的一个实例，所述表位可与denv-3反应。来自翻译包含这些置换的核苷酸序列的氨基酸序列是：
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要理解的是，表2中提供的修饰提供了如何获得上述氨基酸序列的一个实例，并且由于该氨基酸密码子的简并性，可以对编码该denv-3e糖蛋白的核苷酸序列进行大量其它修饰以获得该氨基酸序列。
表3显示了在用500,000感染单位的病毒皮下感染的恒河猴中，westpac’743001-铰链是传染性的。每天的报道的值是对数变换的通过immunofocus检测来量化的猴血清病毒效价。
表4.恒河猴中3001-1f4e的弱化。该表显示了在用500,000感染单位的病毒皮下感染的恒河猴中，3001-1f4e是传染性的。但是，该病毒低于检测定量水平(50个传染性病毒/毫升血清)。更灵敏的检测，延迟焦点检测，能够检测<50感染单位/毫升的病毒，但是不能量化目前的低病毒水平。因此，通过我们最灵敏的检测测定病毒的天数记录为正值“+”。感染的总天数显示在左栏中。低水平的病毒血症和低平均感染天数(2.25天)与猕猴中的病毒弱化一致。
表5.为了进一步表征该嵌合病毒denv1/3，用denv-1特异性单克隆抗体1f4对其进行探测。1f4是血清型特异性的，并且其靶标表位在该edi-ii铰链中。如果移植的denv-3edi-ii铰链破坏该1f4表位，1f4应当不再中和该嵌合westpac74/3001病毒。
在一些实施方案中，本发明提供了一种嵌合黄病毒e糖蛋白，其中进行氨基酸置换以便向来自于并非登革病毒的黄病毒的黄病毒e糖蛋白中引入登革病毒表位。由此，在一些实施方案中，本发明提供了一种包含嵌合e糖蛋白的黄病毒e糖蛋白，所述嵌合e糖蛋白包含并非登革病毒e糖蛋白骨架的黄病毒e糖蛋白骨架，其中该黄病毒e糖蛋白骨架包含引入被可与登革病毒反应的抗体识别的表位的氨基酸置换物。
可以使用的黄病毒的非限制性实例包括黄热病病毒(yfv)(例如
本领域中已知的是，制造登革病毒疫苗的许多努力导致了了非中和抗体的生产，其可以提高序列暴露于自然感染或疫苗时病理学的可能性。提供工程化表位的另一种途径是递送全部或一部分并入另一种黄病毒颗粒或vlp的登革病毒e蛋白。在代表性实施方案中，该异源黄病毒是西尼罗病毒或黄热病病毒。该e蛋白的部分可以接枝到该异源黄病毒骨架的e蛋白中，例如以减少生成对存在于该登革病毒e蛋白和/或其它登革病毒结构蛋白中的非中和表位的非中和登革病毒抗体。
由此，嵌合黄病毒或嵌合黄病毒vlp可以以适当的构象呈现四元登革病毒表位，同时减少生成对该登革病毒e蛋白的其它部分和/或未呈现在该嵌合黄病毒或黄病毒vlp中的其它结构蛋白的非中和抗体。
在本发明的一些实施方案中，该黄病毒e糖蛋白或登革病毒e糖蛋白的个别和构象性的表位可以呈现在合成骨架或支撑结构上，以使得该合成骨架或支撑结构中的表位模拟该e糖蛋白、病毒粒子或vlp的结构中该表位的构象和布置。
在本发明再进一步的实施方案中，本发明提供了模拟本发明的e糖蛋白的个别和构象性表位的肽模拟表位(参见meloen等人(2000)j.mol.recognit.13,352–359)。可以使用本领域已知的任何技术来识别模拟表位，例如通过表面刺激、随机肽库或噬菌体展示库，使用对本发明的e糖蛋白的个别和构象性表位的抗体。
本发明进一步提供了编码本发明的登革病毒表位或多肽的核酸(例如分离核酸)。
本发明进一步提供了编码本发明的嵌合黄病毒vlp或嵌合黄病毒颗粒(例如该黄病毒颗粒的病毒外壳)的核酸(例如分离核酸)。
还提供的是编码本发明的核酸的载体(vectors)。
还提供的是包含本发明的载体、核酸、登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒vlp或嵌合黄病毒颗粒的细胞。
本发明还提供了包含本发明的细胞、载体、核酸、登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒vlp或嵌合黄病毒颗粒的免疫原组合物。在实施方案中，该免疫原组合物是一价的。在实施方案中，该免疫原组合物对登革病毒血清型den1、den2、den3和/或den4是多价的(例如四价)。
本发明包括在受试者中产生对登革病毒的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒vlp或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或免疫原组合物。
此外，本发明可以有利地实施，以诱导针对den1、den2、den3和den4的一种、两种、三种或全部四种的免疫应答。本领域中公知的是，由于血清型之间的干扰问题，设计有效和安全的多价登革疫苗是一种挑战。例如，该免疫应答可以主要针对仅仅部分目标血清型。那么将需要尝试多次免疫接种以实现针对所有血清型的应答；但是，在登革病毒的情况下，由于对具有预先存在的抗体的受试者重复给药可能导致登革出血热，这种途径可能是危险的。
本发明的再一方面是治疗登革病毒感染的方法，包括向该受试者施用有效量的本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒vlp或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或免疫原组合物。
本发明的再一方面是预防登革病毒感染的方法，包括向该受试者施用有效量的本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒vlp或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或免疫原组合物。
本发明的再一方面是保护受试者免受登革病毒感染的影响的方法，包括向该受试者施用有效量的本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒vlp或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或免疫原组合物。
存在四种登革病毒血清型(denv-1、denv-2、denv-3和denv-4)。在各种血清型中，存在大量不同的菌株或基因型。本发明的登革病毒抗原和表位可以衍生自任何登革病毒，包括目前已知或日后确定的所有血清型、菌株和基因型。
在本发明的实施方案中，该登革病毒是unc1017菌株(den1)、westpacific74菌株(den1)、s16803菌株(den2)、unc2005菌株(den2)、unc3001菌株(den3)、unc3043(来自philippines,1984的den3菌株059.ap-2)、unc3009菌株(den3，d2863，srilanka1989)、unc3066(den3，来自puertorico1977的菌株1342)、ch53489菌株(den3)、unc4019菌株(den4)或tvp-360(den4)。
在本发明的实施方案中，登革病毒多肽(例如e蛋白)的“免疫原活性片段”包含、基本由或由至少大约6、8、10、12、15、20、30、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450或更多个氨基酸，任选连续氨基酸和/或小于大约495、475、450、425、400、350、300、250、200、150、100、75或50个氨基酸，任选连续氨基酸组成，包括前述的任意组合，只要下限小于上限，并且该“免疫原活性片段”诱导针对宿主中的登革病毒的免疫应答(例如与自然抗原反应的igg和/或iga)，任选保护性免疫应答，并诱导产生特异性结合到由本发明人最新确定的四元登革病毒表位上的抗体。
本文中所用的术语“表位”是指当以适当构型存在时提供对抗体(例如b细胞表位)或t细胞受体(例如t细胞表位)的反应性位点的特定氨基酸序列。
包括b细胞表位的给定多肽的部分可以使用任意数量的本领域已知的表位作图技术来确定(参见例如epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology,第66卷,glenne.morris,ed.,1996,humanapress,totowa,n.j.)。例如，线性表位可以通过以下方法测定：在固体载体上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白分子的部分，并令肽与抗体反应，同时肽仍连接到该载体上。此类技术在本领域是已知的，并描述在例如美国专利号4,708,871；geysen等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa81:3998-4002；geysen等人(1986)molec.immunol.23:709-715中。
类似地，构象性表位可以通过测定氨基酸的空间构象来容易地识别，例如通过x射线晶体照相术和2维核磁共振。蛋白的抗原区还可以使用标准抗原性和亲水性绘图来识别，如使用例如可获自oxfordmoleculargroup的omiga1.0版软件程序计算的那些。该计算机程序采用hopp/woods法(hopp等人,proc.natl.acad.sciusa(1981)78:3824-3828)来确定抗原性状况，并采用kyte-doolittle技术(kyte等人,j.mol.biol.(1982)157:105-132)用于亲水性绘图。
通常，涉及刺激受试者的免疫系统的细胞性杀伤武器(cellulararm)的t细胞表位是大约8-25个氨基酸的短肽。识别t细胞表位的一种常见方法是使用重叠合成肽并使用例如酶联免疫斑点检测(elispot)分析这些肽的池或单个的肽，所述肽被对相关抗原免疫的来自动物的t细胞识别。这些重叠肽还可以在其它检测中使用，如刺激细胞因子释放或分泌，或通过构建含有该肽的主要组织相容性(mhc)四聚体来评估。还可以基于它们响应通过来自相关抗原的不同片段的刺激以刺激淋巴细胞增殖的增殖来识别此类免疫原活性片段。
可以出于预防、治疗和/或诊断的目的来实施本发明。此外，可以实施本发明以制造用于任何目的如诊断或研究目的的抗体，或通过转移至另一受试者用于被动免疫的抗体。
本发明进一步提供包含一种或更多种本发明的组合物的试剂盒。本领域普通技术人员充分理解的是，本发明的试剂盒可以包含一个或多个容器和/或接受器以容纳该试剂盒的试剂(例如抗体、抗原、核酸)，以及适当的缓冲液和/或稀释剂和/或其它溶液和使用该试剂盒的指南，如本领域公知的那样。此类试剂盒可以进一步包含佐剂和/或其它免疫刺激或免疫调节药剂，如本领域公知的那样。
本发明的组合物和试剂盒还可以包括其它药剂、药物、载体、稀释剂、免疫刺激性细胞因子等等。制备此类剂型的实际方法是本领域技术人员已知的，或对本领域技术人员显而易见。
施用于受试者可以通过本领域已知的任何途径。作为非限制性实例，给药途径可以通过吸入(经口和/或经鼻吸入)、口服、口腔含化(例如舌下)、直肠、阴道、局部(包括给药于呼吸道)、眼内、经皮、通过胃肠外(例如肌肉内[例如给药于骨骼肌]、静脉内、动脉内、腹膜内等等)、皮下(包括施用到足垫中)、真皮内、胸膜内、大脑内和/或鞘内途径。
本发明的表位、多肽、vlp和病毒载体本身可以递送，或可以通过递送编码其的核酸(例如dna)来递送。
可以同时向受试者施用免疫调节化合物，如免疫调节趋化因子和细胞因子(优选地，ctl诱导性细胞因子)。
细胞因子可以通过本领域已知的任何方法施用。外源性细胞因子可以施用于该受试者，或者，可以使用合适的载体向受试者递送编码细胞因子的核酸，并在体内产生细胞因子。在特定实施方案中，病毒佐剂表达该细胞因子。
在本发明的实施方案中，可以在没有可检测病原性(例如登革热休克综合征/登革出血热)的情况下施用多剂量(例如二、三或更多)的本发明的组合物。
在本发明的实施方案中，本发明的多价疫苗不导致免疫干扰，例如，针对存在的所有抗原诱导平衡的免疫应答。在本发明的实施方案中，平衡的应答导致针对denv-1、denv-2、denv-3和denv-4的保护性免疫。
在本发明的实施方案中，该多价疫苗可以施用于存在抗登革母体抗体的受试者。
应当理解的是，本发明可以以不同形式实施，并且不应被解释为限于本文中阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案，以使得该公开内容更彻底和完整，并将向本领域技术人员充分传达本发明的范围。
除非另行定义，本文中使用的所有技术和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本发明的说明书中采用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且并非旨在限制本发明。
本文中所用的“一个”、“一种”或“该”可以指一个或多于一个。例如“一个”细胞可以是指单个细胞或多个细胞。
同样如本文中所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关的所列项目的任意和所有可能组合，以及当以选择方式(“或”)解释时是指缺乏组合。
本文中所用的术语“大约”，当指的是可测量值如剂量的量(例如脂肪酸的量)等等时，指的是涵盖指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
本文中所用的过渡性短语“基本由……组成”指的是权利要求的范围应当被解释为包括该权利要求中描述的规定材料与步骤，以及不会实质上影响所要求保护的发明的基础和新颖特征的那些材料与步骤。参见inreherz,537f.2d549,551-52,190u.s.p.q.461,463(ccpa1976)(在原文中强调)；还参见mpep§2111.03。由此，术语“基本由……组成”当在本发明的权利要求中使用时并非意在被解释为等同于“包含”。
本文中所用的术语“核酸”涵盖了rna和dna，包括cdna,基因组dna、合成(例如化学合成的)dna和rna与dna的嵌合体。该核酸可以是双链或单链的。该核酸可以使用核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)来合成。此类核苷酸例如可用于制备具有改变的碱基配对能力或提高的对核酸酶的耐受性的核酸。
本文中所用的术语“多肽”涵盖肽和蛋白(包括融合蛋白)，除非另行说明。
“融合蛋白”是当编码在自然界中未发现融合在一起的两种(或更多)不同多肽的异源核苷酸序列或其片段在正确的翻译阅读框中融合在一起时产生的多肽。
“重组体”核酸、多核苷酸或核苷酸序列是通过基因工程技术制造的核酸、多核苷酸或核苷酸序列。
“重组体”多肽由重组体核酸、多肽或核苷酸序列制造。
本文中所用的“分离”多核苷酸(例如“分离核酸”或“分离核苷酸序列”)是指与自然存在的生物体或病毒的至少一部分其它组分，例如细胞或病毒的结构组分或通常伴随该多核苷酸发现的其它多肽或核酸至少部分地分离的多核苷酸。任选但非必要地，该“分离”多核苷酸以与原材料相比更大的浓度存在(即，是富集的)(例如至少大约两倍、三倍、四倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍、五百倍、一千倍、一万倍或更大的浓度)。在代表性实施方案中，该分离多核苷酸纯度为至少大约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。
“分离”多肽是指与自然存在的生物体或病毒的至少一部分其它组分，例如细胞或病毒的结构组分或通常伴随该多肽发现的其它多肽或核酸至少部分地分离的多肽。任选但非必要地，该“分离”多肽以与原材料相比更大的浓度存在(即，是富集的)(例如至少大约两倍、三倍、四倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍、五百倍、一千倍、一万倍或更大的浓度)。在代表性实施方案中，该分离多肽纯度为至少大约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。
此外，“分离”细胞是已经与其它在自然界中通常相关的组分部分或完全分离的细胞。例如，分离细胞可以是在培养基中的细胞和/或在可药用载体中的细胞。
术语“免疫原”和“抗原”在本文中可互换使用，并且是指细胞和/或体液免疫应答可以指向的任何化合物(包括多肽)。在特定实施方案中，免疫原或抗原可以引发针对登革病毒感染的影响的保护性免疫应答。
本文中所用的“有效量”是指足以产生所期望的效果的本发明的载体、核酸、表位、多肽、细胞、颗粒、vlp、组合物或制剂的量，所述效果可以是治疗和/或有益效果。该有效量将随着年龄、受试者的一般状况、所治疗的病症的严重程度、施用的特殊药剂、治疗的持续时间、任何同时治疗的性质、所用的可药用载体以及本领域技术人员的知识与专业技术中的类似因素而不同。如果适当的话，在任何个别情况下的“有效量”可以由本领域普通技术人员参考相关文本和文献和/或通过采用常规实验来确定。
本文中所用的术语“致免疫量”或“有效免疫剂量”，除非另行说明，是指足以在治疗的受试者体内引发大于未免疫受试者固有免疫的免疫应答(其任选可以是保护性应答)的量或剂量。在任何特定背景下的致免疫量或有效免疫剂量可以使用本领域已知的方法常规地确定。
术语“疫苗”、“接种”和“免疫”在本领域中是被充分理解的，并在本文中可互换使用。例如，术语疫苗、接种或免疫可以理解为是提高受试者对免疫原的免疫反应(例如通过提供主动免疫应答)，并因此提高其抵抗、克服感染和/或从感染中恢复的能力(即保护性免疫应答)的过程或组合物。
术语“治疗(treat、treating或treatment)”(及其语法变体)是指减轻、至少部分改进或改善受试者病症的严重程度和/或实现至少一种临床症状的一定减轻、缓和或减少和/或延迟疾病或病症的进展。在代表性实施方案中，术语“治疗(treat、treating或treatment)”(及其语法变体)是指在有或没有临床疾病的其它标志的情况下减轻病毒血症的严重程度和/或延缓病毒血症的进展。
本文中所用的“治疗有效”量是足以治疗(如本文中所定义)受试者的量。本领域技术人员将认识到，该治疗效果不必是完全的或治愈的，只要向受试者提供一些益处。
术语“预防(prevent、preventing或prevention)”(及其语法变体)是指预防和/或延缓受试者的疾病、病症和/或临床症状的发作和/或进展和/或相对于在不存在本发明的方法的情况下所发生的情况降低该疾病、病症和/或临床症状的发作和/或进展的严重程度。在代表性实施方案中，术语“预防(prevent、preventing或prevention)”(及其语法变体)是指在有或没有临床疾病的其它标志的情况下预防和/或延缓受试者的病毒血症的发作和/或进展。该预防可以是完全的，例如完全不存在疾病、病症和/或临床症状。该预防也可以是部分的，使得受试者的疾病、病症和/或临床症状的发生和/或发作和/或进展的严重程度小于在不存在本发明的情况下所发生的程度。
本文中所用的“预防有效”量是足以预防(如本文中所定义)受试者的疾病、病症和/或临床症状的量。本领域技术人员将认识到，预防水平不必是完全的，只要向受试者提供一些益处。
如本领域技术人员公知的那样，可以通过检测临床改善来确定通过本发明的方法治疗和/或预防登革病毒感染的效力，所述临床改善通过受试者的症状和/或临床参数(例如病毒血症)的改变来指示。
除非另行说明，术语“保护(protect、protecting或protection)”和“保护性”(及其语法变体)涵盖了预防和治疗受试者的登革病毒感染的方法，无论针对登革病毒的一种或更多种菌株、基因型或血清型。
本文中所用的术语“保护性”免疫应答或“保护性”免疫表示该免疫应答向受试者提供了某些益处，在于其防止或减少了疾病或感染的任何其它表现形式的发病率和/或严重程度和/或持续时间。例如，在代表性实施方案中，保护性免疫应答或保护性免疫导致减轻的病毒血症，无论是否伴随着临床疾病。或者，保护性免疫应答或保护性免疫可用于现有疾病的治疗性处理。
“主动免疫应答”或“主动免疫”的特征在于“遭遇免疫原后参与宿主组织和细胞。其涉及在淋巴网状组织中的免疫活性细胞的分化和增殖，这导致抗体的合成和/或细胞介导反应性的发展”。herbertb.herscowitz,immunophysiology:cellfunctionandcellularinteractionsinantibodyformation,inimmunology:basicprocesses117(josepha.bellantied.,1985)。或者说，主动免疫应答在通过感染或通过接种暴露于免疫原后由宿主来配置。主动免疫可以与被动免疫形成对比，所述被动免疫通过“将预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白介素-2)由主动免疫宿主转移至非免疫宿主”(同上)来获得。
本发明的“受试者”包括易受登革病毒感染的任何动物。此类受试者通常是哺乳动物受试者(例如实验用动物如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、灵长类等等)、农场或经济类动物(例如牛、马、山羊、驴、绵羊等等)或家养动物(例如猫、狗、雪貂等等)。在特定实施方案中，该受试者是灵长类受试者、非人类的灵长类受试者(例如黑猩猩、狒狒、猴子、大猩猩等等)或人类。本发明的受试者可以是已知或据信处于被登革病毒感染的风险之中的受试者。或者，本发明的受试者还可以包括先前未知或怀疑被登革病毒感染或需要治疗登革病毒感染的受试者。
可以为了任何目的治疗受试者，例如为了激发保护性免疫应答或为了在该受试者体内激发抗体的产生，该抗体可以收集并用于其它目的如研究或诊断目的，或用于向其它受试者施用以便在其中产生被动免疫等等。
受试者包括任何年龄的男性和/或女性，包括新生儿、少年、成人和老年受试者。就人类受试者而言，在代表性实施方案中，该受试者可以是婴儿(例如小于大约12个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月或更年轻)、幼儿(例如至少大约12、18或24个月和/或小于大约36、30或24个月)或儿童(例如至少大约1、2、3、4或5岁和/或小于大约14、12、10、8、7、6、5或4岁)。在本发明的实施方案中，该受试者是大约0至3、4、5、6、9、12、15、18、24、30、36、48或60个月年龄、大约3至6、9、12、15、18、24、30、36、48或60个月年龄、大约6至9、12、15、18、24、30、36、48或60个月年龄、大约9至12、15、18、24、30、36、48或60个月年龄、大约12至18、24、36、48或60个月年龄、大约18至24、30、36、48或60个月年龄、或大约24至30、36、48或60个月年龄的人类受试者。
在本发明的实施方案中，该受试者具有对登革病毒的母体抗体。
本发明的方法的“有需要的受试者”可以是已知被登革病毒感染、或怀疑被登革病毒感染、或处于被登革病毒感染的风险之中的受试者。
还提供了包含本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒vlp或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或组合物和可药用载体的药物制剂(例如免疫原性制剂)，并且可以配制用于按照已知技术在药用载体中施用。参见例如remington,thescienceandpracticeofpharmacy(最新版)。在本发明的实施方案的药物组合物的制造中，本发明的组合物通常尤其与可药用载体混合。“可药用载体”指的是与药物组合物中的其它成分相容并且对受试者无害或无毒的载体。该载体可以是固体和/或液体，并优选作为单位剂量制剂(例如片剂)形式与本发明的组合物一起配制，其可以含有大约0.01或0.5重量％至大约95重量％或99重量％的该组合物。该药物组合物通过任何公知的药剂学技术制备，包括但不限于混合该组份，任选包括一种或更多种辅助成分。在某些实施方案中，该可药用载体是无菌的，并根据包含该载体的药物组合物的管理指南被认为适于施用于人类受试者。
此外，本发明的组合物的“可药用”组分如盐、载体、赋形剂或稀释剂是以下组分(i)与该组合物的其它成分相容，在于其可以与本发明的组合物结合而不会令该组合物不适用于其预期目的，和(ii)适用于本文中提供的受试者而不具有不适当的不良副作用(如毒性、刺激性和过敏反应)。当它们的风险超过该组合物提供的益处时，该副作用是“不适当的”。可药用组分的非限制性实例包括任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲的盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、微乳液和各种类型的润湿剂。
在一些实施方案中，本发明的组合物可以进一步包含一种或超过一种佐剂。本发明的佐剂可以为氨基酸序列形式和/或为编码佐剂的核酸的形式。当为核酸形式时，该佐剂可以是编码该多肽或片段或表位的核酸的组分和/或包含编码本发明多肽或片段或表位的核酸的组合物的单独组分。根据本发明，该佐剂还可以是作为充当佐剂的肽、蛋白片段或全蛋白的氨基酸序列，和/或该佐剂可以是编码充当佐剂的肽、蛋白片段或全蛋白的核酸。本文中所用的“佐剂”描述了一种物质，其可以是能够与本发明的组合物结合以增强、改进或以其它方式调节受试者的免疫应答的任何免疫调节性物质。
在进一步的实施方案中，该佐剂可以是但不限于免疫刺激性细胞因子(包括但不限于gm/csf、白介素-2、白介素-12、γ干扰素、白介素-4、肿瘤坏死因子-α、白介素-1、造血生长因子flt3l、cd40l、b7.1共刺激分子和b7.2共刺激分子)、由在磷酸盐缓冲的盐水中的5％(重量/体积)角鲨烯(dasf,parsippany,n.j.)、2.5％的pluronic,l121聚合物(aldrichchemical,milwaukee)和0.2％的聚山梨醇酯(tween80,sigma)组成的syntex佐剂制剂1(saf-1)。合适的佐剂还包括铝盐，如氢氧化铝凝胶(alum)、磷酸铝或algannmulin，但是还可以是钙、铁或锌的盐，或者可以是酰化酪氨酸、或酰化糖、阳离子或阴离子衍生的多糖、或聚磷腈的不溶性悬浮液。
其它佐剂是本领域公知的，并包括而不限于mf59、lt-k63、lt-r72(pal等人,vaccine24(6):766-75(2005))、qs-21、弗氏佐剂(完全和不完全)、氢氧化铝、n-乙酰基-胞壁酰基-l-苏氨酰基-d-异谷氨酰胺(thr-mdp)、n-乙酰基-正胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺(cgp11637，称为正mdp)、n-乙酰基胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰基-l-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(cgp19835a，称为mtp-pe)和ribi，其含有在2％角鲨烯/tween80乳液中的从细菌中提取的三种组分——单磷酰脂质a、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(mpl+tdm+cws)。
附加佐剂可以包括例如单磷酰脂质a(优选3-脱-o-酰化单磷酰基脂质a(3d-mpl))与铝盐的组合。增强的佐剂体系包括单磷酰脂质a和皂角苷衍生物的组合，特别是如pct公开号wo94/00153中公开的qs21与3d-mpl的组合，或反应原性较低的组合物，其中如pct公开号wo96/33739中所公开的那样，该qs21被胆固醇猝灭。在pct公开号wo95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，涉及在水包油乳液中的qs213d-mpl&生育酚。此外，本发明的核酸组合物可以通过包含编码该抗原的核苷酸序列和提供佐剂功能的核苷酸序列(如cpg序列)来包括佐剂。此类cpg序列或基序是本领域公知的。
用于本发明的佐剂，如免疫刺激性细胞因子，可以在向受试者施用本发明的组合物之前、同时和/或在向受试者施用本发明的组合物之前和/或之后几小时、数小时和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10天之内施用。
此外，佐剂，如免疫刺激性细胞因子的任意组合，可以在施用本发明的免疫原组合物之前、之后和/或同时共同施用于该受试者。例如，免疫刺激性细胞因子的组合，可以由两种或更多种免疫刺激性细胞因子组成，如gm/csf、白介素-2、白介素-12、γ干扰素、白介素-4、肿瘤坏死因子-α、白介素-1、造血生长因子flt3l、cd40l、b7.1共刺激分子和b7.2共刺激分子。可以通过使用标准程序(如本文中所述和本领域已知的)测量在使用和不使用佐剂或佐剂组合的情况下响应向受试者施用本发明的组合物所产生的免疫应答来测定佐剂或佐剂组合的有效性。
在本发明的实施方案中，该佐剂包含如u.s.7,862,829中所描述的甲病毒属佐剂。
可以在数天、数周、数月或数年期间进一步施用加强剂量。在慢性感染中，初始高剂量和随后的加强剂量可能是有利的。
本发明的药物制剂可以任选包含其它药剂、药物、稳定剂、缓冲剂、载体、稀释剂、盐、张力调节剂、润湿剂等等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等等。
为了注射，该载体通常将是液体。对于其它施用方法，该载体可以是固体或液体。对于吸入给药，该载体将是可吸入的，并通常为固体或液体微粒形式。
本发明的组合物可以按照已知技术配制用于在药物载体中施用。参见例如remington,thescienceandpracticeofpharmacy(第9版,1995)。在本发明的药物组合物的制造中，该vlp通常尤其与可接受的载体混合。该载体可以是固体和/或液体，并任选与该化合物配制为单位剂量制剂，例如片剂。可以使用多种可药用的水性载体，例如水、缓冲的水、0.9％的盐水、0.3％的甘氨酸、透明质酸、无热原水、无热原的磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水或cremophorel[r](basf，parsippany，n.j.)等等。这些组合物可以通过常规技术灭菌。本发明的制剂可以通过任何药剂学的公知技术来制备。
该药物制剂可以原样包装使用，或者是冻干，该冻干制剂通常在施用前与灭菌水溶液混合。该组合物可以进一步包装在单位剂量或多剂量容器中，例如，包装在密封的安瓿和小瓶中。
该药物制剂可以按照药剂学的常规技术通过本领域中已知的任何方法配制用于给药。例如，该组合物可以配制为鼻内、通过吸入(例如经口吸入)、口服、口腔含化(例如舌下)、直肠、阴道、局部、鞘内、眼内、经皮、通过胃肠外给药(例如肌肉内[例如骨骼肌]、静脉内、皮下、真皮内、胸膜内、大脑内和动脉内、鞘内)或局部(例如向皮肤和粘膜表面，包括气道表面)给药。
对于鼻内或吸入给药，该药物制剂可以配制为气雾剂(该术语包括液体和干粉气雾剂)。例如，该药物制剂可以以细分散形式与表面活性剂和喷射剂一起提供。该组合物的典型百分比为0.01-20重量％，优选1-10重量％。该表面活性剂通常是无毒的，并可溶于该喷射剂。此类药剂的代表是含有6至22个碳原子的脂肪酸如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric和油酸与脂族多元醇的酯或偏酯，或其环状酸酐。混合酯，如混合的或天然的甘油酯也可以使用。该表面活性剂可以占该组合物的0.1-20重量％，优选0.25-5重量％。该组合物的余量通常是喷射剂。如果需要的话，也可以包括载体，其与卵磷脂一起用于鼻内递送。液体粒子的气雾剂可以通过任何合适的装置来制造，如使用压力驱动的气雾剂喷雾器或超声喷雾器，如本领域技术人员已知的那样。参见例如美国专利号4,501,729。固体粒子的气雾剂同样可以用任何固体微粒药物气雾剂发生器通过药物领域已知的技术来制造。鼻内给药还可以通过液滴给药至鼻面。
可注射制剂可以以常规形式制备为液体溶液或混悬剂、适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式、或制备为乳液。或者，可以以局部而非全身方式施用该药物制剂，例如以贮存或缓释制剂的方式。
临时注射溶液和混悬剂可以由先前描述的种类的灭菌粉末、颗粒和片剂来制备。例如，可以提供在密封容器中的单位剂型的本发明的可注射的、稳定的灭菌制剂。该制剂可以以冻干产物的形式提供，其可以用合适的可药用载体重构以形成适于注射到受试者体内的液体组合物。该单位剂型可以为大约1微克至大约10克该制剂。当该制剂基本不溶于水时，可以以足以在水性载体中乳化该制剂的量包含足够量的乳化剂，该乳化剂是可药用的。一种此类可用的乳化剂是磷脂酰胆碱。
适于口服的药物制剂可以以独立的单位，如胶囊剂、扁囊剂、锭剂或片剂的形式呈现，以粉末或颗粒的形式；以在水性或非水性液体中的溶液或混悬剂形式；或以水包油或油包水乳液形式。口服递送可以通过将本发明的化合物复合至能够承受动物消化道中的消化酶所造成的降解的载体上来进行。如本领域已知的那样，此类载体的实例包括塑料胶囊或片剂。此类制剂通过任何合适的药剂学方法来制备，其包括令该蛋白与合适的载体(其可以含有一种或更多种如上所述的辅助成分)缔合的步骤。通常，通过将该化合物均匀和紧密地与液体和/或细碎的固体载体混合，并随后在需要的情况下将所得混合物成型来制备该药物制剂。例如，可以通过压实或模塑粉末或颗粒以及任选一种或更多种辅助成分来制备片剂。压制片剂通过在合适的机器中压制任选与粘结剂、润滑剂、惰性吸湿剂和/或表面活性/分散剂混合的自由流动形式的该制剂(如粉末或颗粒)来制备。模塑片剂通过在合适的机器中模塑用惰性液体粘结剂润湿的粉末状蛋白质来制备。
适于口腔含化(舌下)给药的药物制剂包括包含在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)中的所述化合物的锭剂；以及在惰性基质(如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶)中的软锭剂。
适于肠胃外给药的药物制剂可以包含灭菌的水性和非水性注射溶液，该制剂优选与预定接受者的血液等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，这使得该组合物与预定接受者的血液等渗。水性和非水性的灭菌混悬剂、溶液和乳液可以包含悬浮剂和增稠剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液、或非挥发油。静脉内载体包括液体和营养物补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那些)等等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。
适于直肠给药的药物制剂任选呈现为单位剂量的栓剂。这些可以通过将该活性剂与一种或多种常规固体载体(如可可脂)混合并随后成型所得混合物来制备。
适于局部施用于皮肤的药物制剂优选采取软膏剂、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油的形式。可以使用的载体包括但不限于凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇类、透皮促进剂以及其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，例如，可以通过将本发明的药物制剂与能够进入皮肤的亲脂性试剂(例如dmso)混合来实施局部递送。
适于透皮给药的药物制剂可以是单个贴剂的形式，所述贴剂适于长时间保持与受试者表皮的紧密接触。适于透皮给药的制剂还可以通过离子电渗疗法(参见例如pharmaceuticalresearch3:318(1986))来递送并通常采取该化合物的缓冲水溶液的形式。合适的制剂可以包含柠檬酸盐或bis/tris缓冲剂(ph6)或乙醇/水，并可以含有0.1至0.2m的活性成分。
在本发明的实施方案中，本发明的病毒颗粒的剂量可以为大约104至大约107空斑形成单位(pfus)。在本发明的实施方案中，本发明的vlp的剂量可以为大约500微克至大约5毫克。在本发明的实施方案中，本发明的蛋白的剂量可以为大约100至大约104微克+/-佐剂。
此外，该组合物可以配制为脂质体制剂。所用的脂质层可以具有任何常规组成，并可以含有胆固醇或可以不含胆固醇。所制造的脂质体可以例如通过使用标准超声处理和均化技术来减小尺寸。
该脂质体制剂可以冻干以制造冻干产物，其可以用可药用载体如水重构以重新生成脂质体混悬剂。
本发明的免疫原性制剂可以任选是无菌的，并可以进一步在封闭的病原体不透性容器中提供。
实施例
合成生物学提供了超越病毒基因组的基因组结构、表达和构造的前所未有的遗传控制。由称为denv血清型1-4的四种紧密相关的病毒(其具有类似的抗原性)组成的登革病毒(denv)复合物还在人群中引发了交叉反应性中和和增强的抗体响应的复杂状况。为了研究denv血清型之间的抗原关系，我们描述了稳定denv1-4分子克隆的板和基于临床低传代分离株的重组体病毒的构建与表征。重组体病毒像野生型病毒那样复制并编码适当的标记突变。为了评估denv3中自然变异的作用，基于四种在基因方面和在地理上不同的denv-3基因型，通过用e基因取代母体包膜(e)糖蛋白基因来制造四种合成设计的同基因构造。重组体病毒是有活力的，评估在昆虫和哺乳动物宿主上的生长，单克隆和多克隆中和试验证实，在den3中和反应中的自然微变异影响了交叉中和敏感性状况。为了评估使用重组体dna技术来定位限定的表位，我们使用逃逸变异和表位定位来定位几个表位的坐标。随后，我们在菌株之间交换这些表位。重组体病毒是有活力的，采用单克隆和多克隆血清的功能测定的增益与损失显示了抗原模式，该抗原模式透露了疫苗设计中的重要考虑因素。
该抗登革病毒(denv)人源单克隆抗体(mab)5j7通过结合到denv-3包膜(e)糖蛋白上的表位有效地中和denv血清型3(denv-3)。该表位跨越被称为e结构域i-ii(edi-ii)铰链的e区域。使用denv感染克隆平台，将该denv-35j7表位移植到denv血清型1(denv-1)e糖蛋白中。该移植使得该重组体denv-1/3病毒对于被mab5j7中和敏感。显然，该移植没有破坏天然denv-1抗原结构，并且该重组体病毒对denv-1和denv-3人源多克隆血清均敏感。这种敏感性表明，该denv-1/3嵌合e糖蛋白可以充当二价疫苗，该二价疫苗能够诱导针对两种病毒血清型——denv-1和denv-3的中和抗体。
前述内容说明本发明，并且不解释为限制本发明。本发明由下列权利要求限定，权利要求的等同方案包含在其中。
为了与其中呈现参考的句子和/或段落相关的教导，本文中引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献经此引用全文并入本文。
序列
unc3001(denv-3)氨基酸序列
mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielqkteatqlatlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkytviitvhtgdqhqvgnetqgvtaiit--pqastteailpeygtlglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqnsggtsifaghlkcrlkmdklelkgmsyamctntfvlkkevsetqhgtilikveykgedapckipfstedgqgkahngrlitanpvvtkkeepvnieaeppfgesnivigigdnalkinwykkg
westpac74(denv-1)氨基酸序列
mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehgscvttmakdkptldiellktevtnpavlrklcieakisntttdsrcptqgeatlveeqdtnfvcrrtfvdrgwgngcglfgkgslitcakfkcvtklegkivqyenlkysvivtvhtgdqhqvgnettehgttatitpqaptseiqltdygaltldcsprtgldfnemvlltmekkswlvhkqwfldlplpwtsgastsqetwnrqdllvtfktahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttifaghlkcrlkmdkltlkgmsyvmctgsfklekevaetqhgtvlvqvkyegtdapckipfssqdekgvtqngrlitanpivtdkekpvnieaeppfgesyivvgagekalklswfkkg
westpac74铰链(denv1/3)氨基酸序列
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3001-1f4e(denv3/1)氨基酸序列
mrcvgignrdfveglsgatwvdvvlehggcvttmaknkptldielfktevtnpavlrklciegkitnittdsrcptqgeavlpeeqdqnyvckhtyvdrgwgngcglfgkgslvtcakfqclepiegkvvqyenlkysvivtvhtgdqhqvgnettehgtiatitpqaptseiqltdygalglecsprtgldfnemilltmknkawmvhrqwffdlplpwtsgattetptwnrkellvtfknahakkqevvvlgsqegamhtaltgateiqtsgtttifaghlkcrlkmdklelkgmsyamctntfvlkkevsetqhgtilikveykgedapckipfstedgqgkahngrlitanpvvtkkeepvnieaeppfgesnivigigdnalkinwykkg
icdengueiiiunc3001
icdengueiwestpac'74
<110>北卡罗来纳－查佩尔山大学
messer,william
baric,ralph
desilva,aravinda
yount,boyd
<120>用于登革病毒疫苗的方法与组合物
<130>5470-671wo
<140>pct/us2014/044410
<141>2014-06-26
<150>us61/839,687
<151>2013-06-26
<160>7
<170>patentin版本3.5
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<213>人工的
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<223>具有q46l的3001-1f4edenv3/1序列
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