检测过敏相关基因突变的引物组、探针组、试剂盒及用途的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，特别是涉及一套检测与过敏相关的25个基因突变的引物组、探针组及试剂盒，用于多重pcr飞行核酸质谱技术进行基因检测的方法。

背景技术：

过敏是常见的自身免疫疾病，对人们的日常生活影响极大。对花粉过敏的患者，每年的春秋时节都受过敏症状的影响，表现出如皮肤红肿瘙痒、咳嗽打喷嚏等症状。食物过敏极易引发严重过敏反应，威胁患者生命安全，因而食物过敏患者日常生活中需特别注意饮食。而对于婴幼儿而言，不论是食物过敏(花生、牛奶、小麦麸质、鱼虾、桃子、坚果类食品等)还是环境过敏(花粉、尘螨、天然乳胶、宠物毛发等)，都严重威胁孩子健康和发育。此外，过敏还是具有职业倾向性，如医护人员容易对天然乳胶过敏，干扰医护人员工作的同时，也严重影响了他们的身体健康。

临床上，常见的过敏原检测多为皮试，部分过敏原可进行血液ige含量的检测。但是，这些检测通常是在患者表现出严重过敏反应后进行的，这严重影响了人们的生命健康。特别是难以明确表述自己症状的婴幼儿，过敏严重损害了孩子的健康和发育。然而近年来，随着人类基因组计划的完成和二代测序的广泛应用，科学家们得以使用大样本进行meta分析，探讨过敏表现与遗传信息多态性之间的关系，使得提前预知过敏风险成为可能。

其中，多重pcr核酸质谱飞行技术检测准确、快速，且检测相同数量snp下性价比高，更适合进行较全面的过敏风险筛查。该技术包含以下优势：全部实验操作均在一个ep管中完成，大大降低样品污染的可能；可以进行多达40重的pcr反应和基因型检测；不涉及荧光标记和凝胶电泳等手段；根据扩增产物荷质比在电场中运动轨迹的差异检测目的片段基因型，检测灵敏度高、快速。

但是，该方法对引物特异性、引物组合有着较高的要求。如何在保证单管进行最多的多重反应基础上，针对每一个snp位点，合理设计3种总碱基数不超过80bp的引物，避免特异性较低的引物产生非目的产物和交叉扩增，避免引物形成发卡结构等，是进行多个位点多态性检测的难点。

技术实现要素：

本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种检测过敏相关基因突变的引物组及探针组，以克服现有技术中的不足。

本发明的另一主要目的在于提供一种检测过敏相关基因突变的试剂盒。

本发明的另一目的还在于提供前述试剂盒在检测过敏相关基因突变中的用途。

本发明的另一目的还在于提供一种检测过敏相关基因突变的方法。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种检测过敏相关基因突变的引物组，其中所述过敏相关基因分别包括adrb2、bdnf、crhr1、crhr2、fcer1a、flg、flg-as1、gsdmb、hla-dqb1、il1r1、il10、il13、il18、il18r1、il33、lrrc3c、ms4a2、ptgdr、rad50、rtel1、serpinb7、stat6、tmem232、tnf和tslp，所述引物组包括：

adrb2基因的snp位点为rs1042713，其引物对包括第一引物和第二引物，且所述第一引物的序列如seqidno.1所示，所述第二引物的序列如seqidno.2所示；

bdnf基因的snp位点为rs10767664，其引物对包括第三引物和第四引物，且所述第三引物的序列如seqidno.3所示，所述第四引物的序列如seqidno.4所示；

crhr1基因的snp位点为rs1876828，其引物对包括第五引物和第六引物，且所述第五引物的序列如seqidno.5所示，所述第六引物的序列如seqidno.6所示；

crhr2基因的snp位点为rs7793837，其引物对包括第七引物和第八引物，且所述第七引物的序列如seqidno.7所示，所述第八引物的序列如seqidno.8所示；

fcer1a基因的snp位点为rs7793837、rs2251746及rs2427827，其中，rs7793837对应的引物对包括第九引物和第十引物，且所述第九引物的序列如seqidno.9所示，所述第十引物的序列如seqidno.10所示；rs2251746对应的引物对包括第十一引物和第十二引物，且所述第十一引物的序列如seqidno.11所示，所述第十二引物的序列如seqidno.12所示；rs2427827对应的引物对包括第十三引物和第十四引物，且所述第十三引物的序列如seqidno.13所示，所述第十四引物的序列如seqidno.14所示；

flg基因的snp位点为rs61816761，其引物对包括第十五引物和第十六引物，且所述第十五引物的序列如seqidno.15所示，所述第十六引物的序列如seqidno.16所示；

flg-as1基因的snp位点为rs3126085，其引物对包括第十七引物和第十八引物，且所述第十七引物的序列如seqidno.17所示，所述第十八引物的序列如seqidno.18所示；

gsdmb基因的snp位点为rs2305480，其引物对包括第十九引物和第二十引物，且所述第十九引物的序列如seqidno.19所示，所述第二十引物的序列如seqidno.20所示；

hla-dqb1基因的snp位点为rs1063355，其引物对包括第二十一引物和第二十二引物，且所述第二十一引物的序列如seqidno.21所示，所述第二十二引物的序列如seqidno.22所示；

il1r1基因的snp位点为rs1558641，其引物对包括第二十三引物和第二十四引物，且所述第二十三引物的序列如seqidno.23所示，所述第二十四引物的序列如seqidno.24所示；

il10基因的snp位点为rs1800871，其引物对包括第二十五引物和第二十六引物，且所述第二十五引物的序列如seqidno.25所示，所述第二十六引物的序列如seqidno.26所示；

il13基因的snp位点为rs1800925、rs20541，其中，rs1800871对应的引物对包括第二十七引物和第二十八引物，且所述第二十七引物的序列如seqidno.27所示，所述第二十八引物的序列如seqidno.28所示；rs20541对应的引物对包括第二十九引物和第三十引物，且所述第二十九引物的序列如seqidno.29所示，所述第三十引物的序列如seqidno.30所示；

il18基因的snp位点为rs1946518、rs187238，其中，rs1946518对应的引物对包括第三十一引物和第三十二引物，且所述第三十一引物的序列如seqidno.31所示，所述第三十二引物的序列如seqidno.32所示；rs187238对应的引物对包括第三十三引物和第三十四引物，且所述第三十三引物的序列如seqidno.33所示，所述第三十四引物的序列如seqidno.34所示；

il18r1基因的snp位点为rs13015714，其引物对包括第三十五引物和第三十六引物，且所述第三十五引物的序列如seqidno.35所示，所述第三十六引物的序列如seqidno.36所示；

il33基因的snp位点为rs928413，其引物对包括第三十七引物和第三十八引物，且所述第三十七引物的序列如seqidno.37所示，所述第三十八引物的序列如seqidno.38所示；

lrrc3c基因的snp位点为rs4794820，其引物对包括第三十九引物和第四十引物，且所述第三十九引物的序列如seqidno.39所示，所述第四十引物的序列如seqidno.40所示；

ms4a2基因的snp位点为rs569108，其引物对包括第四十一引物和第四十二引物，且所述第四十一引物的序列如seqidno.41所示，所述第四十二引物的序列如seqidno.42所示；

ptgdr基因的snp位点为rs8004654，其引物对包括第四十三引物和第四十四引物，且所述第四十三引物的序列如seqidno.43所示，所述第四十四引物的序列如seqidno.44所示；

rad50基因的snp位点为rs6871536，其引物对包括第四十五引物和第四十六引物，且所述第四十五引物的序列如seqidno.45所示，所述第四十六引物的序列如seqidno.46所示；

rtel1基因的snp位点为rs6010620，其引物对包括第四十七引物和第四十八引物，且所述第四十七引物的序列如seqidno.47所示，所述第四十八引物的序列如seqidno.48所示；

serpinb7基因的snp位点为rs12964116，其引物对包括第四十九引物和第五十引物，且所述第四十九引物的序列如seqidno.49所示，所述第五十引物的序列如seqidno.50所示；

stat6基因的snp位点为rs1059513、rs324015，其中，rs1059513对应的引物对包括第五十一引物和第五十二引物，且所述第五十一引物的序列如seqidno.51所示，所述第五十二引物的序列如seqidno.52所示；rs324015对应的引物对包括第五十三引物和第五十四引物，且所述第五十三引物的序列如seqidno.53所示，所述第五十四引物的序列如seqidno.54所示；

tmem232基因的snp位点为rs7701890，其引物对包括第五十五引物和第五十六引物，且所述第五十五引物的序列如seqidno.55所示，所述第五十六引物的序列如seqidno.56所示；

tnf基因的snp位点为rs1800630，其引物对包括第五十七引物和第五十八引物，且所述第五十七引物的序列如seqidno.57所示，所述第五十八引物的序列如seqidno.58所示；

tslp基因的snp位点为rs1898671，其引物对包括第五十九引物和第六十引物，且所述第五十九引物的序列如seqidno.59所示，所述第六十引物的序列如seqidno.60所示。

本发明实施例还提供了一种检测过敏相关基因突变的探针组，其中所述过敏相关基因分别包括adrb2、bdnf、crhr1、crhr2、fcer1a、flg、flg-as1、gsdmb、hla-dqb1、il1r1、il10、il13、il18、il18r1、il33、lrrc3c、ms4a2、ptgdr、rad50、rtel1、serpinb7、stat6、tmem232、tnf和tslp，所述探针组包括：

检测adrb2基因的snp位点rs1042713的第一探针，其序列如seqidno.61所示；

检测bdnf基因的snp位点rs10767664的第二探针，其序列如seqidno.62所示；

检测crhr1基因的snp位点rs1876828的第三探针，其序列如seqidno.63所示；

检测crhr2基因的snp位点rs7793837的第四探针，其序列如seqidno.64所示；

检测fcer1a基因的snp位点rs2427837的第五探针、snp位点rs2251746的第六探针及snp位点rs2427827的第七探针，其序列分别如seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67所示；

检测flg基因的snp位点rs61816761的第八探针，其序列如seqidno.68所示；

检测flg-as1基因的snp位点rs3126085的第九探针，其序列如seqidno.69所示；

检测gsdmb基因的snp位点rs2305480的第十探针，其序列如seqidno.70所示；

检测hla-dqb1基因的snp位点rs1063355的第十一探针，其序列如seqidno.71所示；

检测il1r1基因的snp位点rs1558641的第十二探针，其序列如seqidno.72所示；

检测il10基因的snp位点rs1800871的第十三探针，其序列如seqidno.73所示；

检测il13基因的snp位点rs1800925的第十四探针、snp位点rs20541的第十五探针，其序列分别如seqidno.74、seqidno.75所示；

检测il18基因的snp位点rs1946518的第十六探针、snp位点rs187238的第十七探针，其序列分别如seqidno.76、seqidno.77所示；

检测il18r1基因的snp位点rs13015714的第十八探针，其序列如seqidno.78所示；

检测il33基因的snp位点rs928413的第十九探针，其序列如seqidno.79所示；

检测lrrc3c基因的snp位点rs4794820的第二十探针，其序列如seqidno.80所示；

检测ms4a2基因的snp位点rs569108的第二十一探针，其序列如seqidno.81所示；

检测ptgdr基因的snp位点rs8004654的第二十二探针，其序列如seqidno.82所示；

检测rad50基因的snp位点rs6871536的第二十三探针，其序列如seqidno.83所示；

检测rtel1基因的snp位点rs6010620的第二十四探针，其序列如seqidno.84所示；

检测serpinb7基因的snp位点rs12964116的第二十五探针，其序列如seqidno.85所示；

检测stat6基因的snp位点rs1059513的第二十六探针、snp位点rs324015的第二十七探针，其序列分别如seqidno.86、seqidno.87所示；

检测tmem232基因的snp位点rs7701890的第二十八探针，其序列如seqidno.88所示；

检测tnf基因的snp位点rs1800630的第二十九探针，其序列如seqidno.89所示；

检测tslp基因的snp位点rs1898671的第三十探针，其序列如seqidno.90所示。

本发明实施例还提供了一种检测过敏相关基因突变的试剂盒，其包括至少一引物组和至少一探针组，其中一引物组为前述的引物组，一探针组为前述的探针组。

本发明实施例还提供了前述的试剂盒于制备检测过敏相关基因突变的产品中的用途。

进一步地，应用所述产品检测过敏相关基因突变的方法包括：

提供待检测的dna样本；

使所述待检测的dna样本与所述试剂盒的pcr扩增检测的常规组件混合，形成混合液；

采用多重pcr核酸质谱飞行技术，利用所述试剂盒所包含的引物组与探针组对所述混合液进行pcr扩增；

对pcr扩增产物进行检测，判断dna样本是否包含突变的过敏相关基因。

本发明实施例还提供了一种包含前述试剂盒的产品，所述产品应用于检测过敏相关基因突变的方法，所述方法包括：

提供待检测的dna样本；

使所述待检测的dna样本与所述试剂盒的pcr扩增检测的常规组件混合，形成混合液；

采用多重pcr技术，利用所述试剂盒所包含的引物组与探针组对所述混合液进行pcr扩增；

基于飞行质谱平台对探针延伸产物进行分离，分析dna样本是否包含突变的过敏相关基因。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

1)本发明提供了一套可以检测与过敏相关25基因的扩增引物、探针及试剂盒，筛除不合适的snp，引入与筛除位点处于强连锁不平衡的snp位点，再次进行设计和实验验证，直到优化出合适的引物及其组合，针对涉及到的每一个基因，设计了一对上下游引物用于基因扩增；针对每一个检测位点，设计了相应探针，用于单碱基扩增；

2)本发明采用多重pcr核酸质谱飞行技术，快速、高精准、高灵敏的检测与过敏相关的25个基因的风险位点，可一次性、快速、高效、精确、高性价比的检测有文献或数据库支持的、与过敏相关的25个基因的30个snp位点多态性，达到过敏风险提醒的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一典型实施例中过敏相关25基因30位点的检测结果示意图。

图2是本发明一典型实施例中rs1042713的检测结果示意图。

图3是本发明一典型实施例中rs928413的检测结果示意图。

具体实施方式

下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起到限制性作用。

在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：

采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。

在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。

一般来讲，检测的过敏风险如下：

食物过敏：花生、鱼虾、牛奶、桃子、坚果、小麦麸质；涉及到的snp位点包括rs12964116、rs12123821、rs12964116、rs61816761、rs12123821、rs12964116、rs13015714、rs1059513。

环境过敏：花粉、尘螨、天然乳胶、宠物毛皮屑；涉及到的snp位点包括rs2155219、rs928413、rs2155219、rs1898671、rs1800925、rs1946518、rs7775228。

过敏体质：哮喘、过敏性咳嗽、皮炎、风疹、过敏性鼻炎；涉及到的snp位点包括rs6871536、rs928413、rs1558641、rs187238、rs10767664、rs20541、rs2305480、rs7701890、rs6010620、rs20541、rs3126085、rs1800871、rs1800630、rs2427827、rs8004654、rs2251746、rs1059513、rs1800925、rs20541、rs20541、rs569108、rs2155219、rs7775228、rs4794820、rs2427837、rs2251746、rs2427837、rs2251746、rs1063355、rs1042713、rs7793837、rs1876828。

本发明涉及一种多重pcr核酸质谱飞行技术，包含一套可以检测与过敏相关的25基因(分别为adrb2、bdnf、crhr1、crhr2、fcer1a、flg、flg-as1、gsdmb、hla-dqb1、il1r1、il10、il13、il18、il18r1、il33、lrrc3c、ms4a2、ptgdr、rad50、rtel1、serpinb7、stat6、tmem232、和tslp)的扩增引物和探针。本发明内容包括：针对涉及到的每一个基因，设计了一对上下游引物用于基因扩增；针对每一个检测位点，设计了相应探针，用于单碱基扩增。

本发明实施例的一个方面提供了一种检测过敏相关基因突变的引物组，其中所述过敏相关基因分别包括adrb2、bdnf、crhr1、crhr2、fcer1a、flg、flg-as1、gsdmb、hla-dqb1、il1r1、il10、il13、il18、il18r1、il33、lrrc3c、ms4a2、ptgdr、rad50、rtel1、serpinb7、stat6、tmem232、和tslp，所述引物组包括：

adrb2基因的snp位点为rs1042713，其引物对包括第一引物和第二引物，且所述第一引物的序列如seqidno.1所示(即上游引物，具体序列为acgttggatggaacggcttcttg)，所述第二引物的序列如seqidno.2所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgttggcgctgtgatgac)；

bdnf基因的snp位点为rs10767664，其引物对包括第三引物和第四引物，且所述第三引物的序列如seqidno.3所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgttcccttttgtcgg)，所述第四引物的序列如seqidno.4所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgggtaggaactagc)；

crhr1基因的snp位点为rs1876828，其引物对包括第五引物和第六引物，且所述第五引物的序列如seqidno.5所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgcaaagatgctctgg)，所述第六引物的序列如seqidno.6所示(即下游引物，具体序列为acgttggatggatgtagagccctcc)；

crhr2基因的snp位点为rs7793837，其引物对包括第七引物和第八引物，且所述第七引物的序列如seqidno.7所示(即上游引物，具体序列为acgatgagagggaacatcttgac)，所述第八引物的序列如seqidno.8所示(即下游引物，具体序列为acgttgttcttttcagtgtccactgc)；

fcer1a基因的snp位点为rs7793837、rs2251746及rs2427827，其中，rs7793837对应的引物对包括第九引物和第十引物，且所述第九引物的序列如seqidno.9所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgtctctctgctacctg)，所述第十引物的序列如seqidno.10所示(即下游引物，具体序列为acgttggatggtgagcctgttgttg)；rs2251746对应的引物对包括第十一引物和第十二引物，且所述第十一引物的序列如seqidno.11所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgcgcatatgtttggta)，所述第十二引物的序列如seqidno.12所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgccacataacctggtc)；rs2427827对应的引物对包括第十三引物和第十四引物，且所述第十三引物的序列如seqidno.13所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgtaaaccagtgggcac)，所述第十四引物的序列如seqidno.14所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgttttcatggctccgtg)；

flg基因的snp位点为rs61816761，其引物对包括第十五引物和第十六引物，且所述第十五引物的序列如seqidno.15所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgacgaatggtgtctg)，所述第十六引物的序列如seqidno.16所示(即下游引物，具体序列为acgtgtctggacgttcagggtcttc)；

flg-as1基因的snp位点为rs3126085，其引物对包括第十七引物和第十八引物，且所述第十七引物的序列如seqidno.17所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgtctcaagcagaactc)，所述第十八引物的序列如seqidno.18所示(即下游引物，具体序列为acgttggatggccaagattccagttc)；

gsdmb基因的snp位点为rs2305480，其引物对包括第十九引物和第二十引物，且所述第十九引物的序列如seqidno.19所示(即上游引物，具体序列为acgttggatggtccagcttttgcac)，所述第二十引物的序列如seqidno.20所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgatctgctgtgagagc)；

hla-dqb1基因的snp位点为rs1063355，其引物对包括第二十一引物和第二十二引物，且所述第二十一引物的序列如seqidno.21所示(即上游引物，具体序列为acgttggatggctttcagtcaagg)，所述第二十二引物的序列如seqidno.22所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgagactgctcaagcac)；

il1r1基因的snp位点为rs1558641，其引物对包括第二十三引物和第二十四引物，且所述第二十三引物的序列如seqidno.23所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgcttactccatggaag)，所述第二十四引物的序列如seqidno.24所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgaaggcatagggctctc)；

il10基因的snp位点为rs1800871，其引物对包括第二十五引物和第二十六引物，且所述第二十五引物的序列如seqidno.25所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgagtggaaagtactgc)，所述第二十六引物的序列如seqidno.26所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgtggaggtgtacaggg)；

il13基因的snp位点为rs1800925、rs20541，其中，rs1800871对应的引物对包括第二十七引物和第二十八引物，且所述第二十七引物的序列如seqidno.27所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgcccagtttgtaacctg)，所述第二十八引物的序列如seqidno.28所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgattttaccccctaacc)；rs20541对应的引物对包括第二十九引物和第三十引物，且所述第二十九引物的序列如seqidno.29所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgcaacccacagcaatg)，所述第三十引物的序列如seqidno.30所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgactctgcaggatcacc)；

il18基因的snp位点为rs1946518、rs187238，其中，rs1946518对应的引物对包括第三十一引物和第三十二引物，且所述第三十一引物的序列如seqidno.31所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgcccaagctcggtgtc)，所述第三十二引物的序列如seqidno.32所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgctctccaagcttatc)；rs187238对应的引物对包括第三十三引物和第三十四引物，且所述第三十三引物的序列如seqidno.33所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgttccagggcatggtc)，所述第三十四引物的序列如seqidno.34所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgctaggactaaggagc)；

il18r1基因的snp位点为rs13015714，其引物对包括第三十五引物和第三十六引物，且所述第三十五引物的序列如seqidno.35所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgcattttgccgctatg)，所述第三十六引物的序列如seqidno.36所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgggatgttcactatagg)；

il33基因的snp位点为rs928413，其引物对包括第三十七引物和第三十八引物，且所述第三十七引物的序列如seqidno.37所示(即上游引物，具体序列为acgttgatgtstgaagcactga)，所述第三十八引物的序列如seqidno.38所示(即下游引物，具体序列为acgttggartcttcakccacaacacc)；

lrrc3c基因的snp位点为rs4794820，其引物对包括第三十九引物和第四十引物，且所述第三十九引物的序列如seqidno.39所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgcagagatggcttac)，所述第四十引物的序列如seqidno.40所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgaccacattacgtgtg)；

ms4a2基因的snp位点为rs569108，其引物对包括第四十一引物和第四十二引物，且所述第四十一引物的序列如seqidno.41所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgtatcaggtaggatcg)，所述第四十二引物的序列如seqidno.42所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgtagccccttaagacc)；

ptgdr基因的snp位点为rs8004654，其引物对包括第四十三引物和第四十四引物，且所述第四十三引物的序列如seqidno.43所示(即上游引物，具体序列为acgttgcctcgcctatgcaatg)，所述第四十四引物的序列如seqidno.44所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgtcgaaagcgaagagg)；

rad50基因的snp位点为rs6871536，其引物对包括第四十五引物和第四十六引物，且所述第四十五引物的序列如seqidno.45所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgggaggagaacgg)，所述第四十六引物的序列如seqidno.46所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgcacagtggataaaccc)；

rtel1基因的snp位点为rs6010620，其引物对包括第四十七引物和第四十八引物，且所述第四十七引物的序列如seqidno.47所示(即上游引物，具体序列为acgttggatggcctagagctagcg)，所述第四十八引物的序列如seqidno.48所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgccatctcagcaacc)；

serpinb7基因的snp位点为rs12964116，其引物对包括第四十九引物和第五十引物，且所述第四十九引物的序列如seqidno.49所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgcaaccacctgatac)，所述第五十引物的序列如seqidno.50所示(即下游引物，具体序列为acgttggatactgtccaaaggtgc)；

stat6基因的snp位点为rs1059513、rs324015，其中，rs1059513对应的引物对包括第五十一引物和第五十二引物，且所述第五十一引物的序列如seqidno.51所示(即上游引物，具体序列为attgatgaccaaggtcttgttaagg)，所述第五十二引物的序列如seqidno.52所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgagctgtgtgtggtca)；rs324015对应的引物对包括第五十三引物和第五十四引物，且所述第五十三引物的序列如seqidno.53所示(即上游引物，具体序列为acgttggatggttgtcagcaaagc)，所述第五十四引物的序列如seqidno.54所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgagccccaaattcctc)；

tmem232基因的snp位点为rs7701890，其引物对包括第五十五引物和第五十六引物，且所述第五十五引物的序列如seqidno.55所示(即上游引物，具体序列为acgttgccaatgaagctactggg)，所述第五十六引物的序列如seqidno.56所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgcaaactggaaaaccc)；

tnf基因的snp位点为rs1800630，其引物对包括第五十七引物和第五十八引物，且所述第五十七引物的序列如seqidno.57所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgctatggaaggagtg)，所述第五十八引物的序列如seqidno.58所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgtcggcttccaaggatc)；

tslp基因的snp位点为rs1898671，其引物对包括第五十九引物和第六十引物，且所述第五十九引物的序列如seqidno.59所示(即上游引物，具体序列为acgttggatgtggcattttgtcaag)，所述第六十引物的序列如seqidno.60所示(即下游引物，具体序列为acgttggatgcaatagtcagagtaac)。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种检测过敏相关基因突变的探针组，其中所述过敏相关基因分别包括adrb2、bdnf、crhr1、crhr2、fcer1a、flg、flg-as1、gsdmb、hla-dqb1、il1r1、il10、il13、il18、il18r1、il33、lrrc3c、ms4a2、ptgdr、rad50、rtel1、serpinb7、stat6、tmem232、tnf和tslp，所述探针组包括：

检测adrb2基因的snp位点rs1042713的第一探针，其序列如seqidno.61所示，具体序列为ccggcgcatttc；

检测bdnf基因的snp位点rs10767664的第二探针，其序列如seqidno.62所示，具体序列为ggatgcttacatgttttt；

检测crhr1基因的snp位点rs1876828的第三探针，其序列如seqidno.63所示，具体序列为agcctctctccctg；

检测crhr2基因的snp位点rs7793837的第四探针，其序列如seqidno.64所示，具体序列为ggggttttgtgcgttag；

检测fcer1a基因的snp位点rs2427837的第五探针、snp位点rs2251746的第六探针及snp位点rs2427827的第七探针，其序列分别如seqidno.65、seqidno.66、seqidno.67所示，其中seqidno.65所示的具体序列为ctacttctccccatgatg，seqidno.66所示的具体序列为cgttgctgctgttttctgc，seqidno.67所示的具体序列为atgatgggccagatatga；

检测flg基因的snp位点rs61816761的第八探针，其序列如seqidno.68所示，具体序列为tttcttgcctgtgtctc；

检测flg-as1基因的snp位点rs3126085的第九探针，其序列如seqidno.69所示，具体序列为gaatttggcttgtaagt；

检测gsdmb基因的snp位点rs2305480的第十探针，其序列如seqidno.70所示，具体序列为ggagctcacgaggac；

检测hla-dqb1基因的snp位点rs1063355的第十一探针，其序列如seqidno.71所示，具体序列为cccaagaagcacatgaaaa；

检测il1r1基因的snp位点rs1558641的第十二探针，其序列如seqidno.72所示，具体序列为cctggaagaaggagga；

检测il10基因的snp位点rs1800871的第十三探针，其序列如seqidno.73所示，具体序列为ttgcccttcaggtgatgtaa；

检测il13基因的snp位点rs1800925的第十四探针、snp位点rs20541的第十五探针，其序列分别如seqidno.74、seqidno.75所示，其中seqidno.74所示的具体序列为gggatttttcgcggac，seqidno.75所示的具体序列为ggaggacttctaggaaaa；

检测il18基因的snp位点rs1946518的第十六探针、snp位点rs187238的第十七探针，其序列分别如seqidno.76、seqidno.77所示，其中seqidno.76所示的具体序列为gtgcaggtgtaattatta，seqidno.77所示的具体序列为tcctgatatctcatgaaat；

检测il18r1基因的snp位点rs13015714的第十八探针，其序列如seqidno.78所示，具体序列为cctttggctgttatttaac；

检测il33基因的snp位点rs928413的第十九探针，其序列如seqidno.79所示，具体序列为mtgccttggccygctct；

检测lrrc3c基因的snp位点rs4794820的第二十探针，其序列如seqidno.80所示，具体序列为cctcctcaaggtttgttg；

检测ms4a2基因的snp位点rs569108的第二十一探针，其序列如seqidno.81所示，具体序列为cgtggaacccgg；

检测ptgdr基因的snp位点rs8004654的第二十二探针，其序列如seqidno.82所示，具体序列为acgtgagttatctttacc；

检测rad50基因的snp位点rs6871536的第二十三探针，其序列如seqidno.83所示，具体序列为gcggacatctttgtata；

检测rtel1基因的snp位点rs6010620的第二十四探针，其序列如seqidno.84所示，具体序列为ttacctgggaagc；

检测serpinb7基因的snp位点rs12964116的第二十五探针，其序列如seqidno.85所示，具体序列为gggatggccccta；

检测stat6基因的snp位点rs1059513的第二十六探针、snp位点rs324015的第二十七探针，其序列分别如seqidno.86、seqidno.87所示，其中seqidno.86所示的具体序列为ctgcttttagatttatt，seqidno.87所示的具体序列为cgaactcagccct；

检测tmem232基因的snp位点rs7701890的第二十八探针，其序列如seqidno.88所示，具体序列为catacctactaaat；

检测tnf基因的snp位点rs1800630的第二十九探针，其序列如seqidno.89所示，具体序列为atggccctcttcattaag；

检测tslp基因的snp位点rs1898671的第三十探针，其序列如seqidno.90所示，具体序列为agaccgcgttatg。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种检测过敏相关基因突变的试剂盒，其包括至少一引物组和至少一探针组，其中一引物组为前述的引物组，一探针组为前述的探针组。

进一步地，所述的试剂盒还包括pcr扩增检测的常规组件，所述pcr扩增检测的常规组件包括pcr反应用缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液(dntps)、dna聚合酶等。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述试剂盒于制备检测过敏相关基因突变的产品中的用途。

进一步地，应用所述产品检测过敏相关基因突变的方法包括：

提供待检测的dna样本；

使所述待检测的dna样本与所述试剂盒的pcr扩增检测的常规组件混合，形成混合液；

采用多重pcr技术，利用所述试剂盒所包含的引物组与探针组对所述混合液进行pcr扩增；

基于飞行质谱平台对探针延伸产物进行分离，分析dna样本是否包含突变的过敏相关基因。

其中，所述待检测的dna样本来源包括但不限于受试者口腔粘膜、血液、唾液、毛囊等可获得完整基因组dna的检测材料的任意一种或两种以上的组合，此种方法对被试者来说取样方便，不用抽血。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种包含前述试剂盒的产品，所述产品应用于检测过敏相关基因突变的方法，所述方法包括：

提供待检测的dna样本；

使所述待检测的dna样本与所述试剂盒的pcr扩增检测的常规组件混合，形成混合液；

采用多重pcr核酸质谱飞行技术，利用所述试剂盒所包含的引物组与探针组对所述混合液进行pcr扩增；

对pcr扩增产物进行检测，判断dna样本是否包含突变的过敏相关基因。

其中，所述待检测的dna样本来源包括但不限于受试者口腔粘膜、血液、唾液、毛囊等可获得完整基因组dna的检测材料的任意一种或两种以上的组合，此种方法对被试者来说取样方便，不用抽血。

以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例涉及到的25基因及相应基因扩增引物、探针如下表：

本实施例中检测过敏相关基因突变的方法具体包括以下步骤：

1.基因组dna的提取

①刮拭过口腔粘膜3-4次的棉签放入1.5ml离心管内，加入1mlpbs缓冲液，反复挤压搅动，使细胞脱落。10000r/min离心3min，弃上清后，加入100μlte缓冲液。

②高速震荡5-10s，悬浮沉淀，沸水煮10min后冰浴3-5min，再次高速震荡5-10s后，10000/min离心3min，上清液4℃保存待用。

2.目的片段扩增

pcr反应使用384孔板，在proflexpcr仪中进行两次pcr扩增和一次单链dna消化。

①pcr反应体系5μl，保证体系中包含20-50ng的dna模板，0.5u的dna聚合酶，每条扩增引物0.5pmol以及0.25μmol/l的dntp。pcr反应过程如下：95℃预变性2min，(95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s)循环45次，72℃延伸5min。

②sap消化。pcr反应完成后，4000rpm离心5min，加入2ul的iplex-sap反应液，proflexpcr仪中进行消化。消化条件为：37℃消化40min，85℃消化5min，4000rpm离心5min，4℃保存待用。

③单碱基延伸。加入2μl的iplex-ext反应液，该反应液中含有0.94μmol/l的探针mix，0.2μl的gold缓冲液，0.2μl的终止mix，0.041u的dna聚合酶。4000rpm离心5min。pcr反应过程如下：95℃预变性30s，(95℃变性5s，56℃退火5s，80℃延伸5s)进行40个外循环，外循环中(56℃退火5s，80℃延伸5s)进行5次，72℃延伸3min，4℃保存待用。

3.树脂纯化：在384孔板中每孔加入16μl纯水及干净的树脂6mg，将干燥后的树脂倒入延伸产物中，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触，离心使树脂沉入孔底。

4.样品分析物的共结晶及检测：将纯化产物转移至384孔spectrochip芯片上，上机测定。spectrochip芯片使用maldi-tof-ms进行分析，检测结果使用typer软件分型并输出。检测结果如图1所示，不同基因型的样品点彼此分离、互相无相交；同时图2、3(部分位点示例图)中不同分型的峰型和分离情况良好。其中，图1-图3中横坐标为分子质量(道尔顿)，纵坐标为信号强度。

5.建议对检测结果进行分析

图1显示，所检测的25个基因30个snp位点的峰值位置明显分离，不相互重叠，本申请所涉及的引物能高效的扩增目的片段。图2、3显示本申请所涉及的探针能有效、精确的只延伸一个碱基。且延伸产物在荷质比上不同，因而上机后经电场及磁场作用，不同延伸产物经过相同时间、不同轨迹的运动，落在不同位置并被质谱仪检测到，因而图谱上峰值位置明显分离，不相互重叠。

综上所述，藉由上述技术方案，本发明提供了一套可以检测与过敏相关25基因的扩增引物、探针及试剂盒，针对涉及到的每一个基因，设计了一对上下游引物用于基因扩增；针对每一个检测位点，设计了相应探针，用于单碱基扩增；本发明采用多重pcr核酸质谱飞行技术，快速、高精准、高灵敏的检测与过敏相关的25个基因的风险位点，可一次性、快速、高效、精确、高性价比的检测与过敏相关的25个基因的30个snp位点多态性，达到过敏风险提醒的作用。

本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。

在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。

在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。

应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。

尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。

序列表

<110>苏州乾康基因有限公司

<120>检测过敏相关基因突变的引物组、探针组、试剂盒及用途

<160>90

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>1

acgttggatggaacggcttcttg23

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>2

acgttggatgttggcgctgtgatgac26

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>3

acgttggatgttcccttttgtcgg24

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>4

acgttggatgggtaggaactagc23

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>5

acgttggatgcaaagatgctctgg24

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>6

acgttggatggatgtagagccctcc25

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>7

acgatgagagggaacatcttgac23

<210>8

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>8

acgttgttcttttcagtgtccactgc26

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>9

acgttggatgtctctctgctacctg25

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>10

acgttggatggtgagcctgttgttg25

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>11

acgttggatgcgcatatgtttggta25

<210>12

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>12

acgttggatgccacataacctggtc25

<210>13

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>13

acgttggatgtaaaccagtgggcac25

<210>14

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>14

acgttggatgttttcatggctccgtg26

<210>15

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>15

acgttggatgacgaatggtgtctg24

<210>16

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>16

acgtgtctggacgttcagggtcttc25

<210>17

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>17

acgttggatgtctcaagcagaactc25

<210>18

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>18

acgttggatggccaagattccagttc26

<210>19

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>19

acgttggatggtccagcttttgcac25

<210>20

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>20

acgttggatgatctgctgtgagagc25

<210>21

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>21

acgttggatggctttcagtcaagg24

<210>22

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<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>22

acgttggatgagactgctcaagcac25

<210>23

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>23

acgttggatgcttactccatggaag25

<210>24

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>24

acgttggatgaaggcatagggctctc26

<210>25

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

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acgttggatgagtggaaagtactgc25

<210>26

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>26

acgttggatgtggaggtgtacaggg25

<210>27

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<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>27

acgttggatgcccagtttgtaacctg26

<210>28

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<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>28

acgttggatgattttaccccctaacc26

<210>29

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>29

acgttggatgcaacccacagcaatg25

<210>30

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>30

acgttggatgactctgcaggatcacc26

<210>31

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>31

acgttggatgcccaagctcggtgtc25

<210>32

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>32

acgttggatgctctccaagcttatc25

<210>33

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>33

acgttggatgttccagggcatggtc25

<210>34

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>34

acgttggatgctaggactaaggagc25

<210>35

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>35

acgttggatgcattttgccgctatg25

<210>36

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>36

acgttggatgggatgttcactatagg26

<210>37

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>37

acgttgatgtstgaagcactga22

<210>38

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>38

acgttggartcttcakccacaacacc26

<210>39

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>39

acgttggatgcagagatggcttac24

<210>40

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>40

acgttggatgaccacattacgtgtg25

<210>41

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>41

acgttggatgtatcaggtaggatcg25

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<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>42

acgttggatgtagccccttaagacc25

<210>43

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>43

acgttgcctcgcctatgcaatg22

<210>44

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<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>44

acgttggatgtcgaaagcgaagagg25

<210>45

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>45

acgttggatgggaggagaacgg22

<210>46

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>46

acgttggatgcacagtggataaaccc26

<210>47

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>47

acgttggatggcctagagctagcg24

<210>48

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<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>48

acgttggatgccatctcagcaacc24

<210>49

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

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acgttggatgcaaccacctgatac24

<210>50

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>50

acgttggatactgtccaaaggtgc24

<210>51

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>51

attgatgaccaaggtcttgttaagg25

<210>52

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>52

acgttggatgagctgtgtgtggtca25

<210>53

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>53

acgttggatggttgtcagcaaagc24

<210>54

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>54

acgttggatgagccccaaattcctc25

<210>55

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>55

acgttgccaatgaagctactggg23

<210>56

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>56

acgttggatgcaaactggaaaaccc25

<210>57

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>57

acgttggatgctatggaaggagtg24

<210>58

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>58

acgttggatgtcggcttccaaggatc26

<210>59

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>59

acgttggatgtggcattttgtcaag25

<210>60

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>60

acgttggatgcaatagtcagagtaac26

<210>61

<211>12

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>61

ccggcgcatttc12

<210>62

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>62

ggatgcttacatgttttt18

<210>63

<211>14

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>63

agcctctctccctg14

<210>64

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>64

ggggttttgtgcgttag17

<210>65

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>65

ctacttctccccatgatg18

<210>66

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>66

cgttgctgctgttttctgc19

<210>67

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>67

atgatgggccagatatga18

<210>68

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>68

tttcttgcctgtgtctc17

<210>69

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>69

gaatttggcttgtaagt17

<210>70

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>70

ggagctcacgaggac15

<210>71

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>71

cccaagaagcacatgaaaa19

<210>72

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>72

cctggaagaaggagga16

<210>73

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>73

ttgcccttcaggtgatgtaa20

<210>74

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>74

gggatttttcgcggac16

<210>75

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>75

ggaggacttctaggaaaa18

<210>76

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>76

gtgcaggtgtaattatta18

<210>77

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>77

tcctgatatctcatgaaat19

<210>78

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>78

cctttggctgttatttaac19

<210>79

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>79

mtgccttggccygctct17

<210>80

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>80

cctcctcaaggtttgttg18

<210>81

<211>12

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>81

cgtggaacccgg12

<210>82

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>82

acgtgagttatctttacc18

<210>83

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>83

gcggacatctttgtata17

<210>84

<211>13

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>84

ttacctgggaagc13

<210>85

<211>13

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>85

gggatggccccta13

<210>86

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>86

ctgcttttagatttatt17

<210>87

<211>13

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>87

cgaactcagccct13

<210>88

<211>14

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>88

catacctactaaat14

<210>89

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>89

atggccctcttcattaag18

<210>90

<211>13

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>90

agaccgcgttatg13