本发明主要是关于一种具有促消化功效的益生菌食用组合物及食品，具体是指一种包含乳双歧杆菌、副干酪乳杆菌的益生菌食用组合物，可有效促消化，该组合物可添加在各种健康食品以及保健食品例如发酵乳、乳饮料、奶片、奶粉等中。
背景技术：
：与亚洲发达国家相比，中国各地区消化不良发病率普遍偏高，其中广东居民消化不良患病率为18.92％，天津居民消化不良患病率为23.29％，香港报道的消化不良患病率为18.4％。消化不良会严重影响人们的生活质量并耗费大量的医疗资源。富含益生菌的产品通常被认为具有促消化功能，但是并非所有益生菌均可以发挥促消化作用，益生菌功效的发挥具有菌株特异性。cn109221396a公开了一种含促消化混合剂的凝固型酸奶制备方法，其促消化混合剂包括有膳食纤维、葡萄籽原花青素、铁皮石斛粉组成。cn108522922a公开了一种促消化保健果醋饮料及其制备方法，其原料由药食两用食材加益生菌组成。cn105815640a公开了一种促消化调整肠胃果蔬益生菌产品及其制备方法，选用促消化的果蔬原料，采用两段发酵法，将果蔬内的糖分转化为益生菌菌体及代谢产物，从而使产品起到促进消化的作用。cn105176726a公开了一种多功能促消化液体调味剂及其制备方法，通过药食两用食材加复合活性益生菌，起到健胃促消化、益气补血的作用。cn103859270b公开了一种有益消化保健粥及其制备方法，添加了益生菌牛乳、橘皮、松花蛋、腌黄瓜等有易消化的食材。上述文献均选用了组合物以期望能使产品具有促消化作用，然而组合物中各组分可能存在协同也可能存在拮抗，以上文献均没有进行促消化组合物的系统功效评价实验以验证是否可以达到促消化功效，且其中添加益生菌的文献都没有具体到株水平，复合益生菌既没有确定菌株也没有验证复合菌的功效，而不同菌株的互作是非常复杂的，盲目叠加很可能无效或产生副作用。现有技术中，真正具有实际应用价值的促消化益生菌或益生菌组合鲜有报道。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种具有促消化功效的益生菌食用组合物，以制成食品，供消费者方便食用，同时具有促消化的功效。本发明的另一目的在于提供所述的益生菌食用组合物在制备具有促消化功效的食品中的应用。本发明的另一目的在于提供一种具有促消化功效的食品。一方面，本发明提供了一种益生菌食用组合物，该组合物包括乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)bl-99、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)k56及副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)et-22。根据本发明的具体实施方案，本发明的益生菌食用组合物中，乳双歧杆菌bl-99为保藏编号cgmccno.15650的菌株(本发明中将其亦称为bl-99)。该菌株具有耐胃酸性能，在ph2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上。本发明提供的乳双歧杆菌bl-99还具有耐肠液性能，在ph6.8的小肠液中处理2小时活菌存活率70％以上。小鼠实验表明该菌株无口服急性毒性，无抗生素耐受，安全可以用于食品加工。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)；保藏编号为cgmccno.15650。根据本发明的具体实施方案，本发明的益生菌食用组合物中，副干酪乳杆菌k56为保藏编号cgmccno.15139或dsm27447的菌株。副干酪乳杆菌(lactobacillusparacaseisubsp.paracasei)k56菌株已于2013年6月27日保存于德国微生物及细胞培养物收集中心(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures)，保藏编号dsm27447；另外，副干酪乳杆菌(lactobacillusparacaseisubsp.paracasei)k56菌株也已于2017年12月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：副干酪乳杆菌(lactobacillusparacaseisubsp.paracasei)；保藏编号cgmccno.15139。另外，副干酪乳杆菌k56也已于2014年4月8日寄存于财团法人食品工业发展研究所(foodindustryresearchanddevelopmentinstitute,firdi)的生物资源保存及研究中心，寄存编号为bcrc910621。根据本发明的具体实施方案，本发明的益生菌食用组合物中，副干酪乳杆菌et-22为保藏编号cgmccno.15077的菌株。该菌株已2017年12月18日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)；保藏编号cgmccno.15077。在本发明的一些具体实施方案中，本发明的益生菌食用组合物中，乳双歧杆菌bl-99、副干酪乳杆菌k56、副干酪乳杆菌et-22的活菌数之比为1～10：1～10：1～10。在本发明的另一些具体实施方案中，本发明的益生菌食用组合物中，乳双歧杆菌bl-99、副干酪乳杆菌k56、副干酪乳杆菌et-22的重量(以每种菌的菌粉重量计)比例为1～10：1～10：1～10。根据本发明的具体实施方案，本发明的益生菌食用组合物中，乳双歧杆菌bl-99、副干酪乳杆菌k56、副干酪乳杆菌et-22各自独立地为活菌。本案发明人在研究中惊喜地发现，将乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)bl-99、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)k56及副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)et-22组合，所得组合物具有显著的促消化功效，这三种益生菌的组合物对于改善摄食量、蛋白质表观消化率、改善肠组织形态和功能、促进肠运动等方面起到了协同作用。本发明的组合物为一种具有促消化功效的益生菌食用组合物。从而，另一方面，本发明还提供了所述的益生菌食用组合物在制备具有促消化功效的食品中的应用。本发明还提供了一种具有促消化功效的食品，该食品的原料组成中包括本发明所述的益生菌食用组合物。根据本发明的具体实施方案，本发明的包括所述益生菌食用组合物的食品，可以为冻干粉、胶囊、颗粒剂、吞服片剂或含片等形式的固态食品，或者也可以为口服液或饮料等形式的液态食品。在一些具体的实施方案中，所述食品为发酵乳、乳饮料、奶片或奶粉。根据本发明的具体实施方案，本发明的包括所述益生菌食用组合物的食品中，所述的益生菌食用组合物在食品中的应用量为107cfu～1011cfu/天，或者以菌体的重量计为0.001μg～100mg/天。本发明的包括所述益生菌食用组合物的食品，因包括所述益生菌食用组合物而具有促消化功能。专利程序的微生物保存：(一)本发明的乳双歧杆菌bl-99：保藏日期：2018年04月26日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏编号：cgmccno.15650；分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)。(二)本发明的副干酪乳杆菌et-22：保藏日期：2017年12月18日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏编号：cgmccno.15077；分类命名：副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1一、乳双歧杆菌bl-99本发明的乳双歧杆菌bl-99是自婴儿肠道中分离得到的。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)；保藏编号为cgmccno.15650。1.乳双歧杆菌bl-99的分类学特征理化试验结果:2.乳双歧杆菌bl-99的人工胃液、肠液耐受性双歧杆菌为通常不抗酸的菌属。本实施例中，测试了本发明的乳双歧杆菌bl-99的人工胃液、肠液耐受性，同时以目前领域中公认耐酸性能极好、可以通过胃肠道存活的乳双歧杆菌bb-作为对比。测试方法：将乳双歧杆菌bl-99菌株于mrs液体培养基中37℃培养16小时后，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体。将待测菌株分别在人工胃液、人工小肠液中培养，37℃处理0、30min、2h后进行活菌计数分析，以存活率评价菌株的耐酸及耐肠液性能。存活率＝(处理后的活菌数/0时刻活菌数)×100％。菌株在人工胃酸(ph2.5)中的存活率检测结果如表1所示，bb-12在人工胃酸(ph2.5)中处理30min时活菌存活率7.04％，处理2小时活菌存活率仅1.64％；而本发明的乳双歧杆菌bl-99在人工胃酸(ph2.5)中处理30min时活菌存活率62.60％，处理2小时活菌存活率61.83％。表明本发明的乳双歧杆菌bl-99具有优异的耐胃酸能力，能较为顺利地通过胃到达肠道发挥益生作用。表1菌株在人工胃酸(ph2.5)中的存活率菌株在人工小肠液(ph6.8)中的存活率检测结果参见表2。数据显示，bb-12在人工小肠液(ph6.8)中处理2小时活菌存活率仅28.95％；而本发明的乳双歧杆菌bl-99在人工胃酸(ph2.5)中处理2小时活菌存活率70.23％。表明本发明的乳双歧杆菌bl-99具有优异的耐肠液能力，可以在肠道内存活并定殖。表2菌株在人工小肠液(ph6.8)中的存活率3.乳双歧杆菌bl-99的的毒力实验及安全性检测将本发明的乳双歧杆菌bl-99接种于bbl液体培养基中，36±1℃厌氧培养48±2小时，计数培养液中乳双歧杆菌bl-99活菌数为3.7×108cfu/ml，将培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0ml/kgbw给受试小鼠连续灌胃3天，观察7天。试验设培养基原液和5倍浓缩液对照组。试验结果表明：乳双歧杆菌bl-99的bbl培养物原液和5倍浓缩液组与各自对照组相比，对小鼠体重增长的影响无统计学意义(p＞0.05)，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。采用sn/t1944-2007《动物及其制品中细菌耐药性的测定》方法，评估乳双歧杆菌bl-99的抗生素敏感性能。评价结果显示，乳双歧杆菌bl-99对氨苄西林ampicillin、青霉素gpenicilling、红霉素erythromycin、氯霉素chloramphenicol、克林霉素clindamycin、万古霉素vancomycin和四环素tetracycline等敏感。符合欧洲食品安全委员会(europeanfoodsafetyauthority)对食用细菌耐药性评价规范中的要求。乳双歧杆菌bl-99不含外源抗生素耐药基因，食用安全。二、副干酪乳杆菌et-22本发明的副干酪乳杆菌et-22已2017年12月18日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)；保藏编号cgmccno.15077。根据16srdna序列分析以及api细菌鉴定系统分析结果来确认et-22菌株在分类学上的特征。上具体如下：形态学特征：1.于mrs培养液培养时，菌体呈中短杆状，二端呈圆形，通常成链状，偶尔成对出现。2.革兰氏染色阳性杆菌，不生成孢子，不具触酶、氧化酶及运动性，在好氧及厌氧环境均能生长，最适宜的生长温度为37±1℃，属于兼性异质发酵性菌株，葡萄糖代谢时不产生气体。本菌株的发酵条件为：mrs液体培养基：蛋白胨，10.0g；牛肉膏，10.0g；酵母浸粉，5.0g；葡萄糖，20.0g；磷酸氢二钾，5.0g；柠檬酸氢二铵，2.0g；乙酸钠，5.0g；七水合硫酸镁，0.5g；四水合硫酸锰，0.2g；吐温80，1.0g；琼脂15.0g；蒸馏水1000ml。调整ph至6.2～6.4之间，121℃灭菌15分钟。l.paracaseiet-22为微好氧菌，兼性厌氧环境生长较佳，产乳酸，具有耐酸性，可耐受ph值2.5的酸性环境及耐0.4％的胆盐环境4小时，嗜中温菌，生长温度范围在15～45℃，最适生长温度在37℃左右。实施例2将各菌株按照如下重量复配成组合物：乳双歧杆菌bl-991kg(活菌数109cfu/g)，副干酪乳杆菌k561kg(活菌数109cfu/g)，副干酪乳杆菌et-221kg(活菌数109cfu/g)。以实施例2制得的组合物为样品，进行以下实验：1.实验目的研究以断奶大鼠和小鼠为模型动物，旨在评估3株益生菌(bl-99、k56、et-22)及其组合对断奶鼠对饲料营养成分的消化吸收功效的影响，重点研究益生菌干预对食物摄入、食物消化及消化道组织结构的影响。2.实验方法2.1动物饲养和分组60只断奶大鼠饲养于屏障系统动物房中，温度22℃，湿度10-60％，12小时明暗交替照明，由大小鼠维持饲料喂养(饲料配方由北京科奥协力饲料有限公司提供)，适应性喂养1周，自由饮水。适应性喂养1周后，将实验动物随机分成5组，每组12只，进入正式实验。各组喂饲维持饲料，具体分组见表3。表3实验分组72只21周断奶雄性icr小鼠饲养于屏障系统动物房中，温度22℃，湿度10-60％，12小时明暗交替照明，小鼠维持饲料喂养(饲料配方由北京科奥协力饲料有限公司提供)，自由饮水。适应性喂养1周后，将实验动物随机分成6组，每组12只，进入正式实验。模型对照组和2-5组灌胃给予复方地芬诺酯(5mg/kgbw)，空白对照组给蒸馏水，具体分组见表4。表4小鼠实验分组2.2灌胃样品准备与干预在每日灌胃之前配置，分别将事先按照各实验组益生菌的种类和含量分装好的菌粉溶解在10ml生理盐水中备用。每只实验动物灌胃0.5ml，每天上午灌胃一次，连续给予35天。对照组灌胃0.5ml生理盐水。2.3体重、体重增重、摄食量和食物利用率动物初始体重、实验结束时空腹体重，干预期内每周测1次体重(实验期共测5次)。记录饲料摄入量、观察大鼠状态。计算体重增重、食物利用率、蛋白质表观消化率、蛋白质利用率(蛋白质功效比值，per)。2.4屠宰相关指标实验结束后，禁食24h，自由饮水，采用乙醚麻醉大鼠幽门结扎法收集2h内排出的胃液，之后对全部动物屠宰取样。包括小肠(测定肠液酶)及大肠内容物，小肠(空肠、回肠)、前段大肠、后段大肠组织，全部脏器(肝、肾、脾、胰)。进行如下指标检测：胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活性，大小肠切片染色并进行形态观察，包括肠绒毛高度、粘膜隐窝深度、小肠吸收面积、肠绒毛表面光滑度、肠壁厚度及通透性。2.4.1消化酶类的检测采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒分别检测胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶的活性，按照试剂盒的说明书进行操作。(1)胰蛋白酶的测定方法：取出大鼠的肠液后，于4℃冰箱暂存备用。胰蛋白酶的测定按照试剂盒的步骤进行。将两个5ml的离心管标为空白管和测定管，先分别向两个离心管中加入1.5ml胰蛋白酶底物应用液，于37℃条件下预热5min，然后空白管中加入50μl样本匀浆介质，而测定管中加入50μl肠液，分别快速混匀，并计时，迅速倒入石英比色皿中，30s时使用紫外分光光度计于253nm处测定其吸光度值(用双蒸水调零)，记为a1；将溶液倒入原试管中置于37℃孵育20min，再迅速倒入石英比色皿中，20.5min时使用紫外分光光度计于253nm处测定其吸光度值，记为a2。计算公式如下：(2)胃蛋白酶的测定方法：取出大鼠的胃液，做适度稀释后，于4℃冰箱暂存备用。胃蛋白酶的测定按照试剂盒的步骤进行。先进行酶促反应，将两个1.5ml的离心管标为空对照管和测定管，先分别向两个离心管中加入0.04ml稀释后的胃液，于37℃条件下预热2min后，对照管中加入0.4ml试剂一和0.2ml试剂二，测定管中加0.2ml试剂二，充分混匀后，37℃孵育10min后，测定管中加入0.4ml试剂一，充分混匀，37℃孵育10min，3500r/min离心10min，取上清0.3ml进行显色反应。取4个5ml的离心管，分别标为对照管、测定管、标准管和空白管，对照管和测定管中加入0.3ml上清，标准管中加入0.3ml标准品应用液(50μg/ml)，空白管中加入0.3ml标准品稀释液，然后四个管中分别加入1.5ml的试剂三和0.3ml的试剂四，充分混匀，37℃孵育20min，用可见光分光光度计于660nm处测定各管的吸光度值(蒸馏水调零)。计算公式如下：(3)α-淀粉酶的测定方法：取出大鼠的肠液，做适度稀释后，于4℃冰箱暂存备用。α-淀粉酶的测定按照试剂盒的步骤进行。将两个5ml的离心管标为空白管和测定管，分别向两个离心管中加入0.5ml底物缓冲液，测定管中再加入0.1ml稀释后的肠液，混匀，于37℃下孵育7.5分钟后，空白管和测定管中再分别加入0.5ml碘应用液，空白管加入3.1ml双蒸水，测定管中加入3ml双蒸水，再次混匀，用可见光分光光度计于660nm处测定两管的吸光度值(双蒸水调零)。计算公式如下：2.4.2组织形态学指标的检测取大小肠切片染色并采用软件image-proplus6.0进行形态观察，包括肠绒毛高度、粘膜隐窝深度、肠绒毛表面光滑度、肠壁厚度。2.5小肠运动试验第30天干预结束后进行小肠运动实验，实验前禁食16h，自由饮水。于测定当天给予受试样品，30min后模型对照组和各实验组均灌胃复方地芬诺酯(0.025％)，空白对照组灌胃同体积蒸馏水。给复方地芬诺酯30min后，各组灌胃墨汁(含5％的活性炭粉、10％阿拉伯树胶)。给墨汁25min后颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管。将小肠拉成直线，测量肠管长度作为“小肠总长度”，从幽门至炭末前沿的距离作为“炭末在肠内推进距离”，按下式计算炭末推进百分率。墨汁推进率＝墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)×100％2.6数据分析和结果判定除特别注明外，实验结果以均值±标准偏差来进行表示。采用spss16.0软件对实验数据进行统计学分析，首先采用单因素方差分析对数据进行齐次检验，随后各组数据间的比较采用单因素方差分析(one-wayanova)中duncan's法进行分析，显著性水平设定为p<0.05。3.实验结果3.1益生菌对大鼠摄食量的影响表5益生菌对大鼠摄食量的影响处理组平均总饲料摄入量(g)对照782.94bl-99804.16k56790.32et-22796.62组合物839.25表6益生菌对代谢试验中大鼠蛋白质表观消化率的影响处理组蛋白质表观消化率(％)对照72.77±2.67abl-9971.13±3.71ak5670.90±4.24aet-2271.60±7.04a组合物68.19±1.18a注：同一列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)由表5和表6可知，同剂量益生菌组合物与单株菌相比，提高了大鼠摄食量的同时，其蛋白质表观消化率无明显差异。3.2益生菌对大鼠胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶的影响按照2.4.1方法计，与对照组比，益生菌组保持了胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶的活力，统计学上差异不显著。3.3益生菌对大鼠肠道组织形态学的影响表7益生菌对大鼠肠道组织形态学的影响*与对照组比较p<0.05由表7可知，与对照组和同剂量单株益生菌相比，益生菌组合物显著增加了空肠绒毛高度、加深回肠隐窝深度，一定程度加深了结肠隐窝深度，从而增加空肠吸收面积、改善了肠组织形态和功能，起到更好的促消化功能。3.4益生菌对小鼠肠道运动性的影响表8益生菌对小鼠肠道运动性的影响组别对照bl-99k56et-22组合物模型组墨汁推进率(％)0.72±0.05*0.64±0.080.65±0.07*0.69±0.15*0.73±0.09*0.55±0.06*与模型组比较p<0.05由表8可知，同模型对照组相比，给饲益生菌可以不同程度地促进肠运动加快，益生菌组合物的墨汁推进率高于同剂量单株益生菌组，可以使小鼠肠道运动性恢复至空白对照组水平。当前第1页1 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