一种肝脏干细胞的分离培养方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其是一种肝脏干细胞的分离培养方法。
背景技术：
：干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的原始未分化细胞，处于未定向分化状态并具有增殖能力。在特定条件下，干细胞可分化成不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的成熟细胞。肝脏干细胞可以转化为新的肝脏细胞，对于严重的肝脏疾病有着非常好的治疗前景。由于肝脏干细胞含量极少，现有技术中对于肝脏细胞的分离培养成功率较低，在实验室中通常需要多次分离培养才能获得足够的肝脏干细胞。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种肝脏干细胞的分离培养方法，能够解决现有技术的不足，提高了肝脏干细胞分离培养的成功率。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。一种肝脏干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：a、向离体肝脏注入3～5℃的保存液，使肝脏在30min内温度降低至15℃一下；b、使用缓冲液对肝脏进行冲洗20～30min；c、向肝脏开放注入灌流液，灌流液的温度为37℃，注入流速为200～300ml/min，持续2～3min；d、使用胶原酶溶液对肝脏进行浸泡消化45～60min；e、使用清洗液对肝脏进行清洗，获得肝脏干细胞悬液，离心获得肝脏干细胞；f、将获得的肝脏干细胞接入培养液进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24～36h。作为优选，步骤a中，保存液采用uw液。作为优选，步骤b中，缓冲液包括以下组分，0.35wt%的kcl、0.1wt%的cacl2、0.55wt%的nahco3、0.15wt%的na2hpo4·2h2o，余量为水。作为优选，步骤c中，灌流液包括以下组分，0.03wt%的kcl、0.01wt%的庆大霉素、0.02wt%的青霉素、0.05wt%的hepes、0.75wt%的nacl，余量为水。作为优选，步骤d中，胶原酶溶液包括以下组分，0.3wt%的ⅱ型胶原酶、0.1wt%的kh2po4、0.05wt%的mgso4·7h2o、1.5wt%的葡萄糖，余量为水；配置完成后，通过添加柠檬酸使胶原酶溶液的ph值达到6.5～6.8。作为优选，步骤e中，清洗液包括以下组分，0.55wt%的kh2po4、0.15wt%的mgcl2、2.5wt%的双抗、0.05wt%的hepes，余量为水。作为优选，步骤f中，培养液包括以下组分，0.1wt%的地塞米松、0.05wt%的尼克酰胺、0.85wt%的d半乳糖、0.03wt%的双抗、0.25wt%的胰岛素，余量为ultroserg培养液。采用上述技术方案所带来的有益效果在于：本发明通过改进灌流操作工艺，采用“低浓度、大流量”的灌流方法，可以有效提高肝细胞的活性，然后通过酸性胶原酶溶液的消化处理，可以对肝脏干细胞进行有效分离，以达到提高干细胞培养成功率的目的。附图说明图1是实施例1中肝脏干细胞培养后的显微镜下细胞状态的照片。图2是实施例2中肝脏干细胞培养后的显微镜下细胞状态的照片。图3是实施例3中肝脏干细胞培养后的显微镜下细胞状态的照片。具体实施方式实施例1一种肝脏干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：a、向离体肝脏注入5℃的保存液，使肝脏在30min内温度降低至15℃一下；b、使用缓冲液对肝脏进行冲洗20min；c、向肝脏开放注入灌流液，灌流液的温度为37℃，注入流速为270ml/min，持续3min；d、使用胶原酶溶液对肝脏进行浸泡消化50min；e、使用清洗液对肝脏进行清洗，获得肝脏干细胞悬液，离心获得肝脏干细胞；f、将获得的肝脏干细胞接入培养液进行培养，培养温度为37℃，培养时间为30h。步骤a中，保存液采用uw液。步骤b中，缓冲液包括以下组分，0.35wt%的kcl、0.1wt%的cacl2、0.55wt%的nahco3、0.15wt%的na2hpo4·2h2o，余量为水。步骤c中，灌流液包括以下组分，0.03wt%的kcl、0.01wt%的庆大霉素、0.02wt%的青霉素、0.05wt%的hepes、0.75wt%的nacl，余量为水。步骤d中，胶原酶溶液包括以下组分，0.3wt%的ⅱ型胶原酶、0.1wt%的kh2po4、0.05wt%的mgso4·7h2o、1.5wt%的葡萄糖，余量为水；配置完成后，通过添加柠檬酸使胶原酶溶液的ph值达到6.7。步骤e中，清洗液包括以下组分，0.55wt%的kh2po4、0.15wt%的mgcl2、2.5wt%的双抗、0.05wt%的hepes，余量为水。步骤f中，培养液包括以下组分，0.1wt%的地塞米松、0.05wt%的尼克酰胺、0.85wt%的d半乳糖、0.03wt%的双抗、0.25wt%的胰岛素，余量为ultroserg培养液。实施例2本实施例是在实施例1的基础上改进而来，在灌流液中，加入0.01wt%的丁二胺和0.03wt%的异甘草酸镁。通过改进灌流液的配方，可以有效提高肝脏干细胞的增殖。实施例3本实施例是在实施例2的基础上改进而来的，在胶原酶溶液内加入0.1wt%的谷胱甘肽和0.03wt%的大豆苷元。通过改进胶原酶溶液的配方，可以在消化处理过程中，减少对于干细胞的损失。使用小白鼠的肝脏依照上述三个实施例进行干细胞的分离培养实验，得到的肝脏干细胞的纯度如下表所示：组别纯度（%）实施例184.1实施例289.6实施例395.9附图1-3分别为实施例1-3培养出的肝脏干细胞的显微镜下照片，有照片可以看出，使用本发明分离培养的肝脏干细胞结构清晰、完整、形态正常。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页1 2 3