一种水稻稻瘟病抗性基因Pi-kf2(t)的特异性分子标记引物及应用的制作方法

本发明涉及水稻遗传育种和分子生物学技术领域，尤其是指一种水稻稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的特异性分子标记引物及应用。

背景技术：

由真菌magnaportheoryzae引起的稻瘟病是水稻最具有毁灭性的病害之一，发生在全国乃至全世界各个稻区，对水稻的种植和生产造成了严重的影响（valentandchumley,1991），当前，防治稻瘟病的一般策略是化学防治和培育抗性品种。化学防治虽然可发挥一定的作用，但往往造成农民种粮成本提高，并且在多次使用后药效会大幅降低，同时会造成环境的污染，对人类有潜在的危害。选育和种植抗性品种是防治稻瘟病最经济、有效和安全的措施，也符合人类对绿色食品的要求。同时由于稻瘟病病菌生理小种变异频繁以及不同水稻品种对不同的生理小种具有很强的专一性，导致有些单一的抗病品种在3-5年后逐渐丧失抗病特性(kiyosawa1989;yinetal.2011)，因此挖掘和利用广谱抗性基因成为选育具有持久抗稻瘟病特性水稻品种最经济有效的方法，同时在生态安全和环境保护方面也具有重要价值(huaetal.2015;hulbertetal.2001;jeungetal.2007)。目前已经报道从不同的水稻品种中分离得到至少有80多个抗稻瘟病主效基因，其中20多个基因已经被成功克隆，但具有广谱抗稻瘟病特性的基因很少。且目前报道的大部分抗稻瘟病基因都以基因簇的形式分布在水稻不同的染色体区域，最大的3个基因簇分别位于水稻的第6、11和12号染色体上。在第6号染色体上，至少有10多个抗病基因成簇的分布在近着丝粒的短臂端，其中pi2、pi9、piz-t、pi50和pigm已经被成功克隆(zhouetal.1996;quetal.2002;suetal.2015;dengetal.2017)。

稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)是从三明市农业科学研究院自主选育的水稻新品种康丰b中鉴定得到的，位于pi2/pi9等位基因座位上，已于本申请人在2019年04月30日提交的多个申请文件中公开，如一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用（申请号cn201910362959.2）、一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的制备方法（申请号cn201910362960.5）、一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用（申请号cn201910362972.8），

其前期研究通过一系列的特异性标记鉴定和扩增测序分析发现康丰b所含的稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)和pi2/pi9位点上的其他等位基因之间存在明显差异，推断为pi2/pi9基因家族中一个新的稻瘟病抗性基因(weietal.2019)。同时研究表明康丰b对来自全国各个地区的53个稻瘟病菌系均表现为抗性，其所含的抗病基因pi-kf2(t)具有明显的广谱抗稻瘟病特性(weietal.2014)。目前，抗稻瘟病分子标记辅助育种主要利用与抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，虽然可大大提高育种效率，但往往也存在分子标记与抗病基因连锁不够紧密，存在一定的遗传距离而导致辅助选择失败的情况。而利用抗病基因内部结构序列建立的与稻瘟病抗性基因完全共分离的特异性基因标签，则能让辅助选择理论上达到100%的准确性。

稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)是具有广谱特性的抗病基因，但目前尚未有基因内部特异性标记开发应用的报道。前期只有报道与之紧密连锁的分子标记indel-19，indel-25和indel-27，但与pi-kf2(t)均存在一定的遗传距离，选择效率无法达到100%。因此，利用抗病基因pi-kf2(t)内部序列结构开发其特异性的分子标记，对水稻稻瘟病抗性分子标记辅选择助育种及多个抗病基因的聚合育种具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明提供一种水稻稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的特异性分子标记引物及应用，其主要目的在于克服现如今抗稻瘟病分子标记辅助育种存在分子标记与抗病基因连锁不够紧密，存在一定的遗传距离而导致辅助选择失败的情况的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种水稻稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的特异性分子标记引物，包括：

序列表seqidno.1核苷酸序列的引物：spikf-f：agtggaagcatatctctatctct；

序列表seqidno.2核苷酸序列的引物：spikf-r：tcatctcaggttagcatgcg。

一种水稻稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的特异性分子标记引物的应用，应用于水稻抗性育种。

一种鉴定水稻稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的方法，包括以下步骤：

1)提取水稻叶片的基因组dna，并以该基因组dna为模板，采用引物spikf-f和spikf-r对该基因组dna进行pcr扩增；其中，spikf-f：agtggaagcatatctctatctct；spikf-r：tcatctcaggttagcatgcg；

2)对步骤1获得的扩增产物进行8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化，以区分水稻亲本材料及其后代植株是否含有pi-kf2(t)稻瘟病抗性基因，含有稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的水稻基因组dna能扩增出226bp和218bp两条不同分子量大小的特异性条带，含有其他pi2/pi9位点功能抗病基因或不含抗病基因的材料仅能扩增出一条分子量大小为226bp、218bp或208bp的单一条带。

进一步的，所述pcr扩增的反应体系为10μl的体系：5.0μlpcrmastermix，0.5μlspikf-f引物，0.5μlspikf-r引物，0.8μldna模板，3.2μlddh2o。

进一步的，所述pcr扩增的反应程序为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

和现有技术相比，本发明产生的有益效果在于:

1、本发明开发获得的特异性分子标记引物spikf-f和spikf-r是第一个针对水稻稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)内部序列结构开发设计的特异性分子标记。

2、采用本发明，能准确判断水稻育种材料中是否含有pi-kf2(t)基因，而以往的连锁标记判断存在假阳性。

3、采用本发明，pcr扩增后，通过8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测，使用方法简单，效率高，降低了育种成本。

4、采用本发明，在苗期即可对水稻育种材料是否含有稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)进行准确高效的鉴定，有效解决了常规育种方法中存在的育种周期长、选择效率低、鉴定不准确和易受环境影响等问题。

5、采用本发明，可明显加快育种进程，选择效率理论上达到100%的准确性，在实际应用中，检测一个含有pi-kf2(t)基因的f2分离群体，抗性和基因型表现完全一致，选择效率达到100%，可以在水稻分子标记辅助选择育种中发挥重要作用。

附图说明

图1为本发明中的特异性引物spikf-f和spikf-r对13个水稻品种基因组dna扩增检测。其中，1：康丰b(pi-kf2(t))；2：75-1-127(pi9)；3：c101a51(pi2)；4：华占(pi2)；5：irblzt-t(piz-t)；6：明恢86(piz-t)；7：ebz(pi50)；8：谷梅4号(pigm)；9：谷梅2号(pi26)；10：lth；11：日本晴；12：9311；13：93-11；m：100bpladdermarker。

图2为本发明中的特异性引物spikf-f和spikf-r对30个f2单株基因组dna扩增检测。其中，p1：康丰b；p2：lth；1-30：康丰b和lth杂交的f2单株（其中1,2,4,5,7,8,10,15,17,18,19,21,22,25,26,27,28,30单株田间对稻瘟病叶瘟表现为抗(r)，3,6,9,11,12,13,14,16,20,23,24,29单株田间对稻瘟病叶瘟表现为感(s)）。

具体实施方式

下面参照附图说明本发明的具体实施方式。

本发明中所用的13个水稻品种，包括含有pi2/pi9等位抗性基因的水稻抗病材料康丰b(pi-kf2(t)),75-1-127(pi9),c101a51(pi2),华占(pi2),irblzt-t(piz-t),明恢86(piz-t),谷梅2号(pi26),ebz(pi50),谷梅4号(pigm)以及感病品种日本晴，lth，9311和93-11，来源于三明市农业科学研究院、广东省农业科学院和福建省农业科学院水稻研究所。

一种水稻稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的特异性分子标记引物，包括：spikf-f引物和spikf-r引物，spikf-f引物为序列列表seqidno.1核苷酸序列的引物；spikf-r引物为seqidno.2核苷酸序列的引物，具体如下所示：

spikf-f：agtggaagcatatctctatctct；

spikf-r：tcatctcaggttagcatgcg。

上述水稻稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的特异性分子标记引物能够应用于水稻抗性育种。

参照图1。一种鉴定水稻稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的方法，包括以下步骤：

1)提取水稻叶片的基因组dna，并以该基因组dna为模板，采用引物spikf-f和spikf-r对该基因组dna进行pcr扩增；其中，spikf-f：agtggaagcatatctctatctct；spikf-r：tcatctcaggttagcatgcg；

2)对步骤1获得的扩增产物进行8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化，120v恒压电泳60min，并用核酸染料（ultragelred）染色后在凝胶成像系统中观察拍照，13个水稻品种通过本发明开发的特异性引物扩增检测后的电泳结果如图1所示。以区分水稻亲本材料及其后代植株是否含有pi-kf2(t)稻瘟病抗性基因，含有稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的水稻基因组dna能扩增出226bp和218bp两条不同分子量大小的特异性条带，含有其他pi2/pi9位点功能抗病基因或不含抗病基因的材料仅能扩增出一条分子量大小为226bp、218bp或208bp的单一条带。

具体而言，pcr扩增的反应体系为10μl的体系：5.0μlpcrmastermix，0.5μlspikf-f引物，0.5μlspikf-r引物，0.8μldna模板，3.2μlddh2o。

pcr扩增的反应程序为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

如图1所示，为pi-kf2(t)特异性专用引物组合spikf-f和spikf-r对13个水稻品种，包括含有pi2/pi9等位抗性基因的水稻抗病材料康丰b(pi-kf2(t)),75-1-127(pi9),c101a51(pi2),华占(pi2),irblzt-t(piz-t),明恢86(piz-t),谷梅2号(pi26),ebz(pi50),谷梅4号(pigm)以及感病品种日本晴，lth，9311，93-11的检测，其中含有抗病基因pi-kf2(t)的水稻品种康丰b能检测到226bp和218bp大小的两条特异性条带，而含有pi2/pi9位点其他等位抗病基因的抗病材料或感病品种只能检测到一条226bp（c101a51、华占、irblzt-t、明恢86、ebz、9311、93-11）、218bp（谷梅4号、谷梅2号、lth、日本晴）或208bp（75-1-127）大小的单一条带。说明本发明设计开发的专用引物组合spikf-f和spikf-r对稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)具有明显的特异性。

参照图2。准确性测定实验如下：

（1）水稻材料

水稻抗稻瘟病品种康丰b(pi-kf2(t))和感病品种丽江新团黑谷（lth），以及以两品种为亲本杂交获得f1，f1自交后获得f2分离群体，共142个单株。

（2）水稻叶片基因组dna提取

采用改良的ctab法提取两亲本、f1及142个f2单株苗期叶片基因组dna。

（3）pcr扩增

pcr扩增的反应体系为10μl的体系，包括：5.0μlpcrmastermix，0.5μlspikf-f引物，0.5μlspikf-r引物，0.8μldna模板，3.2μlddh2o。

pcr扩增的反应程序为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。扩增产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离纯化，120v恒压电泳60min，并用核酸染料（ultragelred）染色，通过凝胶成像系统拍照观察。

（4）抗性调查

筛选致病性稳定、产孢好的稻瘟病菌株对两亲本、f1及142个f2单株进行喷雾接种，接种后放入24-26℃恒温培养箱暗培养24h，相对湿度95-100%，然后移入25℃温室内培养8-10天，待感病材料出现典型病斑时进行抗病和感病特性调查和统计分析。有稻瘟病典型病斑的记为s，无典型病斑的记为r。

（5）结果与分析

调查结果，水稻品种康丰b未出现典型稻瘟病病斑，表现为抗（r），丽江新团黑谷（lth）出现了典型病斑，表现为感（s），142个f2单株中，有105个单株表现为抗（r），37个单株表现为感（s），r：s分离比符合孟德尔单基因控制分离比3:1。通过本发明开发的特异性分子标记组合spikf-f引物和spikf-r引物对142个f2单株进行基因型分析，其中105个抗性单株均能扩增出226bp和218pb大小的两条特异性条带，而37个感病单株仅能扩增出一条218bp大小的单一条带。如图2所示为其中30个f2水稻单株叶片dna样品的凝胶电泳检测图，图中有两条带的单株对稻瘟病叶瘟表现为抗（r），仅有一条带的单株对稻瘟病叶瘟表现为感（s）。说明本发明开发的特异性分子标记spikf-f/spikf-r组合能100%准确跟踪稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)。

上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

序列表

<110>三明市农业科学研究院

<120>一种水稻稻瘟病抗性基因pi-kf2(t)的特异性分子标记引物及应用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>spikf-f

<400>1

agtggaagcatatctctatctct

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>spikf-r

<400>2

tcatctcaggttagcatgcg