本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种阿卡波糖的发酵方法。
背景技术：
阿卡波糖是一种糖苷酶抑制剂，在治疗ii型糖尿病方面有着广泛的应用。另外，阿卡波糖还可以帮助糖尿病患者改善血脂代谢、有效控制血压、有效改善胃、肠道功能。阿卡波糖1990年最先在德国上市，1995年9月获得美国fda批准上市。
阿卡波糖的分子式为c25h43no18，阿卡波糖的分子结构如下式所示。从结构上看，阿卡波糖是由氨基环醇、4-氨基-4,6-二脱氧葡萄糖和一分子麦芽糖三部分组成。
阿卡波糖生物合成途径研究表明，形成一分子的阿卡波糖，理论上需要2分子的葡萄糖和一分子的麦芽糖。研究表明，葡萄糖最利于菌体的生长，但是对阿卡波糖的合成有显著抑制作用，而麦芽糖最利于阿卡波糖的合成。在发酵过程中必须严格控制葡萄糖的含量并保持麦芽糖在发酵液中的高浓度来提高阿卡波糖的合成率。因此，阿卡波糖的生物合成与发酵培养基中碳源的种类及比例有着密切的关系；与发酵过程中的控糖策略有密切的关系。由于菌种的差异以及发酵培养基成分的差异，发酵过程中糖的控制策略也不同。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能有效提高阿卡波糖产量的发酵方法。
本发明提供了一种阿卡波糖的发酵方法，包括以下步骤：
将游动放线菌菌种接种于初始发酵培养基中进行发酵培养，所述初始发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/l、麦芽糖浆40g/l、棉籽饼粉20g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钙1g/l、谷氨酸钠2g/l、三氯化铁0.5g/l、碳酸钙2.5g/l和泡敌0.5g/l；所述发酵培养基的ph值为6.8～7.2；
当发酵液中葡萄糖浓度降至3～10g/l时流加葡萄糖溶液，使控制发酵液中葡萄糖含量保持在3～10g/l；当发酵液中菌体体积浓度达到25％～30％时，分4～5次补加麦芽糖浆溶液，每次补加使发酵液中麦芽糖浆浓度增加10～30g/l。
优选的，所述葡萄糖溶液的质量浓度为30％～50％。
优选的，所述麦芽糖浆溶液的质量浓度为30％～50％。
优选的，麦芽糖浆溶液的4～5次补加时间间隔为20～25h。
优选的，麦芽糖浆溶液的首次补加时间为发酵培养进行24～32h。
优选的，所述发酵培养的温度为26～30℃。
优选的，所述发酵培养的时间为100～144h。
优选的，所述游动放线菌菌种的接种量为5～20％。
本发明提供了一种阿卡波糖的发酵方法，通过控制初始发酵液中葡萄糖和麦芽糖浆的浓度分别为15g/l和40g/l，并在发酵过程中根据葡萄糖的含量和菌体浓度适时补加葡萄糖和麦芽糖，具体葡萄糖浓度降至3～10g/l时开始流加葡萄糖溶液，当菌体体积浓度达到25％～30％时流加麦芽糖浆溶液使每次补入后麦芽糖浆溶液浓度增加10～30g/l，严格控制发酵液的渗透压从而提高了阿卡波糖的产量。实验证明，采用本发明提供的不同发酵方法生产的阿卡波糖，发酵单位达4319～4484μg/ml。
具体实施方式
本发明提供了一种阿卡波糖的发酵方法，包括以下步骤：
将游动放线菌菌种接种于初始发酵培养基中进行发酵培养，所述初始发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/l、麦芽糖浆40g/l、棉籽饼粉20g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钙1g/l、谷氨酸钠2g/l、三氯化铁0.5g/l、碳酸钙2.5g/l和泡敌0.5g/l；所述发酵培养基的ph值为6.8～7.2；
当发酵液中葡萄糖浓度降至3～10g/l时流加葡萄糖溶液，控制发酵液中葡萄糖含量保持在3～10g/l；当发酵液中菌体体积浓度达到25％～30％时，分4～5次补加麦芽糖浆溶液，每次补加使发酵液中麦芽糖浆浓度增加10～30g/l。
在本发明中，所述游动放线菌(actinoplanesutahensis)的菌株没有特殊限制，采用本领域所熟知的游动放线菌的菌株即可。所述游动放线菌菌种的制备方法，优选包括以下步骤：将保藏的甘油管游动放线菌种子按2％的接种量接种摇瓶培养基中，在28℃，200rpm，培养36h，然后以2％的接种量接入一级种子培养基中28℃培养48h，得到游动放线菌菌种；所述摇瓶培养基和一级种子培养基分别包括以下质量浓度的组分：葡萄糖10g/l、棉籽饼粉20g/l、甘油20g/l、碳酸钙20g/l和泡敌5g/l。
在本发明中，所述游动放线菌菌种的接种量优选为5～20％，更优选为10％～15％。本发明对所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的接种方法即可。所述发酵培养的温度优选为26～30℃，更优选为27～28℃。所述发酵培养的时间优选为100～144h，更优选为110～135h。所述发酵培养的溶氧优选在30％以上，更优选为40％～60％。
在本发明中，根据发酵液中葡萄糖含量和菌体浓度补加葡萄糖溶液和麦芽糖浆溶液。所述葡萄糖溶液的质量浓度为30％～50％，更优选为40％。所述麦芽糖浆溶液的质量浓度优选为30％～50％，更优选为40％。麦芽糖浆溶液的4～5次补加时间间隔为20～25h。麦芽糖浆溶液的首次补加时间为发酵培养进行24～32h。补加葡萄糖溶液和麦芽糖浆溶液有利于减少初始发酵对菌体生长的抑制和对阿卡波糖的合成的抑制。本发明严格控制葡萄糖流加的时机为发酵液中葡萄糖浓度降至3～10g/l则开始流加葡萄糖溶液，同时菌体体积浓度达到25～30％，流加麦芽糖浆溶液有利于提高发酵液中碳源的含量，同时控制发酵液的渗透压，有利于提高阿卡波糖的产量。
下面结合实施例对本发明提供的一种阿卡波糖的发酵方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取保藏的甘油管游动放线菌种子按2％的接种量接种至摇瓶培养基中在28℃，200rpm进行活化培养36h，然后将得到的活化种子以2％的接种量接入一级种子罐，一级种子罐中培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖10g/l、棉籽饼粉20g/l、甘油20g/l、碳酸钙20g/l和泡敌5g/l，在28℃培养48h后，将得到一级种子以10％的接种量接入二级种子罐，二级种子罐包括以下质量浓度的组分：葡萄糖10g/l、麦芽糖浆5g/l、棉籽饼粉20g/l、甘油20g/l、碳酸钙20g/l和泡敌5g/l，在28℃培养22h后，得到二级菌种。将所述二级菌种以15％的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/l、麦芽糖浆40g/l、棉籽饼粉20g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钙1g/l、谷氨酸钠2g/l、三氯化铁0.5g/l、碳酸钙2.5g/l和泡敌0.5g/l。在28℃条件下进行发酵培养，当发酵培养基中葡萄糖降至5g/l时开始流加40％浓度的葡萄糖溶液，控制发酵液中葡萄糖含量始终为5g/l，并在发酵的24h、48h、72h、96h分别补入40％浓度的麦芽糖浆溶液，使每次的补入后发酵液中麦芽糖浆的浓度增加25g/l。发酵培养120h。采用高压液相法测定阿卡波糖的产量。测定阿卡波糖的产量达到4319μg/ml。。
实施例2
取保藏的甘油管游动放线菌种子按1％的接种量接种摇瓶培养基中进行活化培养，在28℃培养48h，然后以2％的接种量接入一级种子罐中，一级种子罐中培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖10g/l、棉籽饼粉20g/l、甘油20g/l、碳酸钙20g/l和泡敌5g/l，在28℃培养40h，得到一级种子；将得到的一级种子以10％的接种量接入二级种子罐，二级种子罐包括以下质量浓度的组分：葡萄糖10g/l、麦芽糖浆5g/l、棉籽饼粉20g/l、甘油20g/l、碳酸钙20g/l和泡敌5g/l，在28℃培养28h后，得到二级菌种。
将得到的二级菌种以10％的接种量接入盛有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/l、麦芽糖浆40g/l、棉籽饼粉20g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钙1g/l、谷氨酸钠2g/l、三氯化铁0.5g/l、碳酸钙2.5g/l和泡敌0.5g/l。当发酵培养基中葡萄糖降至3g/l时开始流加30％浓度的葡萄糖溶液，控制发酵液中葡萄糖含量始终为3g/l，并在发酵的32h、56h、80h、104h分别补入30％浓度的麦芽糖浆溶液，使每次补入后的发酵培养基的麦芽糖浆的浓度增加20g/l。发酵27℃培养140h。测定阿卡波糖的产量达到4484μg/ml。
实施例3
取保藏的甘油管游动放线菌种子按1％的接种量接种摇瓶培养基中进行活化培养，在28℃培养40h，得到的活化种子以1％的接种量接入一级种子罐中，一级种子罐中培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖10g/l、棉籽饼粉20g/l、甘油20g/l、碳酸钙20g/l和泡敌5g/l，在28℃培养44h后得到一级种子；将得到的一级种子以15％的接种量接入二级种子罐，二级种子罐中培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖10g/l、麦芽糖浆5g/l、棉籽饼粉20g/l、甘油20g/l、碳酸钙20g/l和泡敌5g/l，在28℃培养24h后，得到二级菌种。
将上述制备的二级菌种以15％的接种量接入盛有发酵培养基的发酵罐，发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/l、麦芽糖浆40g/l、棉籽饼粉20g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钙1g/l、谷氨酸钠2g/l、三氯化铁0.5g/l、碳酸钙2.5g/l和泡敌0.5g/l。当发酵培养基中葡萄糖降至10g/l时开始流加50％浓度的葡萄糖溶液，控制发酵液中葡萄糖含量始终为10g/l，并在发酵的28h、51h、74h、99h、120h分别补入50％浓度的麦芽糖浆溶液，使每次补入后的发酵液中麦芽糖浆的浓度增加15g/l。发酵29℃培养136h。测定阿卡波糖的产量达4378μg/ml。
对比例1
现有技术一般在初始添加全部麦芽糖，然后流加萄萄糖或一定比例的葡萄糖和麦芽糖的混合物。
按照实施例3的方法制备游动放线菌二级菌种，将制备得到的二级菌种以15％的接种量接入盛有发酵培养基的发酵罐，发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/l、麦芽糖浆120g/l、棉籽饼粉20g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钙1g/l、谷氨酸钠2g/l、三氯化铁0.5g/l、碳酸钙2.5g/l和泡敌0.5g/l。发酵29℃培养136h。测定阿卡波糖的产量达1854μg/ml。
对比例2
按照实施例3的方法制备游动放线菌二级菌种，将制备得到的二级菌种以15％的接种量接入盛有发酵培养基的发酵罐，发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/l、麦芽糖浆40g/l、棉籽饼粉20g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钙1g/l、谷氨酸钠2g/l、三氯化铁0.5g/l、碳酸钙2.5g/l和泡敌0.5g/l。当发酵培养基中葡萄糖降至10g/l时开始流加50％浓度的葡萄糖溶液，控制发酵液中葡萄糖含量始终为10g/l，发酵29℃培养136h。测定阿卡波糖的产量达2923μg/ml。
对比例3
按照实施例3的方法制备游动放线菌二级菌种，将制备得到的二级菌种以15％的接种量接入盛有发酵培养基的发酵罐，发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖15g/l、麦芽糖浆40g/l、棉籽饼粉20g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钙1g/l、谷氨酸钠2g/l、三氯化铁0.5g/l、碳酸钙2.5g/l和泡敌0.5g/l。当发酵培养基中葡萄糖降至8g/l时开始流加含30％的葡萄糖与10％麦芽糖浆的混合溶液，控制发酵液中葡萄糖含量始终为8g/l，发酵29℃培养136h。测定阿卡波糖的产量达2754μg/ml。
由上述实施例结果可知，本发明提供的方法在发酵过程中根据葡糖糖的含量和菌体浓度适时补加葡萄糖和麦芽糖，具体葡萄糖浓度降至3～10g/l时开始流加葡萄糖溶液，当菌体体积浓度达到25％～30％流加麦芽糖浆溶液使每次补入后麦芽糖浆溶液浓度增加10～30g/l，严格控制发酵液的渗透压从而提高了阿卡波糖的产量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。