生产α-熊果苷的工程菌及其构建方法和应用

生产
α-熊果苷的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种生产α-熊果苷的工程菌及其构建方法和应用。


背景技术：

2.熊果苷又名熊果素，呈白色针状结晶或粉末。萃取自熊果的叶子，能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成。加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，而且对黑色素细胞不产生毒害性、刺激性、致敏性等副作用，同时还有杀菌、消炎的作用。它是当今流行的最为安全有效的美白原料，主要用于高级化妆品的制备，可配制成护肤霜，祛斑霜、高级珍珠膏等，既能美容护肤，又能消炎、抗刺激性。同时还可制成新型烫伤膏，特点是快速止痛，消炎力强，迅速消除红肿，愈合快，不留疤痕。目前熊果苷在欧美及亚洲国家应用极为广泛，目前知名化妆品如资生堂，高丝，雪肌精等均有熊果苷系列产品。熊果苷的市场售价约300美金/千克。
3.熊果苷存在两种构型，分别为α-熊果苷和β-熊果苷。目前市场销售的均为β-熊果苷，以对羟基苯酚为前体，经过化学合成生产。其中，α-熊果苷的英文名称：α-arbutin，英文别名：4-hydroquinone-alpha-d-glucopyranoside，cas号：84380-01-8，分子式是c
12
h
16
o7，结构式：，分子量：272.25。α-熊果苷的价格是β-熊果苷的8倍左右，美白效果则比β-熊果苷高15倍，目前很少由厂家可以生产。
4.目前α-熊果苷的生物法生产多为通过添加对苯二酚，利用酶催化将其转化为α-熊果苷，例如公告号为cn 106148256 b的发明专利则公开了一种备α-熊果苷的制备方法，该制备方法是以淀粉蔗糖酶催化底物蔗糖和对苯二酚制得。α-熊果苷的现有方法中加入的对苯二酚不但有毒性，而且成本较高，不利于α-熊果苷的工业化生产。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明确有必要提供一种生产α-熊果苷的工程菌及其构建方法和应用，以解决上述问题。
6.所以，本发明的第一个目的是从大量生物或微生物体内能够合成α-熊果苷的酶中筛选出在体外依然具有催化效率的酶来实现α-熊果苷的异源合成。为此，本发明优选了来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的酶的相关基因，通过这些酶的表达，利用简单碳源实现了α-熊果苷的生物合成。
7.本发明的第二个目的在于提供高产α-熊果苷的宿主，通过向原始或改造过的细菌、真菌、酵母中导入一条高效生产α-熊果苷的途径来生物合成α-熊果苷。
8.本发明的第三个目的在于通过抑制竞争途径、模块优化等一系列代谢调控方式来提高α-熊果苷的产量。实验结果表明，在正常条件下，代谢工程改造菌利用麦芽糖、甘油等简单碳源来生产α-熊果苷，能达到73.6
±
9 mg/l的产量，而在经过优化后，利用简单碳源的
dhba），2,5-dhba在龙胆酸脱羧酶（gd）的作用下转化为苯二酚（hq），hq在所述可分解对苯二酚的酶的作用下转化为α-熊果苷，从而实现由麦芽糖和/或甘油从头合成α-熊果苷，所以，本发明提供的上述生产α-熊果苷的工程菌可以实现α-熊果苷的合成过程中避免苯二酚的添加，实现了以麦芽糖和/或甘油为源头完全通过生物酶解的方法合成α-熊果苷，生产成本低，有利于α-熊果苷的工业化生产。
22.进一步，本发明提供的上述生产α-熊果苷的工程菌中敲除了利用麦芽糖的竞争途径中的malq基因，通过抑制竞争途径的方法提高上述工程菌生产α-熊果苷的产量。
23.进一步，本发明提供的上述生产α-熊果苷的工程菌中拷贝质粒过表达作为内源基因的莽草酸激酶(arol)、丙酮酸激酶(ppsa)、转酮酶（tkta）、3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶（arog
fbr
）和异分支酸合成酶（entc），低拷贝质粒过表达作为外源基因的malefgk2，实现通过模块优化的方式提高利用上述工程菌生产α-熊果苷的产量；最终α-熊果苷产量可达到685
±
17 mg/l。
24.因此，通过筛选出在体外具有活性的酶，获得本发明提供的上述生产α-熊果苷的工程菌；以该工程菌为基础，设计出如图1所示的α-熊果苷的生物合成途径，并且利用分子生物学以及代谢调控来优化合成路径，最后对发酵过程中的培养基及培养条件进行系统优化，从而实现以麦芽糖为源头采用生物方法高效合成α-熊果苷。
附图说明
25.图1是本发明实施例提供的生物合成α-熊果苷的路径。
26.图2是本发明实施例3分别利用工程菌bw1、bw2和bw3生产α-熊果苷的发酵结果图。
27.在图3中，图3a为α-熊果苷标品的hplc图，图3b是本发明实施例3利用工程菌bw1发酵培养得到的产物的hplc图。
28.图4是本发明实施例4提供的工程菌bw4生产α-熊果苷的发酵结果图。
29.图5是本发明实施例5采用模块优化方式提供的工程菌bw5、bw6、bw7和bw8分别生产α-熊果苷的发酵结果图。
具体实施方式
30.下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
31.本发明中，对表达质粒的种类没有特殊要求，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至在载体中，之后不再赘述。
32.以下实施实例中，大肠杆菌菌株jcl16，sxl197，trans5α和bl21（de3）均为常用大肠杆菌菌株，均可市售获得，其中trans5α用于载体构建，bl21（de3）用于蛋白表达，bw25113作为发酵用菌株，其中，本发明各实施例中使用的质粒和菌株见后续表1所示。
33.实施例1重组质粒pze
ꢀ-ꢀ
pchb
ꢀ-ꢀ
salabcd
ꢀ-ꢀ
gd
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xgta本实施例提供的重组质粒pze
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pchb
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salabcd
ꢀ-ꢀ
gd
ꢀ–ꢀ
xgta主要是将基因xgta、pchb、salabcd、gd连接至大肠杆菌表达载体pze12-luc获得。
34.本实施例提供的上述重组质粒的构建方法具体包括以下步骤。筛选来源于细菌，
真菌或蛋白质工程改造的编码α-葡萄糖苷酶(xgta）、异分支酸丙酮酸裂解酶（pchb）、邻氨基苯甲酸5-羟化酶（salabcd）和龙胆酸脱羧酶（gd）的基因。通过将编码α-葡萄糖苷酶(xgta）、异分支酸丙酮酸裂解酶（pchb）、邻氨基苯甲酸 5-羟化酶（salabcd）和龙胆酸脱羧酶（gd）的目的基因进行pcr扩增获得目的片段后，接着用合适的酶对目的片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行回收，之后插入到表达质粒pze12-luc（pllaco1, cole ori, luc, amp
r
）上，获得pze
ꢀ-ꢀ
pchb
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salabcd
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gd
ꢀ-ꢀ
xgta重组质粒，该重组质粒含有编码α-葡萄糖苷酶(xgta）、异分支酸丙酮酸裂解酶（pchb）、邻氨基苯甲酸5-羟化酶（salabcd）和龙胆酸脱羧酶（gd）的基因。
35.实施例2生产α-熊果苷的工程菌：重组大肠杆菌bw1、bw2、bw3本发明提供的生产α-熊果苷的工程菌对用于构建表达质粒的宿主菌株种类没有特殊要求，本发明实施例采用了bw25113菌株作为构建质粒的初始宿主。
36.首先挑取新鲜的bw25113菌落接种到4 ml lb培养基中，37℃培养8～12 h后，取1 ml接种到100 ml lb培养基中，37℃培养至od
600
长到0.6时，在4℃的温度下6000 rpm离心10 min收集菌体，用10 ml 10%预冷的甘油洗涤，6000 rpm离心10 min，再次重复甘油洗涤步骤，离心后尽量倒干剩余甘油，最后加入适量10%甘油重悬细胞，制得感受态细胞。取90 μl感受态加入2 μl p重组质粒pze
ꢀ-ꢀ
pchb
ꢀ-ꢀ
salabcd
ꢀ-ꢀ
gd
ꢀ-ꢀ
xgta，冰上放置两分钟，电转后加入600 μl lb培养基，洗出电转后细胞，37 ℃复苏1 h，涂布到氨苄抗性平板,于37℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上长出菌落后，挑菌于含有氨苄抗性的4 ml lb培养基中37℃培养8～10 h，即可获得生产α-熊果苷的工程菌：含有重组质粒pze
ꢀ-ꢀ
pchb
ꢀ-ꢀ
salabcd
ꢀ-ꢀ
gd
ꢀ-ꢀ
xgta的大肠杆菌菌株，用重组大肠杆菌bw1表示。
37.利用上述相同方法构建：含有重组质粒pze
-ꢀ
pchb
ꢀ-ꢀ
salabcd
ꢀ-ꢀ
gd
ꢀ-
heg的大肠杆菌菌株，用bw2表示；含有重组质粒pze
-ꢀ
pchb
ꢀ-ꢀ
salabcd
ꢀ-ꢀ
gd
ꢀ-ꢀ
dgas的大肠杆菌菌株，用bw3表示。
38.实施例3重组大肠杆菌的应用：分别通过重组大肠杆菌bw1、bw2、bw3的发酵培养生产α-熊果苷分别在平板上挑取新鲜的重组大肠杆菌bw1、bw2、bw3工程单菌落接种到4 ml含有相应抗生素的 lb试管中，37℃培养8 h后，转入含有相应抗生素的50 ml培养基的摇瓶中进行发酵培养，接种量为2%发酵温度30℃或37℃，转速200 rpm。其中，所述培养基：2 g
∙
l
‾
1 mops，20 g
∙
l
‾1麦芽糖，10 g
∙
l
‾1甘油，5 g
∙
l
‾1酵母粉，6 g
∙
l
‾
1 nahpo4，0.5 g
∙
l
‾
1 nacl，3 g
∙
l
‾
1 kh2po4，2 g
∙
l
‾
1 nh4cl，246.5 mg
∙
l
‾
1 mgso4，14.7 mg
∙
l
‾
1 cacl2，并根据实际情况加入相应抗生素。
39.发酵初始加入终浓度为0.5 mm的诱导剂iptg，发酵24 h，48 h，60h取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物α-熊果苷的产量，结果如图2所示。从图2中可以看出利用重组大肠杆菌bw1生产α-熊果苷的产量最好，而且该菌株的生长状况最好，所以，相对其它两种菌株，使用xgta酶的重组大肠杆菌bw1生产α-熊果苷的能力最强。
40.采用hplc分析方法对利用工程菌bw1发酵培养得到目标产物α-熊果苷进行检测，检测条件如下：色谱柱：分离柱，diamonsil c18，id 5μm，250
ꢀ×ꢀ
4.6 mm；
流动相：a为甲醇，b为1
‰
三氟乙酸水溶液，柱温40 ℃，流速1 ml/min检测波长为280 nm。梯度洗脱程序如下表所示：时间（min）流动a/%流动相b/%05951510901659520595取样品上述利用工程菌bw1发酵培养得到的发酵液700 μl，过滤膜，取过膜后液体采用上述方法进行hplc分析，分析结果如图3中的图3b所示。采用上述方法取含有α-熊果苷的标品水溶液进行hplc分析，分析结果如图3中的图3a所示，图3a为标准图。从图3a中可以看出：β-熊果苷的特征峰保留时间为5.5 min（5.597min）左右；从图3b中可以看出在5.5 min(5.483min)左右也有一个特征峰，由此可以判断图3b中保留时间为5.461min的特征峰为α-熊果苷，因此，本实施例提供的方法可以制备出α-熊果苷。
41.实施例4生产α-熊果苷的工程菌-重组大肠杆菌bw4、构建方法和应用重组大肠杆菌bw4通过抑制竞争途径获得，具体地，在经过系统的筛选后决定敲除来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的与麦芽糖利用途径竞争的malq，本发明采用red重组的方法敲除malq基因，制备malq敲除菌株。
42.从宿主菌bw25113中敲除malq基因制备生产α-熊果苷的工程菌重组大肠杆菌bw4，即，相对于bw25113，重组大肠杆菌bw4中敲除了malq基因。
43.首先挑取新鲜的bw25113菌落接种到4 ml lb培养基中，37℃培养8-12 h后，取1 ml接种到100 ml lb培养基中，37℃培养至od
600
长到0.6时，在4℃的温度下6000 rpm离心10 min收集菌体，用10 ml 10%预冷的甘油洗涤，6000 rpm离心10 min，再次重复甘油洗涤步骤，离心后尽量倒干剩余甘油，最后加入适量10%甘油重悬细胞，制得感受态细胞。取90 μl感受态加入2 μl pkd46质粒，冰上放置两分钟，电转后加入600 μl lb培养基，洗出电转后细胞，30 ℃复苏1 h，涂布到氨苄抗性平板。之后以pkd4质粒为模板，pcr扩增得到带有同源臂的敲除片段，回收进行纯化。挑取单菌落接入氨苄抗性试管8～12 h后，转接100 ml lb摇瓶培30 ℃培养；od
600
长到0.2后，添加终浓度为100 mm的阿拉伯糖诱导；待摇瓶od
600
d长到0.6时，开始制备电转感受态细胞，取90 μl感受态加入5 μl带同源臂的pcr片段，电转后，37℃复苏90 min，涂布于卡那抗性平板，过夜培养，待细胞长到足够大小，挑取单菌落于加入卡那抗性的试管中，37℃培养8～12 h后进行菌落pcr验证，确保kan片段替换掉目的基因。最后，向上一步正确的菌转入pcp20载体，涂布于氨苄和氯霉素混合的抗性平板中，30℃过夜培养，待细胞长到足够大小，挑取单菌落于加入氨苄和氯霉素混合的抗性的试管中30℃培养8～12h，后转接到无抗性的lb试管中，42℃培养24 h左右进行消除卡那抗性，再划线到无抗性平板，挑取单菌落接种到无抗性lb试管中，再分别转接到无抗性，氨苄抗性，卡那抗性和氨苄和氯霉素混合的抗性试管中，用以验证pkd46、pcp20是否丢失，卡那抗性是否消除。确定在以上两种抗性中均不生长后，保存于冻存管，并进一步菌落pcr验证。此过程得到菌株bwδmalq，该菌株中敲除了malq基因。
44.之后将实施例1构建好的重组质粒pze
ꢀ-ꢀ
pchb
ꢀ-ꢀ
salabcd
ꢀ-ꢀ
gd
ꢀ-ꢀ
xgta参照实施
例2提供的方法转入大肠杆菌bwδmalq中，获得生产α-熊果苷的工程菌：重组大肠杆菌bw4，即，相对于重组大肠杆菌bw1，重组大肠杆菌bw4中敲除了malq基因。
45.参照实施例3，将上述重组大肠杆菌菌株bw4在所述培养基中发酵12h，24 h，48 h后取出部分发酵液，该发酵液可以用以测定菌体生长状况及目标产物α-熊果苷的产量，结果如图4所示。
46.实施例5生产α-熊果苷的工程菌：重组大肠杆菌bw5、bw6、bw7、bw8及其构建方法和应用本实施例提供的重组大肠杆菌菌株bw5、bw6、bw7、bw8主要是进一步通过模块优化方式获得。具体地，将图1所示的α-熊果苷的合成路径分成两个模块，外源基因malefgk2作为模块1，而arol, ppsa, tkta, arog
fbr
, entc大肠杆菌内源基因为模块2。模块1的表达水平用低拷贝质粒优化，本实施例中，采用低拷贝psa74质粒对基因malefgk2进行表达优化，优化后的质粒用psa-malefgk2表示。模块2的表达水平利用中拷贝质粒来优化，本实施例中，采用中拷贝pcs27质粒对上述内源基因进行表达优化，优化后的质粒用pcs-apta表示。将构建好的对应质粒电转到实施例2提供的菌株bw25113（感受态）和实施例4提供的bwδmalq（感受态）中，分别得到了生产α-熊果苷的工程菌：重组大肠杆菌菌株bw5、bw6、bw7、bw8。其中，重组大肠杆菌菌株bw5相当于对于重组大肠杆菌菌株bw1中的内源基因进行了优化，在菌株bw1的基础上转入 pcs-apta质粒；重组大肠杆菌菌株bw6相当于对于重组大肠杆菌菌株bw4中的内源基因进行了优化，在菌株bw4的基础上转入 pcs-apta质粒；重组大肠杆菌菌株bw7相当于对于重组大肠杆菌菌株bw5中的外源基因进行了优化，在菌株bw5的基础上转入 psa-malefgk2质粒；重组大肠杆菌菌株bw8相当于对于重组大肠杆菌菌株bw6中的外源基因进行了优化，在菌株bw6的基础上转入 psa-malefgk2质粒。
47.取适量分别含有上述重组大肠杆菌菌株bw5、bw6、bw7、bw8的菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃过夜培养。挑取平板菌落并接到4 ml的带有相应抗性的液体lb中，37℃下培养一定时间，最后将菌液转接到50 ml的带有相应抗性发酵培养基中，直接加入终浓度0.5 mm的iptg进行诱导，在发酵12h，24 h，48 h后取出部分发酵液用以测定目标产物α-熊果苷的产量，结果图5所示。
48.表1 本发明各实施例中采用的质粒和菌株列表
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。