一种新型沙门氏菌噬菌体库及其应用的制作方法

本发明涉及一种新型沙门氏菌噬菌体库及其应用，属于微生物领域。

背景技术：

沙门氏菌是具有重要公共卫生意义的人兽共患病原菌，沙门氏菌污染食品后增殖是人感染中毒的主要传播途径。目前沙门氏菌病主要依靠抗生素治疗，近二十多年畜牧业迅速发展，抗生素大量使用导致严重而普遍的抗药性，抗生素疗效大大削弱。我国与国际社会一道，积极寻求解决细菌抗药性的新途径。

噬菌体是细菌的特异性病毒，在抗药性日益严重的背景下，噬菌体治疗细菌感染具有巨大的应用潜力。与抗生素相比，噬菌体具有高度专一性，表现为仅感染一种物种，甚至血清型或菌株，这种作用机制的优点是噬菌体只会裂解目标病原菌株，不会导致共生肠道菌群的破坏，更不会感染人和动植物。同时噬菌体具有自我复制、治疗所需剂量小、研发周期短、生产成本低等优势。尽管噬菌体有上述优势，但关于噬菌体治疗的研究也是近十几年才重新受到关注，实际使用噬菌体治疗的也只有少数几个国家，而我国大规模噬菌体研究应用直到近年才开始。

任何生物都是以种群为独立生存的基本单位，在相应的生态位生长、复制、变异和流动，与直接生态因子博弈和适应。因此，生态因子的综合作用是控制生物种群的根本途径。

大量的文献证明用单株的特异性噬菌体防治单一宿主菌感染的可靠性，但是对于大范围不断变化和变异的流行菌群，使用单株噬菌体不能产生长期的保护作用，应该以噬菌体群(噬菌体库)应对。包括对特定菌群采用鸡尾酒疗法，对于更广泛的未知菌群，则需要建立噬菌体库，从中挑选噬菌体或其组合，用于治疗。

技术实现要素：

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种新型沙门氏菌噬菌体库及其应用。本发明针对兽医抗药性监测网(varms)多年抗药性流行病学采样获得的大量养殖场的沙门氏菌菌株，筛选得到了一组沙门氏菌噬菌体，经过全基因组测序分析，剔除携带抗药性和毒素等的有害基因者，建立一种新型的沙门氏菌噬菌体库，专业化针对性的筛选沙门氏菌噬菌体。

一种新型沙门氏菌噬菌体库，包括如下40株沙门氏菌噬菌体：

上述噬菌体vp-sm-001至vp-sm-040的dna序列如seqidno.1至seqidno.40；

seqidno.1：

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seqidno.2：

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seqidno.3：

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seqidno.8

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seqidno.9

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seqidno.10

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seqidno.12

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seqidno.13

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seqidno.14

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seqidno.15

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seqidno.16

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seqidno.17

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seqidno.18

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seqidno.19

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seqidno.20

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seqidno.21

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seqidno.22

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seqidno.23

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seqidno.24

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seqidno.25

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seqidno.26

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seqidno.27

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seqidno.28

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seqidno.29

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seqidno.30

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seqidno.31

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seqidno.32

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seqidno.33

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seqidno.34

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seqidno.35

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seqidno.36

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seqidno.37

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seqidno.38

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seqidno.39

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seqidno.40

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进一步的，上述噬菌体vp-sm-001至vp-sm-040不存在有害基因，所述有害基因为抗药性基因和毒素基因。

进一步的，上述噬菌体库在制备裂解沙门氏菌噬菌体产品中的应用。

进一步的，上述噬菌体库在净化养殖环境中沙门氏菌的应用。

进一步的，上述噬菌体库在针对不同养殖企业的差异性沙门氏菌流行菌株筛选噬菌体组合中的应用。

进一步的，上述噬菌体库在针对不同养殖企业的差异性沙门氏菌流行菌株筛选噬菌体组合中的应用的方法包括如下步骤：

(1)varms定期从不同养殖企业获得病死动物病料，分离沙门氏菌，获得不同企业的差异性流行菌株；

(2)利用权利要求1在所述的噬菌体库中的噬菌体，对步骤(1)中从企业获得的沙门氏菌进行裂解实验，筛选得到高效裂解的噬菌体组合；

(3)将步骤(2)中获得的噬菌体组合应用于企业的沙门氏菌的杀灭。

有益效果：

(1)已有发明以单株噬菌体为主，无法应对未知的沙门氏菌或其菌群；本发明筛选获得多株噬菌体可以建立了沙门氏菌噬菌体库，可以针对流行菌株/菌群动态组合，得到高效裂解的沙门氏菌噬菌体制剂。沙门氏菌噬菌体制剂制备消毒剂，可以使动物肠道中的沙门氏菌减少90％以上，对于雏鸡的沙门氏菌病可以降低75％的死亡率。(2)本发明所有的噬菌体均为裂解性噬菌体，并进行了全基因组测序，确定无抗药性基因和毒素基因等有害基因。(3)本发明中的噬菌体特异性裂解沙门氏菌，不影响正常菌群稳定，雏鸡口服试验表明，该噬菌体库中的噬菌体安全无毒。

附图说明

图1噬菌体斑图片。

图2噬菌体对雏鸡沙门氏菌病的治疗试验结果。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1筛选一组沙门氏菌噬菌体

一、实验步骤

(1)沙门氏菌的分离

利用ss琼脂培养基，一次性接种环探入病料内部(若为内脏等，需先烧烫手术刀清洁表面后划开)，后在培养基上平板划线法分离，置于37℃恒温培养箱培养24h，观察平板上菌落颜色。挑取形态为外缘白色中心黑色的菌落划线接种于lb琼脂培养基上纯化培养，24h后观察菌落形态，若形态单一则接种环刮取平板上菌落，于甘油肉汤中，-20℃保存。

(2)沙门氏菌噬菌体的分离纯化

样品预处理：若为粪样等固体样品，则应取适量掺于sm缓冲液中，振荡2小时后，4000rpm离心15min，用覆有双层滤纸的漏斗过滤上清液于新的容器中，滤液8000rpm、15min离心，用注射器吸取上清液后连接到0.22μm滤器将上清再次过滤到新的50ml洁净离心管中，备用。若样品为沼液或污水，可不需处理；

半固体培养基的制备：加0.6％琼脂粉到lb液体中，加热煮沸，分装于适当大小的玻璃瓶中，121℃灭菌15min；半固体培养基冷却至45～55℃，取3ml于5mlep管中并加入100μl菌液、100μl上述滤液或沼液原液，颠倒混匀后迅速倾倒于固体lb平板上摇晃铺平，超净台中冷却凝固后将培养基倒置于37℃恒温培养箱中培养4～6h，观察结果；若平板上有噬菌斑出现，则挑取单个的较为清透的噬菌斑于sm缓冲液中，静置约4h后再次纯化；重复步骤4～5以纯化噬菌斑，至双层平板上噬菌斑单一为止；

富集：将100μl菌液与100μl的噬菌体加入到液体lb培养基中37℃过夜振荡培养，培养物经8000rpm离心15min并用0.22μm滤膜过滤，得到富集原液，备用；

保存：上述原液与等体积80％甘油混溶，-20℃保存。筛选得到的噬菌体参见图1。

(3)沙门氏菌噬菌体dna测序

蛋白酶k/sds法提取噬菌体dna，构建文库，illuminahiseq平台测序，原始数据解压；组装数据，contig排序，将排序好的文件连接，得到噬菌体基因组。

采用rast网站对噬菌体基因组进行注释。利用geneious软件将上述注释结果添加到基因组上，使结果便于阅读。

二、实验结果

1、获得40株新型沙门氏菌噬菌体，分别为噬菌体vp-sm-001至vp-sm-0

2、噬菌体vp-sm-001至vp-sm-040的dna序列如seqidno.1至seqidno.40

实施例2针对不同养殖企业的差异性沙门氏菌流行菌株筛选噬菌体组合

(1)varms定期从不同养殖企业获得病死动物病料，分离沙门氏菌，获得不同企业的差异性流行菌株；

(2)利用本发明噬菌体库中的噬菌体，对沙门氏菌进行裂解实验，筛选得到高效裂解的噬菌体组合，如表1所示。

表1针对不同企业的噬菌体组合

实施例3制备噬菌体制剂用于沙门氏菌病的防控

选取实施例2中的噬菌体组合分别发酵纯化后，混合，制备成为液体或微囊粉剂，可以与饮水或者混合，使最终效价为10⁶pfu/ml，连续使用3天；也可以对动物和环境喷雾。

aa雏鸡饲养到2日龄，选择健康aa肉鸡200只，笼养，分6组，1组、a组(空白对照组)、b组(噬菌体对照组)、c组(细菌对照组)、d组(噬菌体治疗组1)、e组(噬菌体治疗组2)，每组20只，每笼4只，自由饮食，环境舒适。

从烟台市孵化场死胚随机分离沙门氏菌sa1902，培养得菌液10⁸cfu/ml，用移液器取1、2、3、4ml插入1组肉鸡食管注入，结果表明4ml可导致1组约半数致死。

同样方法用3ml的攻毒其他5组，2小时后用移液器取3、3、1ml的组合噬菌体10⁹pfu/ml，食管灌服b、d、e组，连续观察7天，对雏鸡沙门氏菌的治疗效果见图2。表明噬菌体针对性治疗有确切疗效。

实施例4噬菌体制剂用于养殖环境沙门氏菌的净化

实施例2中的噬菌体组合发酵纯化后，与水混合，使最终效价为10⁶pfu/ml，喷洒于所需净化的环境表面。以孵化场的出雏室为例，喷雾后10小时，敞开血平板培养皿、ss培养皿，5分钟落尘菌落数分别合计降低80％、63％；所有菌落鉴定后表明仅5％为沙门氏菌。