一种苗期快速鉴别水稻野败型雄性不育系和保持系的方法与流程

本发明属于水稻雄性不育系鉴别方法领域，具体涉及一种苗期快速鉴别水稻野败型雄性不育系和保持系的方法。

背景技术：

水稻是最重要的粮食作物之一，世界上约一半人口以稻米为主食，而我国则超过65％的人口以稻米为主食。过去40余年的实践证明，水稻杂种优势的利用是提高水稻单产的有效途径。目前，我国杂交水稻年种植面积约1600万hm²，占水稻种植总面积的53％左右，每年需生产杂交稻种子2.7亿kg。杂交水稻种植面积大，种子需求量巨大，而制种过程中往往出现机械混杂、生物学混杂，加之不法经营者的人为掺杂，导致杂交种的纯度和真实性受到严重影响。

不育系混杂是引起三系杂交水稻退化的主要原因。若不育系中混杂有保持系，由于保持系的自交繁殖，不育系中保持系的含量将成数倍的增加。用混有保持系的不育系进行杂交水稻的制种，杂交后代中将出现大量的不育株，从而影响水稻杂种优势的发挥。由于不育系和保持系是同核异质体，株叶形态几乎完全一致，在水稻未抽穗开花前很难用肉眼进行鉴别。hong等(2002)、ichii等(2003)曾利用rapd引物oap12对野败型不育系珍汕97a和保持系珍汕97b的线粒体dna进行扩增，发现oap12在珍汕97a中可以扩增出一条1600bp的特异性条带，而珍汕97b中并未出现该条带，利用oap12进一步对珍汕97a、珍汕97b、明恢63、汕优63f1和汕优63f2的线粒体dna进行扩增，进一步证实了oap12可以用来区别野败型不育系珍汕97a和保持系珍汕97b。毛加宁等(2002)利用rapd引物s477对珍汕97a和珍汕97b进行扩增，发现该引物在2个材料中均扩增出3条主带，但可利用第二条主带位置的不同来进行不育系和保持系的鉴别。此外，邵启明等(1996)、杨蜀岚等(1998)均利用用rapd技术对汕优系列杂交稻、协优系列杂交稻和其他一些组合及其亲本进行了鉴定和分析，均一致认为rapd技术可以用于三系杂交水稻的品种检验工作。但rapd标记随后并未在品种检验工作推广应用，这可能是由以下两方面的原因造成的：一是rapd标记使用的随机引物较短，退火温度低，重复性和稳定性差；二是不同引物间扩增结果重复性和稳定性相差较大，能够稳定重复的引物相对较少，引物筛选工作量大，短时间很难筛选到合适的引物。本发明在hong等(2002)研究的基础上，对rapd引物opa12在退火温度32℃～35℃条件下扩增的1600bp的dna片段进行酶切、克隆、测序和tail-pcr分析，设计开发稳定再现的能够区分不育细胞质和可育细胞质的scar标记chi03，再利用开发出的scar标记chi03对野败型雄性不育系珍汕97a、珍品a、天丰a及其同核保持系珍汕97b、珍品b和天丰b及其杂交种进行室内分子鉴定和田间表型鉴定的观察比较。结果表明，本发明开发出的scar标记chi03分子鉴定结果与田间表型一致，鉴别准确、可靠，重复性高。此方法的应用对于野败型雄性不育系和保持系的快速鉴定、缩短鉴定周期，提高水稻制种纯度，实现三系杂交水稻的推广应用具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种苗期快速鉴别水稻野败型雄性不育系和保持系的方法，该方法从dna提取、pcr扩增、dna序列分析、tail-pcr分析、室内鉴定、田间观察等各环节进行了详细的介绍，其鉴别的结果准确可靠。通过本方法开发出的scar标记chi03分子鉴定结果与田间表型一致，鉴别结果准确、可靠、重复性高。此方法的应用大大缩短了野败型雄性不育系和恢复系的鉴定周期，对于提高野败型三系杂交水稻的制种纯度及推广应用具有重要意义。

本发明提供了一种苗期快速鉴别水稻野败型雄性不育系和保持系的方法。该方法包括以下步骤：

(1)dna提取：总dna的提取取种植于试验田中40天的单株新鲜嫩叶，线粒体dna的提取取黑暗条件下培养3周的幼苗；

(2)pcr扩增：pcr-rflp扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统中观察结果，将含有1600bp单一条带的扩增产物中加入识别4碱基的限制性内切酶hapⅱ、haeⅲ、accⅱ、hhaⅰ、aluⅰ、rsaⅰ、taqⅰ各0.1ul及与各自内切酶对应的10×缓冲液1ul，灭菌水0.9ul补全到10ul，taqⅰ65℃，其他限制性内切酶37℃条件下，振荡4个小时，充分反应，酶切产物在含有1.5％eb的琼脂糖凝胶上电泳，比较酶切带型；scar分析的扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察扩增结果；

(3)dna序列分析：以野败型雄性不育系和保持系的线粒体dna为模板，进行pcr扩增，将含有1600bp条带的扩增产物切下，用qiaquickgelextractionkit从凝胶中回收dna，用ta克隆法进行克隆，使用2.1vector作为载体、top10f′cells作为大肠杆菌；在2个含有氨苄西林、x-gal、iptg的lb培养皿(平板)上，分别滴下50ul和200ul的含有带重组质粒的大肠杆菌的soc液体培养基，用玻璃棒匀开，37℃，过夜培养；用牙签挑出白色的菌落，经pcr检测确认插入后，用5ml含有氨苄西林的lb培养基37℃振荡培养过夜；从大肠杆菌中提取质粒，用wizardplussvminiprepsdnapurificationsystem进行；每份材料各挑选3个单菌落，通过2种引物同时2个方向的序列反应测定碱基序列；使用aroca公司的lic-4200l2测序仪进行dna测序，用genetix进行碱基序列分析，使用blastn方法对ncbi进行同源性搜索；

(4)tail-pcr分析：以雄性不育系线粒体dna为模板，进行tail-pcr扩增，将得到的产物克隆、测序，确认这些扩增产物含有opa12(f：tcggcgatag，r：tcggcgatag)的复链位置，推测opa12复链位置的准确碱基序列；基于tail-pcr的结果，设计引物chi03(f：gtggcgatagagatgctgag；r；tcggcaataggcacataattaga)，以线粒体dna和总dna为模板，利用野败型雄性不育系和保持系进行pcr扩增。

(5)室内分子鉴定：利用scar标记chi03对野败型雄性不育系和保持系总dna进行室内分子鉴定。

(6)田间鉴定：开花期，每天上午从不育系和保持系单株主茎穗上取上、中、下3个部位已成熟但尚未开花的花药1个，用1％的碘-碘化钾溶液染色，镜检3个视野中的花粉染色情况，根据花粉染色及形态判断其育性，将分子鉴定的结果与花粉染色结果进行比对，以确定开发的scar标记chi03的应用效果。

本发明的鉴别方法中，(1)所用的材料包括水稻野败型雄性不育系珍汕97a、珍品a、天丰a及其保持系珍汕97b、珍品b、天丰b以及恢复系明恢63、汕优63的f1和f2。

本发明的鉴别方法中，(3)和(4)所采用的为珍汕97a和珍汕97b的线粒体dna。

本发明的鉴别方法中，(4)所采用的为1.5％的琼脂糖凝胶电泳。

本发明的方法是一种水稻野败型雄性不育系和保持系鉴别的方法。

三系法杂交水稻：是指由雄性不育系、保持系和恢复系配组所生产出的具有杂种优势的水稻。

细胞质雄性不育系：是指由细胞核纯合隐性育性恢复基因与细胞质不育遗传因子互作形成的雄性不育。

保持系：是指雌雄蕊发育正常，将其花粉授予雄性不育系的雌蕊，不仅可正常结实，而且其后代仍为雄性不育的植株。

恢复系：是指将其花粉授予不育系的雌蕊，使其杂交后代育性恢复的植株。

花粉败育：是指没有经过正常发育、不能起生殖作用的花粉。

圆败：是指圆形、部分染色、无受精能力的花粉。

典败：是指花粉粒发育不健全，形状皱缩不规则，或圆形，无内含物，对碘化钾无染色反应，无受精能力。

线粒体dna：是指线粒体中的遗传物质，是在细胞线粒体内发现的核糖核酸特殊形态。

本发明的鉴别方法在水稻三系育种方面具有以下用途：

1、利用本发明方法在苗期即可对野败型雄性不育系和保持系进行鉴别，相比田间鉴定，大大缩短了鉴定周期，省时省工；

2、利用本发明开发的scar标记chi03可对总dna进行鉴别，相比rapd标记opa12对线粒体dna的检测，操作简单方便，重复性和稳定性显著提高；

3、利用本发明快速鉴别水稻野败型雄性不育系和保持系，对于提高野败型三系杂交水稻的制种纯度，实现三系杂交水稻的推广应用具有重要意义。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种水稻野败型雄性不育系和保持系的苗期鉴别方法。率先将用于苗期鉴别的rapd标记跨越到scar标记，实现了从水稻线粒体dna的检测到总dna的检测，使得分子检测的操作程序更加简单方便、重复性和稳定性得到显著提高；相比于传统的田间鉴定，该方法大大缩短了鉴定周期、省时省工，利用本发明方法不仅大大提高了野败型杂交水稻的制种纯度、满足了种子市场销售和品种授权的需要，更是对三系杂交水稻的推广应用具有重要意义。

附图说明

图1chi03标记在水稻野败型雄性不育珍汕97a、珍品a和天丰a及其对应保持系珍汕97b、珍品b和天丰b总dna的扩增结果；m表示ds^tm5000dnamarker，1、3、5分别表示珍汕97a、珍品a和天丰a的扩增条带，2、4、6分别表示珍汕97b、珍品b和天丰b的扩增结果。

图2chi03标记对珍汕97a、珍汕97b、明恢63及汕优63(珍汕97a/明恢63)f1和f2的扩增结果；m：ds^tm5000dnamarker；1：珍汕97a，2：珍汕97b，3：明恢63，4：汕优63f1，5-13：汕优63f2。

图3chi03标记扩增混有野败型雄性不育系珍汕97a种子的鉴定结果；m：ds^tm5000dnamarker；1、14：珍汕97a，2、15：珍汕97b，3-13、16-26：为检测单株，其中5、8、16和21为保持系，其余均为不育系。

图4籼稻野败型雄性不育系珍汕97a及其保持系珍汕97b花粉染色的表现。实施案例：利用scar标记chi03对3对野败型雄性不育系、保持系、恢复系及其后代的鉴别

1水稻材料：

水稻野败型雄性不育系珍汕97a、珍品a和天丰a，保持系珍汕97b、珍品b和天丰b；恢复系明恢63；杂交后代汕优63(珍汕97a/明恢63)f1和f2。

2试验方法：

2011年正季，将上述材料种植在南京农业大学江浦试验站。5月20日播种，6月20日移栽，单本种植，每一材料种植5行，每行8株，株行距17cm×20cm，常规栽培管理。

取移栽后15天的叶片进行总dna的提取；开花期，每天上午从不育系和保持系单株主茎穗上取上、中、下3个部位已成熟但尚未开花的花药1个，用1％的碘-碘化钾溶液染色，镜检3个视野中的花粉染色情况。

3结果与分析：

3.1利用scar标记chi03对3对野败型雄性不育系和保持系总dna的扩增

利用scar标记chi03，以单株提取的总dna为模板，扩增珍汕97a和珍汕97b、珍品a和珍品b、天丰a和天丰b。结果，引物chi03在珍汕97a、珍品a和天丰a中能稳定地扩增出1600bp的条带，而在珍汕97b、珍品b和天丰b中没有扩增产物出现(图1)。因此，scar标记chi03能作为苗期鉴别水稻野败型细胞质不育系和保持系的分子标记。

3.2利用chi03标记对汕优63组合的亲本及其f1和f2单株总dna的扩增

以汕优63组合的亲本及其f1和f2单株提取的总dna为模板，用开发的scar标记chi03进行扩增，结果在珍汕97a及所有调查的f1和f2单株中都能稳定地扩增出1600bp的条带，而在珍汕97b和明恢63中都没有扩增出目标条带(图2)。

3.3利用scar标记chi03对人为掺杂珍汕97b的珍汕97a种子的鉴别人为掺入珍汕97b种子的珍汕97a混合样品于播种移栽后15天分单株(挂牌)提取总dna，用scar标记chi03对混合样品各植株总dna进行扩增。根据目标条带的有无，确定4株是保持系(图3)。植株开花期镜检花粉，发现苗期被鉴定为保持系的植株，花粉被1％的碘-碘化钾染成深黑色，成熟期这些植株结实正常；而苗期被鉴定为不育系的植株，花粉粒形状不规则，不能被1％的碘-碘化钾染色，成熟期这些植株套袋结实率为0，自然结实率为0.1％。表明利用chi03鉴定的标记基因型鉴定结果和表型鉴定结果完全一致(图4)。因此，scar标记chi03可用于野败型细胞质雄性不育系和保持系的苗期鉴定。